楊超 韋燕凱 魏瑞華 粘紅

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300384

自身免疫性葡萄膜炎是一類易復(fù)發(fā)、難治性眼內(nèi)炎性疾病，控制不當(dāng)可導(dǎo)致視力損傷，甚至致盲[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)小鼠是自身免疫性葡萄膜炎的經(jīng)典動(dòng)物模型，其與人類葡萄膜炎在臨床表現(xiàn)及分子機(jī)制上具有很大的相似性，在研究自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色[2]。目前研究認(rèn)為Th17細(xì)胞、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-23/IL-17通路是自身免疫性葡萄膜炎發(fā)生的重要機(jī)制[3-6]。Th17細(xì)胞分化依賴于抗原提呈細(xì)胞的刺激和微環(huán)境中細(xì)胞因子的調(diào)控，而樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)作為專職抗原提呈細(xì)胞，可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，同時(shí)分泌IL-6、IL-23和IL-1β等細(xì)胞因子，促進(jìn)Th17細(xì)胞的增生分化[7-8]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類約22個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以通過調(diào)控DCs影響Th17細(xì)胞的反應(yīng)[10-12]。miR-338-3p是一種高度保守的miRNA，具有免疫調(diào)控作用[13-15]。然而，miR-338-3p對(duì)Th17細(xì)胞的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。本課題組前期研究結(jié)果顯示，miR-338-3p在EAU小鼠脾臟細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步分析GSE144081數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在DCs中的表達(dá)豐度明顯高于CD4+T細(xì)胞。因此，本研究擬探討骨髓來源DCs(bone marrow-derived DCs，BMDCs)中miR-338-3p對(duì)EAU IRBP1-20特異性Th17細(xì)胞活化的影響以及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8～10周齡健康雌性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量(20.1±1.3)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)前排除眼部疾病及其他異常。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及操作符合國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定，并獲得天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理及使用委員會(huì)的批準(zhǔn)(批文號(hào)：TJYY2019110117)。

1.1.2主要試劑及儀器 miR-338-3p擬似物、擬似物陰性對(duì)照、miR-338-3p 抑制劑、抑制劑陰性對(duì)照(上海吉瑪生物科技有限公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、重組小鼠細(xì)胞因子IL-4、重組小鼠細(xì)胞因子IL-23和小鼠IL-17 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；IRBP1-20多肽片段、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(上海生物工程股份有限公司)；結(jié)核分枝桿菌H37RA(美國Difco公司)；弗氏不完全佐劑(incomplete Freund adjuvant，IFA)、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、布雷菲爾得菌素A(brefeldin A，BFA)、鈣離子霉素(美國Sigma公司)；固定劑、破膜劑、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的大鼠抗小鼠IL-17流式抗體(FITC-IL-17)、巰基化藻紅蛋白(sulfhydryl phycoerythrin，PE)標(biāo)記的大鼠抗小鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)流式抗體(PE-IFN-γ)(美國Biolegend公司)；Lipofectamine 2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 2倍Master Mix(美國Thermo公司)。7900HTFAST 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易上海有限公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1BMDCs的制備 斷頸法處死小鼠，于無菌操作臺(tái)分離出股骨和脛骨，置于含RPMI-1640培養(yǎng)基的皿中，用1 ml無菌注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白；將沖洗下來的骨髓細(xì)胞懸液經(jīng)無菌棉花柱過濾，以除去殘留的骨碎片及肌肉組織，濾液于4 ℃條件下，離心半徑16.8 cm,1 264 r/min,離心8 min，棄去上清液，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；將細(xì)胞以1×106/ml密度接種于24孔板，加入終濃度10 ng/ml GM-CSF及IL-4誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞向DCs分化；培養(yǎng)第3天半量換液，補(bǔ)充細(xì)胞因子，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天得到未成熟的BMDCs。

