田永靜，孫甜甜，皮宇松，孫康，郝雙玲

1. 蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蘇州 215009 2. 蘇州同科工程咨詢有限公司，蘇州 215009 3. 濟南市市政工程設(shè)計研究院(集團)有限責(zé)任公司徐州分公司，徐州 221000

由于社會經(jīng)濟快速發(fā)展和城市擴張，大量重金屬由于人為活動輸入環(huán)境水體，許多發(fā)展中國家的水環(huán)境受到威脅[1]。水環(huán)境中的重金屬不僅會對水生生物造成直接的負面效應(yīng)，同時可在微生物作用下轉(zhuǎn)化為毒性更高的重金屬形態(tài)，沿著食物鏈進行富集、放大[2]，最終對人類健康帶來潛在的威脅[3]。在中國近20年各種重金屬的年產(chǎn)量中，鋅居于首位，鋅的高產(chǎn)量和高消費量導(dǎo)致水環(huán)境中鋅的高暴露量[4]。鋅是浮游植物生長所必需的營養(yǎng)元素，在水環(huán)境中通常以二價離子的形式存在。此外，鋅是碳酸酐酶、超氧化物歧化酶和RNA聚合酶等機體酶的輔基。然而環(huán)境中鋅含量過高時，就會導(dǎo)致水生生物產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，細胞形態(tài)發(fā)生變化，生長受到抑制，甚至死亡[5]。此外，隨著環(huán)境分析技術(shù)的發(fā)展，雙酚A(bisphenol A, BPA)由于檢出頻率高且檢測濃度高引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為當(dāng)前生態(tài)環(huán)境中重要的內(nèi)分泌干擾物(endocrine disturbing chemicals, EDCs)之一[6-8]。EDCs是一類重要的化學(xué)物質(zhì)，它通過干擾內(nèi)源激素的合成、釋放、運輸、結(jié)合代謝，在極低濃度下模擬或阻斷動物體和人體的內(nèi)分泌功能及其他生理過程[9]。大量動物試驗數(shù)據(jù)[8,10-12]。表明BPA具有雌激素作用，低濃度攝取就會對生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)造成損害，因此許多國家開始禁止BPA用于嬰幼兒奶瓶。然而，BPA在其他產(chǎn)品中的廣泛和不受管制的使用，導(dǎo)致仍有大量BPA通過生產(chǎn)制造過程中的直接排放、城市污水的排放和工業(yè)制成品的溶出等方式進入環(huán)境[13]。由于生物體無法將重金屬和環(huán)境激素完全吸收，加之傳統(tǒng)的常規(guī)廢水處理工藝也無法將其徹底去除，導(dǎo)致水環(huán)境中往往存在重金屬與環(huán)境激素以不同形式及濃度組成的復(fù)雜體系，產(chǎn)生的復(fù)合效應(yīng)對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成潛在威脅。

本文以普通小球藻為受試生物，開展重金屬鋅與環(huán)境激素BPA單一及復(fù)合暴露對普通小球藻急性毒性、葉綠素含量及生理生化過程的影響，為重金屬、環(huán)境激素類污染物生物毒性和復(fù)合污染的生態(tài)風(fēng)險評價和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料及培養(yǎng)條件

實驗用無砷鋅粒為銀灰色金屬顆粒，粒徑為20～30目，購自上海美興化工股份有限公司。BPA分子式為C15H16O2，純度>99.8%，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。普通小球藻(Chlorellavulgaris)編號FACHB-8，由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供，采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照條件1 000～2 000 lx，時間設(shè)置12 h晝/12 h夜，每天按時搖動3次，并調(diào)換各錐形瓶在培養(yǎng)箱中位置，以保證CO2的充分交換、藻細胞懸浮生長及受光均勻。

1.2 實驗設(shè)計及方法

1.2.1 鋅及BPA對小球藻的毒性試驗

為準(zhǔn)確研究鋅含量對普通小球藻生長及生理指標(biāo)的影響，毒性試驗中所用BG11營養(yǎng)液均不含原有成分ZnSO4·7H2O。鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法為溶于適量0.2 mol·L-1的HCl溶液，攪拌至完全溶解后移入容量瓶中，并以滅菌后BG11營養(yǎng)液稀釋至標(biāo)線；BPA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法為溶于適量0.2 mol·L-1的NaOH溶液，后續(xù)操作與鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法相同。

