甘俊英，孫左義，秦建新，原海亮，李強(qiáng)，薛玉英,*

1. 環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 210000 2. 馬鞍山市疾病預(yù)防控制中心，馬鞍山 243000 3. 蘇州匯涵醫(yī)用科技發(fā)展有限公司，常熟 215500 4. 常熟市市場監(jiān)督管理局，常熟 215500

隨著環(huán)境中污染物的增加，大氣層破壞導(dǎo)致紫外線輻射對人類健康的損傷十分嚴(yán)重，超氧化物侵襲超過機(jī)體耐受程度，最終出現(xiàn)炎癥、衰老及代謝調(diào)節(jié)功能的紊亂，甚至誘發(fā)基因突變和癌癥[1]。對抗氧化和由脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起的疾病研究，已成為人類對健康的新追求[2]。中波紫外線(ultraviolet B, UVB)是造成皮膚損傷的主要光譜，其引起的皮膚光損傷主要通過氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡及細(xì)胞氧化損傷，從而引起皮膚光老化，誘發(fā)皮膚癌[3]，多年來，研究者們致力于尋求一種天然無毒的防曬修復(fù)劑。

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類分子量較低、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合性蛋白，在生物體內(nèi)分布廣泛[4]，其具有的清除自由基功能，可有效降低機(jī)體氧化損傷水平[5]，提示MT可用來預(yù)防和治療UVB輻射造成的光氧化損傷。但內(nèi)源性MT的抗氧化損傷作用有限，隨著氧化損傷的積累，超過機(jī)體耐受臨界值之后，MT應(yīng)答效應(yīng)逐漸減弱，因此研究者們開始關(guān)注外源性補(bǔ)充MT的抗氧化損傷作用研究。

MT可從動植物組織中提取[6-8]，但由于來源不足、純度不高等原因，在一定程度上阻礙了MT的發(fā)展，相對于這種方法，基因工程制備的MT[9]純度高，性能更加穩(wěn)定，使人源MT走向商品化成為可能。本試驗(yàn)用重組人金屬硫蛋白Ⅲα短肽(recombinant human metallothionein Ⅲα, rh-MT-Ⅲα)，由蘇州匯涵醫(yī)用科技發(fā)展有限公司利用基因工程制備，與完整MT比較，具有分子量更低，更易被吸收特點(diǎn)。這種rh-MT-Ⅲα在基因序列上與動植物中提純的MT相比具有更高生物相容性，與內(nèi)源性完整MTα域在結(jié)構(gòu)和巰基含量基本一致。由于rh-MT-Ⅲα屬于新物質(zhì)，目前尚未有其毒性評價及功能相關(guān)研究，若能較完整地闡述和確證外源性補(bǔ)充這種新rh-MT-Ⅲα的安全性及抗氧化功能，將有望替代化學(xué)防曬劑。

在前期研究rh-MT-Ⅲα對細(xì)胞及線蟲的毒性效應(yīng)的基礎(chǔ)上[10]，利用體外化學(xué)共浴方法研究rh-MT-Ⅲα對自由基清除功能并計(jì)算出IC50(rh-MT-Ⅲα對自由基清除率達(dá)50%時所需的濃度)，同時建立UVB損傷細(xì)胞模型，選用人類皮膚毒性評價常用模型HaCaT細(xì)胞，經(jīng)UVB損傷處理后，加入不同濃度rh-MT-Ⅲα繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從細(xì)胞水平上初步研究rh-MT-Ⅲα的抗光氧化損傷作用，為其作為化學(xué)防曬替代提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑儀器與細(xì)胞來源

1.1.1 材料與試劑

rh-MT-Ⅲα由蘇州匯涵醫(yī)用科技發(fā)展有限公司提供，商品名為重組人巰基短肽，利用大腸桿菌基因工程高密度發(fā)酵并純化獲得的人源金屬硫蛋白Ⅲα亞基片段，分子量3.7 kD，每分子蛋白含游離巰基6個，蛋白SDS-PAGE純度≥98%。

