劉敏，覃禮堂,2,*，莫凌云,2，梁延鵬,3，曾鴻鵠,2

1. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，桂林 541004 2. 桂林理工大學(xué)，廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科教結(jié)合科技創(chuàng)新基地，桂林 541004 3. 桂林理工大學(xué)，廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004

各類化學(xué)污染物一旦排入水體環(huán)境將不可避免地殘留其中，進(jìn)而引起水環(huán)境的污染[1]。唑類殺菌劑是一類具有抗真菌性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，被廣泛用作農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和人類真菌病的抗真菌藥物[2-3]。它們化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，容易在環(huán)境中積累，從而殘留在水體、食物、農(nóng)作物和土壤中[4-6]。唑類殺菌劑在水體中檢出頻率和檢出濃度較高，特別是三唑醇，檢出濃度達(dá)到幾十納克每升[7]，三唑酮在我國九龍江檢出濃度最高達(dá)到12 μg·L-1[8]，克霉唑和氯咪巴唑也同時在魚類中檢出[5]。唑類殺菌劑的大量使用不可避免地隨降雨和地表徑流進(jìn)入水體，從而對水生生物產(chǎn)生威脅[9]，進(jìn)一步影響人類及其他生物的健康[2]。

考慮到殺菌劑在生活和農(nóng)業(yè)實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用，需要進(jìn)行更多有關(guān)唑類殺菌劑對水生生物潛在毒性的研究，以充分評估其對水環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險[10]。研究表明，三唑醇和三唑酮能夠影響青蛙在水體中的活動，對超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)有不同程度的影響，對青蛙的肝臟組織和甲狀腺激素水平的影響也因性別存在差異[11]。同時，三唑酮對枝角類浮游動物種群表現(xiàn)出明顯的抑制作用[12]，低劑量長期暴露下對水生生物的繁殖能力造成一定的損傷[13]。水蚤(Daphniasimilis)、渦蟲(Dugesiajaponica)和多齒新米蝦(Neocaridinadenticulate)3種水生生物在克霉唑和氯咪巴唑的48 h暴露下，氯咪巴唑?qū)?種實(shí)驗(yàn)物種的急性毒性均>1 mg·L-1，克霉唑?qū)λ榈亩拘宰畲螅?8 h-LC50為0.08 mg·L-1[10]。因此，有必要開展唑類殺菌劑對水生生物的生態(tài)毒性研究。

綠藻作為水生生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者，在水生生態(tài)系統(tǒng)的氧氣生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用[14]。其中，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是單細(xì)胞綠藻，在水體中分布均勻，且繁殖速度快，易于培養(yǎng)，是一種理想的毒理學(xué)指示生物[15]。據(jù)報道，綠藻在農(nóng)藥刺激下能夠產(chǎn)生活性氧(ROS)[16]，ROS能通過抑制和干擾與光合過程及相關(guān)蛋白質(zhì)合成等抑制葉綠體代謝，干擾光合裝置的功能，最終影響細(xì)胞的生長[13]，同時激活細(xì)胞的抗氧化酶如SOD和CAT，以防止自由基在氧化應(yīng)激下對細(xì)胞產(chǎn)生損傷[14]。目前對綠藻的毒性研究大部分是采用標(biāo)準(zhǔn)的96 h綠藻急性微板毒性測試考察單一物質(zhì)的毒性效應(yīng)[17]，例如，采用微板毒性實(shí)驗(yàn)分析法系統(tǒng)測定三嗪類農(nóng)藥對蛋白核小球藻的毒性效應(yīng)[18]；曾莎莎等[19]在96 h的急性暴露下進(jìn)行了5種有機(jī)磷農(nóng)藥對蛋白核小球藻的毒性相互作用研究等，但是唑類殺菌劑對綠藻的致毒機(jī)理卻鮮有報道。