將普通小球藻擴培至對數(shù)生長期，并接種至BG11培養(yǎng)基中，試驗初始藻細胞密度約1.0×106個·mL-1。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置鋅、BPA單一暴露濃度如表1所示。聯(lián)合毒性試驗是根據(jù)單一毒性試驗結(jié)果，以鋅和BPA對小球藻急性毒性7 d-EC50值為一個毒性單位，采用等毒性配比法(毒性1∶1)，將鋅與BPA按一定的混合比例以等對數(shù)間距設(shè)置7個不同的試驗濃度。每組3個平行，同時設(shè)空白對照組。

在0、1、2、3、4、5和7 d時取樣，測定不同濃度鋅、BPA單一及復(fù)合暴露條件下微藻的光密度值及葉綠素含量。小球藻在污染物溶液中暴露接觸7 d后，進行可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的測定。

1.2.2 藻密度和葉綠素含量的測定

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的普通小球藻稀釋至不同倍數(shù)，使用血球計數(shù)板在顯微鏡下確定藻密度，同時采用紫外分光光度法，在波長685 nm條件下測定對應(yīng)的吸光度值，建立藻密度(y, 106cells·mL-1)與吸光度(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=30.68x-0.056(可決系數(shù)R2=0.998)。按設(shè)定時間取樣3 mL，測定685 nm波長下各暴露組藻液光密度值。

表1 鋅、雙酚A單一及復(fù)合暴露的試驗設(shè)計Table 1 Design of single and compound exposure groups of zinc and bisphenol A

通過浮游植物分類熒光儀PHYTO-PAM(澤泉科技有限公司)，按時測定微藻在污染物中暴露不同時間的葉綠素含量。

1.2.3 小球藻生理特性指標(biāo)的測定

在測定普通小球藻的可溶性蛋白含量、SOD活性及MDA含量前，需收集藻液并對藻細胞進行破碎，具體操作為：首先取25 mL藻液離心，溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，離心10 min；倒掉上清液后加入5 mL磷酸緩沖溶液，通過漩渦混勻器使藻液重懸浮；利用超聲波細胞粉碎機在冰浴條件下對藻細胞進行破碎，功率300 W，開5 s停15 s，總工作時間10 min，收集到的細胞破碎液用于SOD活性和MDA含量的測定；之后進行第2次離心，溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，離心10 min，獲取上清液用于小球藻可溶性蛋白含量的測定。

可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250染色法，以牛血清蛋白制作標(biāo)線；SOD活性采用羥胺法測定；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸(thibabituric acid, TBA)法測定。SOD活性和MDA含量的具體測定方法參照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次，通過Origin 9.1求出以比生長率為基礎(chǔ)的抑制率與污染物濃度的對數(shù)值之間的回歸方程，采用直線內(nèi)插法確定不同污染物的EC50值。采用相加指數(shù)法(AI)評價鋅與BPA的聯(lián)合作用類型，具體為：首先通過公式S=Am/Ai+Bm/Bi，求得聯(lián)合毒性S值(其中m和i分別代表污染物質(zhì)A和B的聯(lián)合毒性EC50與單一毒性EC50值)。若S≤1，則AI=1/S-1；若S>1，則AI=S×(-1)+1。用AI值判斷聯(lián)合毒性作用，當(dāng)AI=0時為毒性相加作用；AI<0時為拮抗作用；AI>0時為協(xié)同作用。實驗數(shù)據(jù)運用SPSS進行數(shù)據(jù)的分析與處理，采用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)分析不同濃度對小球藻生理影響的差異(*、**表示暴露組與空白對照組具有差異性，其中*代表P<0.05，**代表P<0.01)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 鋅與BPA對普通小球藻生長抑制的毒性作用