1.2.2EAU模型的建立及T細(xì)胞的提取 小鼠腹腔內(nèi)注射350 ng百日咳毒素后2 h，于單后足和軀干部皮下注射100 μl含有150 μg IRBP1-20、0.8 mg結(jié)核分枝桿菌H37RA和IFA的乳化劑，建立EAU模型；于造模后第13天，斷頸法處死小鼠，取脾臟及腘窩淋巴結(jié)研磨，將研磨液經(jīng)棉花柱過濾得到脾臟及淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液加入尼龍柱密封，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，用完全培養(yǎng)基沖洗尼龍柱，收集沖洗下的細(xì)胞懸液得到T細(xì)胞。

1.2.3BMDCs的轉(zhuǎn)染及其與T細(xì)胞的共培養(yǎng) 收集誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天的BMDCs，分為miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組、擬似物陰性對(duì)照組、miR-338-3p抑制劑轉(zhuǎn)染組和抑制劑陰性對(duì)照組；用RPMI-1640培養(yǎng)基分別將miR-338-3p擬似物、擬似物陰性對(duì)照、miR-338-3p抑制劑、抑制劑陰性對(duì)照及Lipofectamine 2000稀釋，常溫下孵育5 min，將miR-338-3p擬似物、擬似物陰性對(duì)照、miR-338-3p抑制劑和抑制劑陰性對(duì)照稀釋液分別與Lipofectamine 2000稀釋液混合，常溫下靜置20 min，分別加入各組BMDCs中，培養(yǎng)6 h后補(bǔ)充完全培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24 h，加入終質(zhì)量濃度100 ng/ml的脂多糖刺激各組BMDCs，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，一部分BMDCs用于提取總RNA，另一部分BMDCs以1×105/孔分別接種于24孔板，在含有10 μg/ml IRBP1-20的完全培養(yǎng)基中與分離的脾臟及淋巴結(jié)T細(xì)胞共培養(yǎng)，并加入終質(zhì)量濃度為20 ng/ml的IL-23(Th17細(xì)胞極化條件)，培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液及細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.4ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-17質(zhì)量濃度 取各組共培養(yǎng)上清液，根據(jù)小鼠IL-17 ELISA試劑盒說明書檢測(cè)IL-17質(zhì)量濃度。取酶標(biāo)板孔用IL-17捕獲抗體常溫包被過夜，封閉液常溫封閉1 h；實(shí)驗(yàn)孔加入10倍稀釋的樣本100 μl，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl，常溫孵育2 h，棄去液體，清洗5次；每孔加入稀釋的IL-17檢測(cè)抗體100 μl，常溫孵育2 h，棄去液體，清洗5次；每孔加入100 μl稀釋的辣根過氧化物酶，常溫孵育30 min，棄去液體，清洗5次；每孔加入100 μl四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)顯色液，室溫孵育10～20 min；每孔加50 μl終止液，測(cè)定450 nm處吸光度(A)值，用540 nm處A值進(jìn)行校正；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程，計(jì)算樣本IL-17質(zhì)量濃度。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)BMDCs中miR-338-3p、IL-23、IL-1β、IL-6 mRNA和共培養(yǎng)細(xì)胞中IL-17、RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量 采用Trizol法提取miR-338-3p 擬似物轉(zhuǎn)染組和擬似物陰性對(duì)照組BMDCs以及共培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板，各基因引物序列見表1，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算BMDCs中IL-23、IL-1β、IL-6 mRNA以及共培養(yǎng)細(xì)胞中IL-17、RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量。另取miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組和擬似物陰性對(duì)照組BMDCs檢測(cè)miR-338-3p相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，62 ℃退火及延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算2個(gè)組BMDCs中miR-338-3p相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR基因引物序列(5’-3’)擴(kuò)增長度(bp)IL-17F:CCTGGCGGCTACAGTGAAG57R:TTTGGACACGCTGAGCTTTGRORγtF:CCTCAGCGCCCTGTGTTTT58R:GCATGCAGCTTTTGCCTGTTIL-23F:CATAGCTGCCCGGGTCTTT57R:GGCACTAAGGGCTCAGTCAGAIL-1βF:AGTTGACGGACCCCAAAAGA57R:GGACAGCCCAGGTCAAAGGIL-6F:CCACGGCCTTCCCTACTTC61R:TTGGGAGTGGTATCCTCTGTGAGAPDHF:CATGGCCTTCCGTGTTCCTA55R:GCGGCACGTCAGATCCA 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);IL:白細(xì)胞介素;RORγt:維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶;F:正向引物;R:反向引物 Note:PCR:polymerase chain reaction;IL:interleukin;RORγt:retinoic acid receptor-related orphan nuclear receptor γt;GAPDH:glyceraldehyde phosphated dehydrogenase;F:forward primer;R:reverse primer