本文研究了4種唑類殺菌劑(三唑醇、三唑酮、克霉唑和氯咪巴唑)對蛋白核小球藻的急性毒性及其毒性機(jī)制。通過評估唑類殺菌劑對蛋白核小球藻生長率的影響，判斷其96 h急性毒性，并結(jié)合葉綠素和總蛋白(TP)含量、氧化損傷(ROS和丙二醛(MDA))、抗氧化損傷能力(SOD和CAT)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的生理生化指標(biāo)，揭示唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的致毒機(jī)理，為全面準(zhǔn)確評價唑類殺菌劑在環(huán)境中的潛在風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 目標(biāo)污染物及試劑

研究選取4種唑類殺菌劑為目標(biāo)污染物，三唑醇(CAS No. 55219-65-3)，純度為98.9%；三唑酮(CAS No. 43121-43-3)，純度為97.7%；克霉唑(CAS No. 23593-75-1)，純度為98.0%；氯咪巴唑(CAS No. 38083-17-9)，純度為98.0%。其中，三唑醇購自Dr. Ehrenstorfer GmbH，三唑酮和氯咪巴唑購自CATO Research Chemicals Inc.，克霉唑購自Toronto Research Chemicals。

TP定量試劑盒、CAT試劑盒、SOD試劑盒、微量MDA試劑盒、ROS試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。95%乙醇(分析純)和98%冰醋酸(分析純)購自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 受試生物及藻種培養(yǎng)

受試生物蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，其編號為[FACHB]-5，使用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[20]。

在無菌的超凈工作臺中將蛋白核小球藻純藻種轉(zhuǎn)移至裝有100 mL新鮮配制的BG11培養(yǎng)基的250 mL無菌錐形瓶內(nèi)，封好瓶口，放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 ℃，光照條件2 000～3 000 lx，光暗周期12 h∶12 h[21]。每天定時搖動3～4次，并隨機(jī)調(diào)換位置，每隔2～3 d接種一次，接種時間應(yīng)在藻類細(xì)胞代謝最旺盛時期(上午10:00—11:00左右)，至綠藻基本達(dá)到同步生長，取對數(shù)生長期的綠藻進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)前并在顯微鏡觀察試驗(yàn)藻液是否被污染[22]。

1.3 綠藻毒性測試

先將4種目標(biāo)污染物標(biāo)準(zhǔn)品分別用BG11培養(yǎng)基[20]溶解，配制成高濃度的儲備液，三唑醇、三唑酮、克霉唑和氯咪巴唑的儲備液的濃度分別為6.76E-05、6.81E-05、2.31E-05和2.73E-05 mol·L-1。實(shí)驗(yàn)時將儲備液按照0.5和0.2的稀釋因子逐級稀釋，得到一系列所需濃度的試驗(yàn)液。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上每種目標(biāo)污染物共設(shè)置7個實(shí)驗(yàn)組和1個對照組，每組設(shè)置3個平行。其次，在無菌條件下將處于對數(shù)生長期、初始密度約為4×105個cell·mL-1的蛋白核小球藻均勻藻液，分裝于250 mL的錐形瓶中，每瓶20 mL藻液。再次，向各錐形瓶中依次添加對應(yīng)劑量的目標(biāo)污染物并補(bǔ)培養(yǎng)基至總體積為100 mL。加入目標(biāo)污染物后，將蛋白核小球藻置于原培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每天定時搖動3～4次[22]，連續(xù)培養(yǎng)至96 h。每24 h在681 nm下用紫外可見分光光度計(中國上海元析儀器有限公司，UV-9000S)測定藻液吸光度OD681[16]。并計算不同濃度暴露后的生長抑制率，計算公式如下[23]：

I=1-(ODti-ODt0)/(OD0i-OD00)

(1)

