李貞卓，姜銳，劉建增，徐曉浩，趙大慶※

（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130021；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林長春130021）

皮膚是人體自身的天然屏障系統(tǒng)，皮膚的最外層表皮層可保護機體內(nèi)部免受紫外線輻射、化學物質(zhì)威脅和微生物病原體感染等侵害，防止水分從體內(nèi)流失，維持體內(nèi)代謝平衡。當皮膚受到外界紫外線輻射等刺激時，其表皮屏障保護功能會下降,從而導致嚴重的亞健康狀態(tài)或皮膚疾病，如干性皮膚、特應性皮炎和魚鱗病等[1,2]，因此，尋找安全、高效的天然表皮損傷修復劑對于修復表皮結(jié)構(gòu)功能障礙具有重要的臨床意義，是治療皮膚疾病及亞健康皮膚的重中之重。

紫外線是導致皮膚損傷的主要外在因素。紫外線照射后，參與表皮角化包膜形成的主要蛋白絲聚蛋白（Filaggrin,FLG）的表達顯著降低導致表皮結(jié)構(gòu)受損，進一步破壞負責表皮水分及溶質(zhì)運輸?shù)乃ǖ赖鞍?（Aquaporin-3,AQP3）的表達，加劇了表皮損傷引起的皮膚干燥脫水、紅腫及過敏等癥狀[3]。已有研究表明，中藥可用于保護皮膚的表皮結(jié)構(gòu)功能，并且會提高補水鎖水因子的表達[4,5]。本研究選用傳統(tǒng)名貴中藥人參（Panax ginseng C.A.Meyer），其為五加科植物，常用入藥部位為其干燥的植物根和根莖。眾所周知，人參被認為是一種潛在的治療劑，可促進傷口愈合，減少皮膚炎癥，抑制黑色素生成[6,7]。但對人參中具有表皮損傷修復作用的功效成分的研究鮮有報道。本研究以FLG和AQP3蛋白表達為檢測指標，建立了UVB誘導的HaCaT細胞損傷模型，利用此模型篩選出了具有表皮損傷修復功效的人參組分，并采用UVB誘導的無毛小鼠動物皮膚損傷模型進一步明確其改善UVB誘導表皮損傷作用。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑與儀器

人表皮角質(zhì)形成細胞（HaCaT）購自上海富衡生物科技有限公司；用于蛋白免疫印跡實驗的FLG抗體和增強型化學發(fā)光試劑購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；用于組織免疫熒光實驗的FLG抗體購自上海愛必信生物科技有限公司；AQP3抗體購自美國Abcam公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；FITC標記的山羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；DAPI購自美國Sigma公司；酶標儀購自美國Thermo公司；FluorChem HD2化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Protein Simple公司；UV交聯(lián)系統(tǒng)購自美國Hoefer Scientific Instruments公司；Cutometer?dual MPA 580測試儀購自德國Courage&Khazaka公司；Cytation 5細胞成像多模式檢測儀購自美國BioTek公司。

1.2 人參不同極性組分的制備

人參提取分離流程如圖1所示，將人參根洗凈切片粉碎，加入蒸餾水浸沒藥材，浸泡2～3h后，在100℃加熱條件下回流提取3次，每次1 h，過濾去除殘渣后，合并濾液干燥得到人參水提物。采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次對人參水提物進行萃取，得到組分1（0.55% W/W）、組分2（0.98% W/W）、組分3（0.30% W/W）和組分4（2.65% W/W），最后所得水層萃取液為組分5（15.28%W/W）。

圖1 人參不同極性組分制備流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of different polar components from ginseng

1.3 建立UVB誘導的HaCaT細胞損傷模型

將HaCaT細胞接種到6孔板中，置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育，待細胞生長密度達到80%進行不同劑量的UVB照射（20 mJ/cm2、40 mJ/cm2和80 mJ/cm2），照射后收取不同作用時間的細胞（12 h、24 h和48h），通過蛋白免疫印跡法檢測其表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達情況，以確立造模條件。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測