根據(jù)以上方法獲得鋅與BPA對普通小球藻的單一、復(fù)合暴露的濃度-效應(yīng)曲線(圖1)及EC50值(表2)。由表2可知，鋅和BPA對普通小球藻的EC50分別為5.10 mg·L-1和17.37 mg·L-1，即鋅離子對普通小球藻的生長抑制更為明顯，其毒性大于BPA。鋅和BPA復(fù)合暴露情況下的EC50值分別為0.96 mg·L-1和2.18 mg·L-1，相加指數(shù)法求得復(fù)合暴露對小球藻急性毒性的AI為2.187，由此判斷鋅-BPA對小球藻的聯(lián)合作用類型為協(xié)同作用。

2.2 鋅與BPA對普通小球藻葉綠素含量的影響

普通小球藻在不同鋅濃度單一暴露組中葉綠素含量變化如圖2(a)所示，小球藻在低質(zhì)量濃度(0.05 mg·L-1和0.25 mg·L-1)鋅暴露7 d后，葉綠素含量分別為(4.60±0.15)×103μg·L-1和(4.06±0.08)×103μg·L-1，均高于空白對照組，說明低濃度鋅可以促進小球藻生長過程及光合作用。在BPA單一暴露體系中(圖2(b))，不同BPA濃度下普通小球藻的葉綠素含量均隨時間的延長有不同程度的增長，但均低于空白對照組，且隨著BPA濃度增大，葉綠素含量的增長幅度逐漸下降。在鋅和BPA復(fù)合暴露體系中(圖2(c))，僅當(dāng)鋅和BPA質(zhì)量濃度組合低于(2.00+6.80) mg·L-1時，普通小球藻可保持較穩(wěn)定的增長趨勢；而當(dāng)鋅和BPA質(zhì)量濃度組合高于(4.00+13.60) mg·L-1，普通小球藻的葉綠素含量受到明顯的抑制作用，且暴露7 d后低于初始接種的葉綠素含量，對葉綠素含量的抑制率分別高達90.46%、97.56%、99.51%和99.76%。復(fù)合暴露體系對藻細胞葉綠素含量的高抑制性，在一定程度上支持了鋅與BPA復(fù)合暴露對普通小球藻的毒性效應(yīng)為協(xié)同作用的結(jié)論。

2.3 鋅與BPA對普通小球藻生理特性的影響

在本實驗中，各暴露組小球藻的可溶性蛋白含量相較于空白對照組都有明顯的提升。鋅、BPA對普通小球藻可溶性蛋白含量的影響如圖3所示，其中，鋅、BPA單一及復(fù)合暴露中普通小球藻的最高可溶性蛋白含量分別為對應(yīng)批次中空白對照組的25.56倍、15.62倍和25.51倍。

圖1 鋅與BPA對普通小球藻生長抑制率的劑量-效應(yīng)曲線注：(a)、(b)分別代表鋅與BPA單一及復(fù)合暴露體系。Fig. 1 The dose-effect curve of zinc and BPA on the growth inhibition ratio of Chlorella vulgarisNote: (a) and (b) respectively represent single and compound exposure systems of zinc and BPA.

表2 線性擬合模型參數(shù)、EC50值和聯(lián)合作用類型Table 2 Parameters of linear fitting model, the EC50 values and the joint action type

圖2 不同暴露條件下普通小球藻的葉綠素含量變化注：(a)、(b)、(c)分別代表鋅單一、BPA單一及兩者復(fù)合暴露體系；下同。Fig. 2 Changes of chlorophyll content in Chlorella vulgaris under different exposure conditionsNote: (a), (b), and (c) respectively represent single zinc, single BPA, and compound exposure systems of both; the same below.

普通小球藻經(jīng)不同污染物暴露7 d后，其細胞內(nèi)的SOD活性變化如圖4所示。較低質(zhì)量濃度暴露組(鋅：0.05 mg·L-1；BPA：1.00 mg·L-1；鋅+BPA：(0.50+1.70)、(1.00+3.40)和(2.00+6.80) mg·L-1)中，普通小球藻的SOD活性與空白對照組相比無明顯差異；而在3種高濃度暴露組(鋅：10.00 mg·L-1；BPA：30.00 mg·L-1；鋅+BPA：(8.00+27.20) mg·L-1)中的SOD峰值分別為對應(yīng)空白對照組的8.09倍、5.56倍和18.28倍。這表明鋅及BPA的存在使得小球藻受到污染脅迫，并誘導(dǎo)細胞通過提高SOD產(chǎn)量來清除體內(nèi)過量的氧自由基。