式中：ODti為第i時刻污染物處理組藻液的OD值，OD0i為i時刻空白對照組藻液的OD值。

1.4 濃度-抑制率數(shù)據(jù)擬合

采用經(jīng)典的兩參數(shù)非線性函數(shù)Weibull(式(2))、Logit(式(3))和Hill(式(4))對濃度-抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性最小二乘擬合[24]，選擇確定系數(shù)(R2)最大或均方根誤差(RMSE)最小者為最優(yōu)擬合函數(shù)[25]。式(2)～(4)可以計算出不同濃度下所對應(yīng)的效應(yīng)值，同樣可以利用函數(shù)的反函數(shù)計算出不同效應(yīng)下所對應(yīng)的濃度[26]。

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(2)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(3)

E=(α×c)/(β+c)

(4)

式(2)和(3)中α、β是Weibull和Logit的位置與斜率參數(shù)，式(4)中α、β是Hill的最大效應(yīng)和EC50；式(2)、(3)和(4)中E為效應(yīng)，即污染物對綠藻的生長抑制率，c是單個污染物或混合物的濃度。

1.5 蛋白核小球藻生理生化指標(biāo)的測定。

1.5.1 TP含量、抗氧化酶活性和MDA含量的測定

蛋白核小球藻暴露96 h后，取30 mL均勻藻液，依次進(jìn)行冷凍離心洗滌，研磨破碎的步驟獲取粗酶液。將粗酶液作為待測樣品采用考馬斯亮藍(lán)法[27]、鉬酸銨法[28]、羥胺法[29]和硫代巴比妥酸(TBA)法[30-31]分別測定并計算TP、CAT、SOD和MDA的含量。根據(jù)公式(5)計算抑制率。

I=1-(cti/c0i)

(5)

式中：cti為第i時刻污染物處理組藻液各項(xiàng)生理指標(biāo)的濃度，c0i為i時刻空白對照組的藻液各項(xiàng)生理指標(biāo)的濃度。

1.5.2 ROS含量的測定

蛋白核小球藻暴露96 h后取5 mL均勻藻液，依次經(jīng)過冷凍離心洗滌、藻細(xì)胞染色、37 ℃避光孵育、洗滌過濾的步驟獲取待測藻液，用流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，524C CytoFLEX)檢測。上述具體方法參照南京建成生物工程研究所提供的方法以及Knauert和Knauer[32]采用的化學(xué)熒光法，并略有改進(jìn)。根據(jù)公式(5)計算其抑制率。

1.5.3 葉綠素含量的測定[33]

蛋白核小球藻暴露96 h后，取30 mL均勻藻液，依次通過冷凍離心、超聲破碎、95%乙醇提取和冷凍離心等步驟后取上清液，用紫外分光光度計(中國上海元析儀器有限公司，UV-9000S)在470、649和665 nm波長下進(jìn)行測定，計算公式如下：

Chla=13.59×OD665-6.88×OD649

(6)

Chlb=24.96×OD649-7.32×OD665

(7)

類胡蘿卜素= (1000×OD470-2.05×OD665-114.8×OD649)/245

(8)

1.5.4 細(xì)胞凋亡的測定

蛋白核小球藻暴露96 h后取5 mL均勻藻液，依次經(jīng)過冷凍離心、洗滌濃縮、Annexin V-FITC染色、避光孵育和碘化丙啶(PI)染色獲得染色藻液。過濾后用流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，524C CytoFLEX)檢測。以上所述的具體方法參照南京建成生物工程研究所提供的方法。根據(jù)式(5)計算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果(Results)

2.1 4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的96 h急性毒性

4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的96 h急性毒性的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)的線性函數(shù)擬合結(jié)果列于表1，其濃度-效應(yīng)曲線繪于圖1。由表1可知，Weibull、Logit或Hill函數(shù)能較好地擬合這4種目標(biāo)污染物對蛋白核小球藻96 h急性毒性的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，R2均>0.981，RMSE均<0.039。不同污染物對蛋白核小球藻的毒性大小不同，以半數(shù)效應(yīng)濃度的負(fù)對數(shù)(pEC50)評估毒性大小，4種目標(biāo)污染物96 h時毒性大小為：氯咪巴唑>克霉唑>三唑醇>三唑酮，其中克霉唑和氯咪巴唑的毒性明顯大于三唑醇和三唑酮。藻類對不同種污染物敏感程度差異很大，造成這種毒性差異的主要原因可能與污染物自身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān)[34]。