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)細(xì)胞中Th17細(xì)胞百分比 取收集的miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組和擬似物陰性對(duì)照組細(xì)胞，用含有50 ng/ml PMA、1 μg/ml BFA和1 μg/ml鈣離子霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中刺激4 h；更換為破膜固定液，于4 ℃條件下避光過夜；用2.4G2封閉細(xì)胞表面Fc受體；加入FITC-IL-17、PE-IFN-γ抗體，于4 ℃避光條件下孵育2 h；洗滌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-17+細(xì)胞百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。各組間測(cè)量指標(biāo)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擬似物陰性對(duì)照組與miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組BMDCs中miR-338-3p相對(duì)表達(dá)量比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與擬似物陰性對(duì)照組相比，miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組BMDCs中miR-338-3p相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.861，P=0.002)(表2)。

表2 2個(gè)組BMDCs中miR-338-3p相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of relative expression level of miR-338-3pin BMDCs between the two groups (mean±SD)組別樣本量miR-338-3p相對(duì)表達(dá)量擬似物陰性對(duì)照組31.00±0.03miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組31 750.00±254.90t值6.861P值0.002 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) BMDCs:骨髓來源樹突狀細(xì)胞;miR:微小RNA Note:(Independent samples t-test) BMDCs:bone marrow-derived dendritic cells;miR:microRNA

2.2 擬似物陰性對(duì)照組與miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)細(xì)胞中RORγt、IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)細(xì)胞中RORγt、IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.34±0.16和1.33±0.16，明顯高于擬似物陰性對(duì)照組的1.00±0.01和1.00±0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.632，P=0.022；t=3.681，P=0.021)(圖1)。

圖1 擬似物陰性對(duì)照組與miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)細(xì)胞中RORγt、IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 A：各組RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 B：各組IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與擬似物陰性對(duì)照組相比，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) 1：擬似物陰性對(duì)照組；2：miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組 RORγt：維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt；IL：白細(xì)胞介素Figure 1 Comparison of the relative expression levels of RORγt and IL-17 mRNA in co-cultured cells between the two groups A：RORγt B：IL-17 Compared with the mimics negative control group,aP<0.05 (Independent samples t-test，n=3) 1：mimics negative control group；2：miR-338-3p mimics transfection group RORγt：retinoic acid receptor-related orphan receptor-γt；IL：interleukin

2.3 各組細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質(zhì)量濃度比較

miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)上清液中IL-17質(zhì)量濃度為(5 941.00±452.40)pg/ml，明顯高于擬似物陰性對(duì)照組的(4 299.00±348.30)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.979，P=0.008)(圖2)；miR-338-3p抑制劑轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)上清液中IL-17質(zhì)量濃度為(3 092.00±200.90)pg/ml，明顯低于抑制劑陰性對(duì)照組的(4 063.00±131.50)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.005，P=0.002)(圖3)。

圖4 擬似物陰性對(duì)照組與miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞百分比比較 A：各組共培養(yǎng)細(xì)胞流式散點(diǎn)圖 B：各組共培養(yǎng)細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞百分比比較 與擬似物陰性對(duì)照組相比，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) 1：擬似物陰性對(duì)照組；2：miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組 IFN-γ：γ-干擾素；IL：白細(xì)胞介素Figure 4 Comparison of IL-17+cells percentage in the co-cultured cells between the two groups A：Flow cytometry scatter plots of the co-cultured cells in the two groups B：Comparison of IL-17+ cells percentage in the co-cultured cells between the two groups Compared with the mimics negative control group, aP<0.05 (Independent samples t-test，n=3) 1：mimics negative control group；2：miR-338-3p mimics transfection group IFN-γ：interferon-γ；IL：interleukin