DMEM高糖培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(博士德生物工程有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)，活性氧試劑盒(碧云天生物公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(美國BD公司)，分析純無水乙醇(南京晚晴生物有限公司)，1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)(合肥博美生物科技有限公司)。

1.1.2 主要儀器

3423型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；Biobase生物安全柜(中國博科控股集團(tuán)有限公司)，F(xiàn)SX型生物圖像導(dǎo)航儀(日本Olympus公司)，5424R型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Epoch型酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)；MVS-1型渦旋混合器(北京金紫光科技發(fā)展有限公司)；5424R型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；BS-210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；MilliQ Advantage型超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)；UV1780紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；UVB燈管(313 nm模擬太陽光老化，購自北京中儀商城)；FV3000激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HaCaT細(xì)胞是非腫瘤來源的人正常皮膚永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株，與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞分化特性相似，可以繁殖150代以上。HaCaT細(xì)胞購自上海名勁生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

染毒液配制：使用超純水配制不同濃度rh-MT-Ⅲα溶液(25、50、100、200和400 μg·mL-1)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

80 μg·mL-1DPPH溶液配制：稱取DPPH粉末10 mg，加入無水乙醇定容至125 mL，制得DPPH溶液備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)劑量與程序

體外自由基清除試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[11]并略作修改。向1.5 mL DPPH溶液中，分別加入1.5 mL不同濃度的rh-MT-Ⅲα溶液(25、50、100、200和400 μg·mL-1)，對照組加入同體積超純水，混勻，室溫避光靜置30 min后，利用紫外分光光度計(jì)在517 nm條件下測定吸光度值(OD)，每劑量組設(shè)3個平行。按公式計(jì)算自由基清除率(K)，K(%)=(1-Ax/A0)×100%，式中：Ax為樣品測定管OD值，A0為空白測定管OD值。計(jì)算IC50以評價rh-MT-Ⅲα體外清除自由基能力。

UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建：將UVB燈管垂直置于UVB照度計(jì)上方，調(diào)整燈管高度至輻照強(qiáng)度為100 μW·cm-2，固定燈管。選取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HaCaT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮液濃度為1×105個·mL-1，分別接種于96孔板(每孔0.2 mL)中，每組設(shè)3個平行，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入200 μL PBS覆蓋，置于UVB燈管正下方分別處理1、2、3、4和5 min，完全培養(yǎng)基為空白對照，含細(xì)胞避光處理組(錫箔紙蓋住)為陰性對照。處理結(jié)束后，緩慢吸去PBS，加入完全培養(yǎng)基200 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，依據(jù)MTT法檢測各組細(xì)胞存活率，依據(jù)細(xì)胞存活率來確定UVB模型輻照劑量。細(xì)胞存活率(%)=[(Ax-Ak)/A0]×100%，式中：Ax為各UVB處理組吸光度值，Ak為空白對照組吸光度值，A0為避光對照組吸光度值。

建立的UVB模型：依據(jù)前期rh-MT-Ⅲα細(xì)胞毒性結(jié)果，在400 μg·mL-1劑量時，乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rh-MT-Ⅲα對HaCaT細(xì)胞膜造成了明顯的損傷，低于此劑量時未觀察到明顯毒性。選用不同濃度(25、50、100和200 μg·mL-1)rh-MT-Ⅲα處理經(jīng)UVB輻照的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，從細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞內(nèi)ROS含量各指標(biāo)與避光對照組和單一UVB處理組進(jìn)行比較，評價rh-MT-Ⅲα在細(xì)胞水平上的抗氧化損傷作用。

細(xì)胞內(nèi)ROS觀察：(1)激光共聚焦顯微鏡觀察ROS。處理結(jié)束后，棄去原培養(yǎng)液，PBS緩慢清洗2遍。按照活性氧檢測試劑盒說明書，用無血清的DMEM培養(yǎng)液將DCFH-DA探針按1∶1 000比例稀釋，混勻后加入到激光共聚焦小皿中，每孔0.5 mL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)處理20 min。孵育結(jié)束后，將探針液吸出，用不含血清的培養(yǎng)液洗2遍，再用PBS洗2遍，最后向每孔加入1 mL PBS，放置生物導(dǎo)航儀下觀察并拍照。