由圖1可知，4種目標(biāo)污染物對蛋白核小球藻的毒性效應(yīng)均表現(xiàn)為抑制作用，蛋白核小球藻的生長抑制率隨著污染物濃度的增大而增大。在96 h的暴露下，4種唑類殺菌劑中抑制率最大的為氯咪巴唑。

2.2 唑類殺菌劑對蛋白核小球藻細(xì)胞中葉綠素含量的影響

葉綠素作為光合系統(tǒng)的重要組成部分，不僅吸收光能，保證光合作用的穩(wěn)定運(yùn)行，而且能反映環(huán)境脅迫狀況，較好地反映藻類的生長發(fā)育狀況[35-36]。如圖2所示，蛋白核小球藻在4種唑類殺菌劑暴露96 h后，隨著污染物濃度的升高，葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)含量明顯降低，三者抑制率的變化趨勢與生長抑制率的變化趨勢相似，呈現(xiàn)出良好的正相關(guān)(P<0.01)，表明唑類殺菌劑對蛋白核小球藻葉綠素的合成具有濃度依賴毒性。如圖2(b)所示，三唑酮在低濃度下對蛋白核小球藻葉綠素的合成有促進(jìn)作用，抑制率分別為-9.08%、-9.86%和-8.95%。這可能是蛋白核小球藻在環(huán)境脅迫下做出的一種自我保護(hù)的反應(yīng)。值得注意的是，如圖2(c)和2(d)所示，克霉唑和氯咪巴唑能夠顯著降低藻類的葉綠素含量，但是隨著暴露濃度的增加，對Chla和Chlb的抑制作用均沒有明顯的增加，這與TP含量的變化情況相似。這可能是因?yàn)槿~綠素在植物體中大多與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，蛋白質(zhì)受到破壞必定會對葉綠素產(chǎn)生影響，兩者息息相關(guān)[16]。

圖1 4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻96 h的 生長抑制率曲線Fig. 1 Growth inhibition of Chlorella pyrenoidosa for 96 h exposure to four azole fungicides

表1 4種唑類殺菌劑對蛋白核小球藻96 h的濃度-效應(yīng)曲線擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of concentration-effect curve of four single azole fungicides on Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

圖2 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)含量的影響Fig. 2 Effects of four azole fungicides on the chlorophyll a (Chl a)、chlorophyll b (Chl b) and carotenoid (Car) content of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

2.3 唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的氧化損傷

2.3.1 對TP含量的影響

唑類殺菌劑對蛋白核小球藻TP含量的影響如圖4所示。在4種唑類殺菌劑的作用下，蛋白核小球藻的TP含量表現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，即隨著污染物濃度的升高，TP含量的抑制率也隨之升高，而且TP含量與污染物的濃度呈現(xiàn)良好的正相關(guān)(P<0.01)。其中，克霉唑?qū)Φ鞍缀诵∏蛟宓腡P含量的影響存在著“低促高抑”的現(xiàn)象，最低濃度的促進(jìn)作用達(dá)到28.6%。根據(jù)藻細(xì)胞的生長抑制率和TP含量變化的結(jié)果，蛋白核小球藻的氧化應(yīng)激隨污染物濃度的增加明顯增強(qiáng)。

圖3 毒性機(jī)理圖Fig. 3 Toxicity mechanism diagram

圖4 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻生長和總蛋白(TP)含量的影響Fig. 4 Effects of four azole fungicides on the growth and total protein (TP) content of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

2.3.2 蛋白核小球藻對唑類殺菌劑的氧化應(yīng)激反應(yīng)