用PBS洗滌細胞3次，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液置于冰上裂解30 min后，使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品（50g）用12%的SDS-PAGE凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，并用TBST沖洗膜，將膜在4℃條件下與FLG和AQP3的一抗（1:500，1:1 000）孵育過夜，然后用TBST洗滌3次，并與相應的二抗（1:5 000）在室溫下孵育1 h，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像并分析轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)條帶。

1.5 動物分組造模及給藥

SPF級雌性BALB/c無毛小鼠（6周齡），體重18～20g，購買于長春億斯動物飼養(yǎng)中心，動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001。在實驗開始前，所有小鼠在溫度（22±1）℃、相對濕度55%±5%的環(huán)境中適應培養(yǎng)1周。隨時供應充足的水和食物。所有動物實驗程序和方案均經(jīng)長春中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核通過。小鼠適應培養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、UVB模型組、UVB+組分4組和UVB+組分5組，共4組（每組5只）。除空白組外，其余各組均連續(xù)2周每天接受發(fā)射波長為312 nm的UV交聯(lián)儀照射小鼠背部皮膚每天1次，并用UVB測量計監(jiān)測UVB（280～320 nm）的輸出能量。小鼠在第1天和第2天以100 mJ/cm2的UVB劑量進行照射，第3天和第4天以150 mJ/cm2的劑量進行照射，隨后將劑量增加到200 mJ/cm2進行照射直到實驗結(jié)束。根據(jù)化妝品功效評價指南測試樣品常規(guī)涂抹劑量（2.0±0.1）mg/cm2，在每天UVB的照射后，分別將組分4和組分5以2 mg/cm2的劑量涂抹于UVB+組分4和UVB+組分5組小鼠背部受試皮膚區(qū)域，每天涂抹1次。

1.6 小鼠皮膚表面生理指標檢測

實驗過程中，采用Cutometer?dual MPA 580測試儀Tewameter?TM 300、Corneometer?CM 825和Mexameter?MX18測試探頭分別測試分析皮膚經(jīng)表皮水分流失（transepidermal water loss,TEWL）、角質(zhì)層含水量、皮膚紅斑和黑色素沉著。這些測量均在21～22℃和50%～55%濕度的特定條件下進行，并分別在人參功效組分4和組分5治療0d和14 d后對各組進行測量。

1.7 免疫熒光檢測

小鼠皮膚組織在4%多聚甲醛中固定24 h后，包埋并切成3m厚的切片，脫蠟，水化，與一抗（1:200）在4℃孵育過夜，然后與FITC標記的山羊抗兔抗體（1:100）在室溫下孵育1 h。細胞核用DAPI染色。利用細胞成像多功能檢測系統(tǒng)Cytation 5對皮膚組織中的靶蛋白表達進行檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。使用GraphPad Prism 7.0進行單因素方差分析（ANOVA）和Tukey檢驗的多重比較，在所有實驗中，P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 UVB誘導的HaCaT細胞損傷模型的建立

我們使用不同UVB劑量（20 mJ/cm2、40 mJ/cm2和80 mJ/cm2）照射HaCaT角質(zhì)形成細胞，分別照射12 h、24 h和48 h，通過免疫印跡法時間-劑量檢測結(jié)果顯示，UVB照射劑量為40 mJ/cm2和80 mJ/cm2，照射24 h后HaCaT細胞中FLG和AQP3蛋白表達水平顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而照射12 h和48 h后HaCaT細胞中FLG和AQP3蛋白表達水平均無顯著性變化。因此，本實驗采用UVB照射劑量為40 mJ/cm2，照射24 h后建立細胞損傷模型（圖2）。

圖2 UVB誘導的HaCaT細胞損傷模型條件篩選Fig.2 Screening of UVB induced HaCaT cell damage model

2.2 人參功效組分的篩選

利用建立的細胞模型檢測人參不同極性組分對FLG和AQP3蛋白表達影響。免疫印跡實驗結(jié)果顯示，UVB模型組的表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白FLG和AQP3的表達水平明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），而用人參組分4和組分5（10g/mL）分別處理后均可使這兩種蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖3）。因此，本研究利用已建立的細胞損傷模型篩選得到人參正丁醇層和水層組分具有表皮損傷修復作用。