(2)流式細(xì)胞儀檢測ROS。染毒結(jié)束后，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，1 000 rmin-1離心5 min。離心結(jié)束后，棄上清，加入1 mL PBS，緩慢吹打混勻，1 000 rmin-1離心5 min，離心后，重復(fù)PBS清洗一次。按照活性氧檢測試劑盒說明書，用無血清的DMEM培養(yǎng)液將DCFH-DA探針按1∶1 000比例稀釋混勻，加入到含處理好細(xì)胞的1.5 mL離心管中，每管1 mL，混勻，37 ℃孵育20 min，期間每隔3 min顛倒混勻一下。孵育結(jié)束后，用PBS洗3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA探針，最后加入500 μL PBS懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀在Ex/Em=488 nm/525 nm波長下進(jìn)行檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組之間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。兩組之間比較，若符合方差齊性，則采用LSD-t檢驗(yàn)方法，若方差不齊，則采用Games-Howell檢驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean±SD表示，檢測水平為P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

利用SPSS軟件計(jì)算rh-MT-Ⅲα清除DPPH自由基的IC50。計(jì)算步驟參照文獻(xiàn)[12]：(1)建立SPSS數(shù)據(jù)集，包括劑量組、清除率和總數(shù)等；(2)按要求計(jì)算好的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入，總數(shù)均填100；(3)根據(jù)順序點(diǎn)擊，Analyze→Regression→Probit→將劑量組導(dǎo)入Covariates，清除率導(dǎo)入Response frequency，總數(shù)導(dǎo)入?yún)R總Total，Transform點(diǎn)擊選擇Log based 10→選擇Model Probit→OK，從而計(jì)算出IC50及其95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果(Results)

2.1 體外自由基清除率結(jié)果

DPPH是研究體外自由基清除的主要材料[13]，在乙醇中是一種穩(wěn)定的自由基，溶液呈紫色，于517 nm處顯示最大吸收峰。當(dāng)DPPH遇到質(zhì)子供體物質(zhì)，例如抗氧化劑，顏色從紫色變?yōu)辄S色，隨后吸光度降低[14]，由此可測定化學(xué)物質(zhì)的自由基清除能力。利用紫外分光光度計(jì)在517 nm測得吸光度值，按照1.2.2中的公式計(jì)算rh-MT-Ⅲα對DPPH清除率，結(jié)果如圖1所示，隨著rh-MT-Ⅲα劑量的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸增加，由SPSS軟件計(jì)算出rh-MT-Ⅲα對DPPH自由基的清除率達(dá)到50%時的濃度為184.23 μg·mL-1(P>0.05)，模型擬合度好。IC50的95%置信區(qū)間為151.00～230.90 μg·mL-1。

2.2 UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建

不同UVB輻照劑量對HaCaT細(xì)胞存活率影響測定結(jié)果如表1所示，隨著UVB輻照時間的增加，HaCaT細(xì)胞存活率降低，與避光對照組存活率相比，3、4和5 min處理組顯著降低(P<0.05)。考慮模型生物學(xué)意義，去除與避光對照組無差異的1 min和2 min(該輻照劑量下，細(xì)胞損傷不明顯)和細(xì)胞損傷過于嚴(yán)重的4 min和5 min (該輻照劑量下，細(xì)胞損傷大，一定程度上會弱化受試物的抗氧化作用，不利于觀察受試物真實(shí)的抗氧化能力)，選定模型UVB輻照時間為3 min，輻照強(qiáng)度為100 μW·cm-2。

2.3 rh-MT-Ⅲα對UVB致HaCaT細(xì)胞氧化損傷的抗氧化作用研究

2.3.1 細(xì)胞存活率

HaCaT細(xì)胞經(jīng)UVB處理后，利用不同濃度(25、50、100和200 μg·mL-1) rh-MT-Ⅲα繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，測得細(xì)胞存活率結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，與避光對照組相比，UVB處理后細(xì)胞存活率均有所下降，隨著rh-MT-Ⅲα濃度的升高，各UVB+rh-MT-Ⅲα處理細(xì)胞存活率呈現(xiàn)先增高后略有降低，在50 μg·mL-1和100 μg·mL-1劑量下與避光對照組無顯著差異。尤其在100 μg·mL-1時，細(xì)胞存活率較單一UVB處理組細(xì)胞存活率顯著升高。