圖5 擬似物陰性對(duì)照組與miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組BMDCs中IL-6、IL-23、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 A：各組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 B：各組IL-23 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 C：各組IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與擬似物陰性對(duì)照組相比，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) 1：擬似物陰性對(duì)照組 2：miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組 IL：白細(xì)胞介素Figure 5 Comparison of the relative expression levels of IL-6，IL-23，IL-1β mRNA in BMDCs between the two groups A：IL-6 B：IL-23 C：IL-1β Compared with the mimics negative control group, aP<0.05 (Independent samples t-test，n=3) 1：mimics negative control group；2：miR-338-3p mimics transfection group IL：interleukin

2.4 擬似物陰性對(duì)照組和miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞百分比比較

miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組共培養(yǎng)細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞百分比為(8.03±1.35)%，明顯高于擬似物陰性對(duì)照組的(4.52±0.73)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.968，P=0.017)(圖4)。

2.5 擬似物陰性對(duì)照組與miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組BMDCs中IL-6、IL-23、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組BMDCs中IL-6、IL-23、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.23±0.21、2.21±0.56和2.32±0.43，明顯高于擬似物陰性對(duì)照組的1.00±0.06、1.00±0.07和1.01±0.15，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.290，P=0.001；t=3.747，P=0.020；t=5.280，P=0.006)(圖5)。

圖2 擬似物陰性對(duì)照組和miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質(zhì)量濃度比較 與擬似物陰性對(duì)照組相比，aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) 1：擬似物陰性對(duì)照組；2：miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組 IL：白細(xì)胞介素 圖3 抑制劑陰性對(duì)照組和miR-338-3p抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質(zhì)量濃度的比較 與抑制劑陰性對(duì)照組相比，aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) 1：抑制劑陰性對(duì)照組；2：miR-338-3p抑制劑轉(zhuǎn)染組 IL：白細(xì)胞介素Figure 2 Comparison of IL-17 concentration in co-cultured supernatant between the two groups Compared with the mimics negative control group, aP<0.01(Independent samples t-test，n=3) 1：mimics negative control group；2：miR-338-3p mimics transfection group IL：interleukin Figure 3 Comparison of IL-17 concentration in co-cultured supernatant between the two groups Compared with the inhibitor negative control group，aP<0.01 (Independent samples t-test，n=3) 1：inhibitor negative control group；2：miR-338-3p inhibitor transfection group IL：interleukin

3 討論

Th17細(xì)胞是一類CD4+T細(xì)胞亞群，特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt，通過分泌IL-17等炎性細(xì)胞因子促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[16-17]。研究表明，自身免疫性葡萄膜炎患者體內(nèi)Th17細(xì)胞活性增強(qiáng)，血清中IL-17水平上升，靶向抑制Th17細(xì)胞可以緩解患者眼部炎癥[18-20]。因此，深入研究Th17細(xì)胞的相關(guān)調(diào)控機(jī)制對(duì)自身免疫性葡萄膜炎的防治具有重要意義。目前多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)揭示T細(xì)胞內(nèi)源性通路影響Th17細(xì)胞反應(yīng)[21-23]，而來自固有免疫細(xì)胞的外源信號(hào)對(duì)Th17細(xì)胞活性的影響及機(jī)制尚不清楚。Ifergan等[10]研究表明，敲除miR-223的DCs中IL-6、IL-23和IL-1β分泌減少，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化減少，從而緩解了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的癥狀，提示miRNA可以調(diào)控DCs介導(dǎo)的Th17細(xì)胞反應(yīng)，參與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究中觀察了miR-338-3p對(duì)EAU中IRBP1-20特異性Th17細(xì)胞活化以及BMDCs促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，結(jié)果表明miR-338-3p可能通過促進(jìn)BMDCs中IL-6、IL-1β和IL-23等基因的表達(dá)來增強(qiáng)IRBP1-20特異性Th17細(xì)胞中RORγt的表達(dá)及IL-17的產(chǎn)生。