MDA的含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞的損傷程度[39]。由圖5可知，蛋白核小球藻暴露于4種唑類殺菌劑96 h后，MDA的含量均隨著污染物濃度的升高而升高。但是在低濃度下，MDA的產(chǎn)生受到抑制，這可能與ROS的產(chǎn)生受到抑制有關(guān)系。高濃度的污染物暴露下，MDA大量產(chǎn)生，尤其是三唑醇和氯咪巴唑2種污染物對MDA產(chǎn)生的促進(jìn)作用分別達(dá)到131.98%和136.34%。這與最近的一些研究結(jié)果相似[43]，蛋白核小球藻細(xì)胞中MDA的大量產(chǎn)生表明機(jī)體在唑類殺菌劑的刺激下產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖5 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 5 Effects of four azole fungicides on the reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) content of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

CAT是生物體內(nèi)另一種抗氧化酶，是防止細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的第二道防線，CAT可以將H2O2還原為H2O和O2[41]。由圖6可知，隨著污染物濃度的升高，促進(jìn)了CAT的產(chǎn)生，尤其是三唑醇、三唑酮和氯咪巴唑?qū)AT產(chǎn)生的促進(jìn)作用明顯，大小順序?yàn)槁冗浒瓦?三唑醇>三唑酮。但在氯咪巴唑高濃度作用下，CAT的促進(jìn)作用逐漸減小，這可能與ROS產(chǎn)生受到的抑制變大有關(guān)。在中低濃度作用下，克霉唑?qū)Φ鞍缀诵∏蛟寮?xì)胞的CAT產(chǎn)生有抑制作用，但隨著污染物濃度的升高，抑制作用降低，在最高濃度時出現(xiàn)促進(jìn)。這可能因?yàn)樵谖廴疚锎碳は翿OS大量產(chǎn)生從而激發(fā)CAT合成酶的活性。

2.4 唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的凋亡損傷

如圖7所示，經(jīng)過4種唑類殺菌劑處理96 h后，蛋白核小球藻出現(xiàn)不同程度的凋亡，而且隨著污染物濃度的升高，毒性越大，細(xì)胞凋亡的程度越嚴(yán)重。這說明，唑類殺菌劑能夠誘導(dǎo)蛋白核小球藻的凋亡，而且呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。由細(xì)胞凋亡率曲線可知，4種污染物的毒性大小為三唑醇>克霉唑>氯咪巴唑>三唑酮。

3 討論(Discussion)

唑類殺菌劑的高穩(wěn)定性使其在環(huán)境中長期暴露，這對水生生物及人體健康造成了潛在的威脅。本研究根據(jù)唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的96 h急性毒性，進(jìn)一步揭示了不同污染物對蛋白核小球藻的致毒機(jī)理。4種唑類殺菌劑在96 h暴露下對蛋白核小球藻的毒性大小存在差異，根據(jù)生長抑制率曲線擬合得到的pEC50，判斷其毒性大小為：氯咪巴唑>克霉唑>三唑醇>三唑酮。同時，本實(shí)驗(yàn)還通過檢測細(xì)胞凋亡來判斷唑類殺菌劑對蛋白核小球藻的急性毒性，其毒性大小為：三唑醇>克霉唑>氯咪巴唑>三唑酮。產(chǎn)生這種差異的原因可能與綠藻細(xì)胞的“休眠”有關(guān)，即綠藻細(xì)胞受到污染物刺激時形成的一種自我保護(hù)機(jī)制[46-47]。休眠狀態(tài)下，綠藻細(xì)胞是完整的，只是將各種機(jī)能消耗降到最低，而PI染料可以染色喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，無法染色保持了完整細(xì)胞膜的綠藻細(xì)胞。因此，相較于分光光度法，采用細(xì)胞凋亡檢測方法判斷蛋白核小球藻的細(xì)胞活性更加準(zhǔn)確。

圖6 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig. 6 Effects of four azole fungicides on the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