圖1 重組人金屬硫蛋白Ⅲα短肽(rh-MT-Ⅲα)對 1,1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)自由基的清除率Fig. 1 The free radical scavenging rate on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) by recombinant human metallothionein Ⅲα peptide (rh-MT-Ⅲα)

表1 不同UVB輻照劑量對HaCaT細(xì)胞存活率 影響(mean±SD, n=3)Table 1 The effect of different dose of UVB on viability of HaCaT cells (mean±SD, n=3)

圖2 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT 細(xì)胞存活率的影響注：與避光對照組相比，*P<0.05；與單一UVB處理組相比， # P<0.05；-表示不含有，+表示含有。Fig. 2 The effect of rh-MT-Ⅲα on viability of HaCaT cells after exposed to the UVBNote: Compared with the negative control group, *indicates significant differences at P<0.05 level; compared with the single UVB group, # indicates significant differences at P<0.05 level; - means contained; + means not contain.

2.3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果

經(jīng)處理完成后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)UVB處理后，與避光對照組相比，單一UVB組細(xì)胞連接不緊密，細(xì)胞變圓，單個視野可見細(xì)胞數(shù)明顯減少。在25～100 μg·mL-1劑量下，隨著rh-MT-Ⅲα濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)較UVB組逐漸改善，細(xì)胞連接逐漸緊密，呈鋪路石狀，單個視野可見細(xì)胞數(shù)明顯增加，在100 μg·mL-1時尤為明顯。在高濃度時，這種改善作用有所降低。

2.3.3 細(xì)胞凋亡率

處理結(jié)束后，利用流式細(xì)胞儀檢測HaCaT細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖4和圖5所示，與避光對照組相比，UVB處理后細(xì)胞凋亡率均有所上升，隨著rh-MT-Ⅲα濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)先降低后略有升高趨勢。在100 μg·mL-1劑量下，細(xì)胞凋亡率較單一UVB處理組顯著降低(P<0.05)，與避光對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.4 活性氧檢測結(jié)果

激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)ROS的含量情況如圖6所示。與避光對照組相比，經(jīng)UVB處理后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加。與單一UVB處理相比，rh-MT-Ⅲα處理后細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱，在50 μg·mL-1及100 μg·mL-1劑量下細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著降低。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量結(jié)果如圖7和圖8所示，與避光對照組相比，單一UVB及UVB+rh-MT-Ⅲα(25 μg·mL-1和200 μg·mL-1)組細(xì)胞ROS含量顯著增加，UVB+rh-MT-Ⅲα(50 μg·mL-1和100 μg·mL-1)組細(xì)胞ROS略有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與單一UVB劑量組相比，除25 μg·mL-1劑量組外均顯著降低。UVB+rh-MT-Ⅲα處理組細(xì)胞ROS含量隨著rh-MT-Ⅲα劑量的增加，呈現(xiàn)先降低后略有升高的趨勢，且在100 μg·mL-1時顯著降低，恢復(fù)至正常水平。

圖3 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細(xì)胞形態(tài)的影響(400×)注：(a)避光對照組；(b)單一UVB處理組；(c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα。Fig. 3 Effect of rh-MT-Ⅲα on morphology of HaCaT cells after exposed to the UVBNote: (a) negative control group; (b) single UVB expose group; (c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα.

圖4 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響注：FITC/PI表示流式細(xì)胞儀熒光通道；(a)避光對照組；(b)單一UVB處理組；(c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα。Fig. 4 Effect of rh-MT-Ⅲα on atoposis of HaCaT cells after exposed to the UVBNote: FITC/PI represents flow cytometer fluorescence channel; (a) negative control group; (b) single UVB expose group; (c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα.