編碼miR-338-3p的基因位于凋亡相關(guān)酪氨酸激酶的第7個(gè)內(nèi)含子中，最初發(fā)現(xiàn)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮作用[24]。近年來，大量研究表明miR-338-3p在腫瘤的發(fā)生中扮演重要角色。miR-338-3p被證實(shí)在胃癌、骨肉瘤、卵巢癌等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且可以通過影響MAPK、PI3K/AKT等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的生長[25-27]。最近，miR-338-3p被證實(shí)在尋常型天皰瘡、重癥肌無力和肌萎縮側(cè)索硬化癥等多種自身免疫性疾病外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)升高，并且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[28-30]。此外，Xu等[15]的最新研究表明在尋常型天皰瘡中，miR-338-3p可以通過靶向RUNX1來抑制FOXP3的表達(dá)，從而減少CD4+T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化。然而，miR-338-3p在EAU中對(duì)Th17細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，miR-338-3p過表達(dá)的BMDCs能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞中RORγt以及IL-17 mRNA表達(dá)，提示DCs中miR-338-3p可以促進(jìn)IRBP1-20特異性Th17細(xì)胞反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞共培養(yǎng)中Th17細(xì)胞比例明顯高于擬似物陰性對(duì)照組，進(jìn)一步表明miR-338-3p過表達(dá)的BMDCs能夠促進(jìn)IRBP1-20特異性Th17細(xì)胞分化。此外，miR-338-3p擬似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質(zhì)量濃度明顯高于擬似物陰性對(duì)照組，而miR-338-3p抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質(zhì)量濃度較抑制劑陰性對(duì)照組明顯降低，表明BMDCs中miR-338-3p能夠正向調(diào)控IL-17蛋白水平的表達(dá)。以上結(jié)果均提示miR-338-3p可能參與EAU的發(fā)病。

Th17細(xì)胞的分化依賴于局部細(xì)胞因子環(huán)境。研究表明，IL-6可以抑制T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)，解除RORγt抑制，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞分化；IL-1β促進(jìn)Th17細(xì)胞的早期分化；而IL-23維持Th17細(xì)胞的穩(wěn)定，是產(chǎn)生致病性Th17細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞因子[31]。DCs是專職抗原提呈細(xì)胞，活化的DCs能夠分泌IL-6、IL-23和IL-1β等多種細(xì)胞因子，指導(dǎo)CD4+T細(xì)胞亞群分化，調(diào)控抗原特異性免疫反應(yīng)[32-33]。有研究表明，miRNA能夠通過調(diào)控DCs促炎性或抑炎性細(xì)胞因子的分泌從而影響Th17細(xì)胞的活性[34]。例如，克羅恩病患者DCs中miR-29的減少導(dǎo)致IL-23水平升高，促進(jìn)了Th17細(xì)胞中RORγt和IL-17 mRNA的表達(dá)[35]。此外，Kurowska-Stolarska等[12]研究表明miR-34a-/-DCs分泌IL-6、IL-1β、IL-23減少，導(dǎo)致抗原特異性Th17細(xì)胞產(chǎn)生減少，從而緩解了抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。而miR-155過表達(dá)能夠抑制DCs中IL-6、IL-1β的分泌，促進(jìn)IL-10的表達(dá)，抑制白塞病患者CD4+T細(xì)胞中IL-17的產(chǎn)生[36]。本研究結(jié)果顯示，與擬似物陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-338-3p擬似物的BMDCs中IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA的表達(dá)水平明顯升高，表明miR-338-3p可能通過DCs創(chuàng)造了有利于Th17細(xì)胞活化的微環(huán)境。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-338-3p可能通過促進(jìn)BMDCs分泌Th17細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子來增強(qiáng)IRBP1-20特異性Th17細(xì)胞的活性，進(jìn)而影響EAU的發(fā)生和發(fā)展。然而，本研究?jī)H在體外探討了BMDCs中miR-338-3p對(duì)Th17細(xì)胞的調(diào)控作用及部分機(jī)制，而在體環(huán)境復(fù)雜，DCs中miR-338-3p如何影響EAU中致病性Th17細(xì)胞的活化以及miR-338-3p是通過何種胞內(nèi)通路影響Th17細(xì)胞的活性仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突