普通小球藻細胞內(nèi)MDA含量呈現(xiàn)出隨污染物濃度的提高而增加的趨勢(圖5)，其中最大濃度組的鋅、BPA單一及復(fù)合暴露體系(鋅：10.00 mg·L-1；BPA：30.00 mg·L-1；鋅+BPA：(32.00+108.80) mg·L-1)中MDA含量分別為空白對照組的2.43倍、2.51倍和3.83倍。鋅、BPA單一及復(fù)合暴露組中，除了第一個低質(zhì)量濃度組(鋅：0.05 mg·L-1；BPA：1.00 mg·L-1；鋅+BPA：(0.50+1.70) mg·L-1)外，普通小球藻的MDA含量均顯著高于空白對照組。

3 討論(Discussion)

在實際的生態(tài)環(huán)境中，污染物往往不是以簡單的單體形式存在，而是多種污染物混合存在的復(fù)雜體系[17]，復(fù)合污染構(gòu)成了對生態(tài)環(huán)境和人體健康的潛在威脅。王桂祥等[18]在研究環(huán)境濃度下抗生素對普通小球藻的毒性時發(fā)現(xiàn)，紅霉素、恩諾沙星及磺胺甲惡唑兩兩聯(lián)合時對小球藻均為協(xié)同作用；章小強等[19]在研究鎘與S-異丙甲草胺的聯(lián)合毒性時，發(fā)現(xiàn)2種污染物對斜生柵藻的聯(lián)合作用表現(xiàn)為低濃度協(xié)同，高濃度拮抗；莫凌云等[20]研究重金屬(鎳、鋅、鎘與鉻)及農(nóng)藥(敵敵畏與敵百蟲)混合物在不同濃度比的毒性相互作用，以費氏弧菌的發(fā)光抑制急性毒性為響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)4種重金屬與2種農(nóng)藥具有明顯的協(xié)同作用。若僅采用單一污染物進行毒性研究，可能會導(dǎo)致對該污染物在水環(huán)境中造成的毒性效應(yīng)判斷的不準(zhǔn)確[21]，所以，我們在對水環(huán)境污染狀況進行評判時，同時還要確定多種污染物的聯(lián)合效應(yīng)，為混合污染物的毒性作用研究提供更重要的參考數(shù)據(jù)[22-23]。在本實驗中，單一暴露體系的鋅和BPA對普通小球藻的EC50值分別為復(fù)合暴露體系的5.31倍和7.98倍，即鋅與BPA的聯(lián)合毒性顯著大于單一的鋅和BPA的毒性，并根據(jù)相加指數(shù)法計算得到2種污染物對普通小球藻的聯(lián)合作用為協(xié)同作用。這可能是由于金屬元素以自由離子存在時，不具備(或具備極微弱)生理活性，當(dāng)生物體對金屬離子進行生物積累時[24]，金屬離子與特定結(jié)構(gòu)的生物配體結(jié)合才可表現(xiàn)出生理活性，同時取代了生物大分子中的必需金屬，從而可能改變生物大分子的活性部位的構(gòu)象，導(dǎo)致生物體中毒[25]。當(dāng)重金屬與環(huán)境激素復(fù)合暴露時，BPA可能通過有機配體與鋅離子發(fā)生絡(luò)合或螯合作用，從而形成毒性更高化合物；同時，微生物對低濃度重金屬具有“毒物興奮效應(yīng)”，重金屬通過干擾微生物的內(nèi)穩(wěn)態(tài)、刺激微生物分泌更多的胞外物質(zhì)等促進微生物的生長和代謝[26]，這一過程將會對微生物降解和轉(zhuǎn)化BPA產(chǎn)生一定影響。

圖3 鋅、BPA對藻細胞可溶性蛋白含量的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 3 Effects of zinc and BPA on soluble protein content of algaeNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

圖4 鋅、BPA對藻細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 4 Effects of zinc and BPA on superoxide dismutase (SOD) activity of algaeNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

圖5 鋅、BPA對藻細胞丙二醛(MDA)含量的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 5 Effects of zinc and BPA on malondialdehyde (MDA) content of algaeNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