圖5 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后HaCaT細(xì)胞凋亡率影響注：與避光對照組相比，*P<0.05；與單一UVB處理組相比， # P<0.05；-表示不含有，+表示含有。Fig. 5 Effect of rh-MT-Ⅲα on atoposis of HaCaT cells after exposed to the UVBNote: Compared with the negative control group, *indicates significant differences at P<0.05 level; compared with the single UVB group, # indicates significant differences at P<0.05 level; - means contained; + means not contain.

3 討論(Discussion)

DPPH在實(shí)驗(yàn)體系中為穩(wěn)定自由基，其含有以氮為中心的吸電子基團(tuán)，體系呈紫色，在517 nm可見光下出現(xiàn)強(qiáng)烈吸收峰。向體系中加入受試物，如果受試物能夠清除DPPH，則吸光度值降低，表明其具有清除氧自由基作用，該實(shí)驗(yàn)方法簡捷、重復(fù)性好[15]。依照加入rh-MT-Ⅲα后體系吸光度的改變，可間接判斷rh-MT-Ⅲα是否具有清除自由基功能及其功能大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rh-MT-Ⅲα對DPPH自由基具有清除作用，其半數(shù)清除率濃度為184.23

圖6 rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細(xì)胞活性氧(ROS)含量的影響(400×)注：(a)避光對照組；(b)單一UVB處理組；(c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα。Fig. 6 Effect of rh-MT-Ⅲα on reactive oxygen species (ROS) content of HaCaT cells after exposed to the UVB (400×)Note: (a) negative control group; (b) single UVB expose group; (c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα.

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的HaCaT細(xì)胞ROS含量的影響注：FITC/Count為流式細(xì)胞儀熒光通道；(a)避光對照組；(b)單一UVB處理組；(c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα。Fig. 7 Effect of rh-MT-Ⅲα on ROS content of HaCaT cells after exposed to the UVB by flow cytometryNote: FITC/Count represents flow cytometer fluorescence channel; (a) negative control group; (b) single UVB expose group; (c)～(f) UVB+25～200 μg·mL-1 rh-MT-Ⅲα.

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后 HaCaT細(xì)胞ROS含量的定量影響注：與避光對照組相比，*P<0.05；與單一UVB處理組相比， # P<0.05；-表示不含有，+表示含有。Fig. 8 Effect of rh-MT-Ⅲα on ROS content of HaCaT cells after exposed to the UVB by flow cytometryNote: Compared with the negative control group, *indicates significant differences at P<0.05 level; compared with the single UVB group, # indicates significant differences at P<0.05 level; - means contained; + means not contain.

μg·mL-1。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果存在差異[16-17]，已有研究者采用鋅合金屬硫蛋白(Zn-MT)及酵母源金屬硫蛋白Ⅰ和Ⅱ，研究MT對DPPH自由基清除能力，并獲得IC50約為58 μg·mL-1，遠(yuǎn)低于184.23 μg·mL-1。金屬硫蛋白主要有4種異構(gòu)體，MT-Ⅰ、MT-Ⅱ主要分布于哺乳動物器官如肝、腎組織中，MT-Ⅲ主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，MT-Ⅳ主要在皮膚和胃腸道上部表達(dá)。本研究所用材料為人源大腸桿菌發(fā)酵所得的金屬硫蛋白Ⅲα短肽，分析研究結(jié)果相差較大的主要原因可能有兩方面：一是不同來源及不同亞型的MT在功能方面存在原始差異；二是完整MT包含α和β這2個結(jié)構(gòu)域，其巰基含量遠(yuǎn)大于只含α結(jié)構(gòu)域的MT短肽，從而造成其功能上的差異。不同制備方式及MT成品純度在一定程度上，也會對其功能產(chǎn)生影響。對于rh-MT-Ⅲα與不同亞型及來源的完整MT抗氧化能力的差異機(jī)制探索及比較，有待進(jìn)一步研究。