圖7 4種唑類殺菌劑暴露96 h對蛋白核小球藻細(xì)胞凋亡的影響Fig. 7 Effects of four azole fungicides on the cell apoptosis of Chlorella pyrenoidosa after 96 h exposure

通過研究蛋白核小球藻對唑類殺菌劑的氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，不同污染物對同一生物氧化抗氧化系統(tǒng)的影響不同。4種唑類殺菌劑在低濃度暴露下，ROS、CAT、SOD和MDA的產(chǎn)生均呈現(xiàn)不明顯的抑制狀態(tài)，說明在低濃度下，蛋白核小球藻可能通過其他的機(jī)制來耐受污染物，或者由于產(chǎn)生的ROS量過低，不能影響綠藻的正常代謝，不足以刺激抗氧化系統(tǒng)來清除ROS[48]。但是隨著污染物濃度的升高，ROS的含量、MDA的含量以及抗氧化酶SOD和CAT的活性均出現(xiàn)了不同程度的促進(jìn)或者抑制作用。在氯咪巴唑的暴露下，隨污染物濃度的升高，ROS產(chǎn)生的抑制率先降低后升高，這可能是因?yàn)殡S污染物濃度的升高，ROS積累量增加，促進(jìn)了MDA的大量產(chǎn)生，從而放大了ROS的作用，促進(jìn)了抗氧化酶SOD和CAT的合成，加速了ROS的清除。當(dāng)三唑醇、三唑酮和克霉唑作用于蛋白核小球藻時，污染物濃度的升高促進(jìn)了ROS和MDA的大量產(chǎn)生，從而激發(fā)機(jī)體的抗氧化機(jī)制，SOD和CAT的活性增強(qiáng)，以清除多余的ROS。而隨著三唑醇和克霉唑濃度的增加，SOD的產(chǎn)生受到抑制，抑制率與三唑醇和克霉唑的濃度正相關(guān)，這與郭慶亮[49]的研究結(jié)果相似。這可能是因?yàn)樵诟邼舛缺┞断耂OD合成酶的活性并不能被成功激活，從而導(dǎo)致SOD的產(chǎn)生受到抑制。

蛋白質(zhì)不僅是構(gòu)成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)材料和各種反應(yīng)進(jìn)行的催化劑，也是植物體代謝變化的重要指標(biāo)[35]。研究發(fā)現(xiàn)，4種唑類殺菌劑的暴露濃度越高，TP產(chǎn)生的抑制率升高，即TP含量降低。蛋白核小球藻對污染物的耐受能力有限，隨著污染物濃度的升高，代謝能力降低，蛋白質(zhì)分解，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量降低。這種情況的產(chǎn)生與葉綠素含量的降低密切相關(guān)，葉綠體中光合作用產(chǎn)生的能量和有機(jī)物是植物體正常進(jìn)行各種代謝活動的重要保證[31]。本研究也證明，隨著污染物濃度的升高，產(chǎn)生了對Chla、Chlb和Car的抑制。其中，Chla是主要的光合色素，Chlb是植物體普遍存在的輔助色素[50]，2種光合色素含量的降低必定會阻礙光合作用的正常進(jìn)行。在植物體中，Car的積累和固定發(fā)生在葉綠體中，負(fù)責(zé)吸收光能傳遞給葉綠素，推動光化學(xué)過程。同時，Car還與葉綠素的結(jié)合蛋白有關(guān)，它的降低同樣對蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生影響[51]。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了單一污染物對綠藻的急性毒性及其致毒機(jī)理的研究，然而環(huán)境中的農(nóng)藥是以各種形式和濃度共存，形成復(fù)雜的混合物并產(chǎn)生聯(lián)合毒性[52]。因此，未來需要關(guān)注環(huán)境濃度下的唑類殺菌劑與其他污染物對藻類的聯(lián)合毒性效應(yīng)，并揭示其毒性機(jī)制，這將會對地表水體中唑類殺菌劑的生態(tài)風(fēng)險評價及防治提供重要的依據(jù)。