光合作用是植物體內(nèi)最重要的生命活動，可為植物的生命活動提供物質(zhì)與能量[27]，葉綠素是各種浮游藻類中廣泛存在的色素，其含量能客觀反映植物的生長情況和光合作用水平[9]。有研究表明，在高硝酸鹽和低葉綠素(high nitrate and low chlorophyll, HNLC)條件下，功能性營養(yǎng)物質(zhì)(特別是鐵和鋅)易造成海洋中藻類爆發(fā)[28-29]。HNLC理論也可以用來解釋鋅在城市水系中引起的水華現(xiàn)象[30]。這一現(xiàn)象一定程度上證明低濃度的鋅會促進藻類生長，從而葉綠素含量增加。而在較高質(zhì)量濃度(1.00、5.00和10.00 mg·L-1)下葉綠素含量受到明顯抑制，說明攝入過高濃度的鋅則會降低水生生物的生長速度、破壞其光合系統(tǒng)，這與已有研究結(jié)果一致[31-32]。Xiang等[9]通過研究BPA對擬柱胞藻和四尾柵藻葉綠素影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BPA質(zhì)量濃度為1.00、5.00和10.00 mg·L-1時，擬柱胞藻的葉綠素濃度下降了39.56%、47.00%和74.51%，而在四尾柵藻中則下降了45.39%、67.80%和82.59%。在本實驗中，經(jīng)同樣質(zhì)量濃度的BPA(1.00、5.00和10.00 mg·L-1)暴露7 d后，3組普通小球藻葉綠素含量與空白對照組相比分別下降了15.29%、45.86%和55.96%。雖然不同的藻類對BPA的敏感度不同，但已有數(shù)據(jù)表明BPA對普通小球藻的光合反應(yīng)具有抑制效果，抑制葉綠素的合成。

在外界脅迫條件下，植物細胞通過改變體內(nèi)有機物含量來提高細胞耐受程度，增強蛋白質(zhì)合成代謝，參與滲透調(diào)節(jié)，從而適應(yīng)逆境[33-34]。因此可通過測定普通小球藻體內(nèi)可溶性蛋白含量來判斷鋅及BPA對其的毒性效應(yīng)。在本實驗復(fù)合暴露組中，當(dāng)鋅與BPA質(zhì)量濃度高于(8.00+27.20) mg·L-1，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，說明鋅與BPA的聯(lián)合毒性阻礙了普通小球藻的正常生長代謝。這可能是藻細胞無法抵抗外界脅迫，污染物促進了蛋白水解酶的活性，從而加快蛋白質(zhì)的水解；同時，由于污染物的毒害作用，使合成蛋白質(zhì)的相關(guān)細胞器受到損傷而抑制可溶性蛋白的合成[35]。

此外，植物在經(jīng)受脅迫的同時，體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基增多，生物體依靠體內(nèi)抗氧化酶對氧自由基清除，從而保持機體氧化平衡[36]。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成H2O2和O2[37]。同時，過多的氧自由基將攻擊藻細胞膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)或加劇脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物[18,38]。MDA作為膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，其含量變化可反映機體細胞損傷程度。在本研究中，當(dāng)鋅與BPA的質(zhì)量濃度為(4.00+13.60) mg·L-1時，SOD活性大幅提升，并在質(zhì)量濃度為(8.00+27.20) mg·L-1時達到最高值后呈下降趨勢，其對應(yīng)的MDA含量也于(4.00+13.60) mg·L-1暴露組大幅提升。這表明從(8.00+27.20) mg·L-1暴露組開始，普通小球藻細胞產(chǎn)生的SOD不足以抵抗污染物引起的氧化脅迫，抗氧化酶的清除速率低于氧自由基的產(chǎn)生速率，從而導(dǎo)致氧化損傷。

本文研究鋅與BPA單一及復(fù)合暴露條件下對普通小球藻的生長及生理指標(biāo)的影響，為重金屬與環(huán)境激素類的復(fù)合效應(yīng)研究提供一定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。然而，2種混合污染物對水環(huán)境的毒性作用機理的研究尚未闡明，今后的研究應(yīng)重點考慮到復(fù)合污染物間的互相作用以及微生物對污染物的轉(zhuǎn)化問題。