紫外線主要有3種波長范圍：長波紫外線(ultraviolet A, UVA)、UVB和短波紫外線(ultraviolet C, UVC)，波長為280～320 nm的中波紫外線是致人體皮膚光氧化損傷的主要光譜[18]。長期的紫外線輻射，尤其是中波紫外線還可引起皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞分泌一系列的炎癥因子，誘導(dǎo)各種皮膚病甚至是皮膚癌的發(fā)生[19-21]。體外自由基清除實(shí)驗(yàn)表明，rh-MT-Ⅲα具有較強(qiáng)的自由基清除能力，提示其可能存在抗UVB氧化損傷的作用。我們建立了以細(xì)胞為基礎(chǔ)，UVB為處理因素的評價rh-MT-Ⅲα抗氧化損傷功能的模型。結(jié)果表明，單一UVB(強(qiáng)度為100 μW·cm-2)處理HaCaT細(xì)胞后，隨著輻照時間的增加，細(xì)胞存活率隨之降低，表明細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，依據(jù)細(xì)胞存活結(jié)果及損傷修復(fù)生物學(xué)意義，選定輻照時間為3 min (59.39%±12.01%)，此劑量下既可以觀察到UVB對細(xì)胞的損傷，又可以減少過度損傷導(dǎo)致弱化rh-MT-Ⅲα抗氧化損傷的功能，使觀察結(jié)果更具可靠性。

UVB輻射使機(jī)體內(nèi)自由基含量增加，超出機(jī)體耐受范圍后產(chǎn)生氧化損傷，而氧化損傷的發(fā)生常伴有ROS含量的異常升高，如果ROS生成量超過機(jī)體的耐受水平，則會導(dǎo)致應(yīng)激損傷，破壞遺傳大分子及關(guān)鍵蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致衰老與疾病的發(fā)生[22]。ROS是細(xì)胞代謝不可避免的產(chǎn)物[23]，UVB輻照后可通過直接作用和間接作用產(chǎn)生大量的ROS。UVB模型處理的HaCaT細(xì)胞，再經(jīng)不同濃度(25、50、100和200 μg·mL-1)rh-MT-Ⅲα處理后，在25～100 μg·mL-1劑量下細(xì)胞存活率呈上升趨勢，且在100 μg·mL-1劑量下，細(xì)胞存活率顯著高于單一UVB染毒組。細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡和活性氧含量指標(biāo)與細(xì)胞存活率結(jié)果一致，均在100 μg·mL-1劑量下顯著改善，與單一UVB處理組細(xì)胞相比，100 μg·mL-1劑量組細(xì)胞連接更加緊密，細(xì)胞凋亡率及活性氧含量均顯著降低，這些結(jié)果表明，rh-MT-Ⅲα具有抗氧化損傷功能，且在100 μg·mL-1劑量下作用顯著，可使細(xì)胞恢復(fù)至正常水平。這種作用在高劑量下有所減弱，結(jié)合前期細(xì)胞毒性評價研究，考慮是隨著rh-MT-Ⅲα劑量的增加，其對細(xì)胞膜的損傷作用越來越明顯，在安全有效劑量(考慮在100～200 μg·mL-1)之間，但需要進(jìn)一步研究來確證)內(nèi)，其抗氧化作用隨著劑量的增加而增強(qiáng)，一旦超過安全劑量，rh-MT-Ⅲα對于細(xì)胞膜的損傷削弱了其抗氧化損傷作用，從而導(dǎo)致抗氧化損傷作用在高劑量時降低。ROS含量從側(cè)面反映了氧化損傷水平，未來需進(jìn)一步探討氧化損傷程度指標(biāo)，如丙二醛含量、谷胱甘肽含量以及抗氧化損傷基因的表達(dá)量等。

研究首先探索了不同濃度rh-MT-Ⅲα對DPPH自由基的體外清除能力，繼而通過構(gòu)建UVB損傷HaCaT細(xì)胞模型，研究不同濃度rh-MT-Ⅲα對UVB損傷后的細(xì)胞各生物學(xué)終點(diǎn)的影響，在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了rh-MT-Ⅲα抗氧化損傷功能，為天然防曬劑探索提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。