圖3 人參功效組分4和組分5對UVB作用的HaCaT細胞中FLG和AQP3蛋白表達影響Fig.3 Effects of ginseng active component 4 and component 5 on FLG and AQP3 protein expression in UVB treated HaCaT cells

2.3 人參功效組分4和組分5對UVB誘導的BALB/c無毛小鼠皮膚表面生理指標的影響

皮膚測試結(jié)果顯示，與空白組比較，UVB模型組小鼠皮膚的TEWL、紅斑值和黑色素值有所升高（P＜0.05），而角質(zhì)層含水量下降；而人參功效組分4和組分5治療組小鼠皮膚的TEWL、紅斑值和黑色素值顯著降低（P＜0.05），皮膚的角質(zhì)層含水量顯著升高，接近空白組（P＜0.05）（圖4）。動物水平實驗結(jié)果進一步表明人參正丁醇層和水層組分可有效恢復小鼠皮膚表面的生理狀態(tài)，增強對UVB誘導的小鼠皮膚損傷的保護作用。

圖4 人參功效組分4和組分5對UVB作用的BALB/c無毛小鼠皮膚TEWL、角質(zhì)層含水量、紅斑值和黑色素值的影響Fig.4 Effects of ginseng active component 4 and component 5 on TEWL,stratum corneum water content,erythema value,and melanin value in UVB treated BALB/c hairless mice

2.4 人參功效組分4和組分5對UVB誘導的BALB/c無毛小鼠皮膚中FLG蛋白表達的影響

小鼠皮膚組織免疫熒光結(jié)果顯示，UVB模型組小鼠皮膚組織中FLG蛋白表達的綠色熒光強度明顯降低，經(jīng)人參組分4和組分5治療后，表皮中FLG蛋白的熒光染色強度明顯高于UVB模型組（圖5）。結(jié)果表明，人參正丁醇層和水層組分能顯著恢復小鼠皮膚中表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白FLG的表達，有效改善UVB誘導的表皮結(jié)構(gòu)損傷。

圖5 人參功效組分4和組分5對UVB作用的BALB/c無毛小鼠皮膚中FLG蛋白表達的影響（20）。Fig.5 Effects of ginseng active component 4 and component 5 on FLG protein expression in UVB treated BALB/c hairless mice skin(20).

3 討論

當機體受到紫外線輻射后，角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)受損，導致FLG蛋白表達下降造成表皮損傷[8,9]。FLG是角質(zhì)層屏障功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[10,11]，通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-1的交叉連接作用參與角化包膜的形成并調(diào)節(jié)表皮的水分平衡[12-14]。由于紫外線輻射后，角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)受損，皮膚的補水、鎖水能力下降，導致控制皮膚水分運輸?shù)耐ǖ朗茏?，研究發(fā)現(xiàn)AQP3是皮膚中含量最豐富的水通道蛋白[15]。有研究表明，紫外線輻射可顯著下調(diào)人皮膚角質(zhì)形成細胞中AQP3蛋白的表達，造成皮膚缺水，從而進一步破壞表皮結(jié)構(gòu)的完整性[16,17]。由此可見，AQP3是修復表皮損傷和維持表皮水化功能中的重要因子[18,19]。因此，本實驗以FLG和AQP3蛋白表達水平為檢測指標，通過對UVB造模劑量和時間的篩選和優(yōu)化，建立了細胞損傷模型。

人參是最有價值的草本植物之一，自古以來就被中國、日本及韓國等亞洲國家用作治療藥物和保健品。根據(jù)以往的研究報道，人參中含有人參皂苷、多糖、寡糖、多肽、脂肪酸和氨基酸等多種活性成分。本研究采用不同極性的有機溶劑對人參水提液進行分步萃取，利用UVB誘導的細胞損傷模型進行活性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正丁醇層萃取液（組分4）和水層萃取液（組分5）具有顯著的表皮損傷修復功效。根據(jù)其萃取液極性大小，我們推測組分4可能主要含有人參皂苷成分，組分5可能主要含有極性較大的糖類成分。已有研究表明，人參皂苷Rb2可以通過降低活性氧（ROS）的產(chǎn)生和基質(zhì)金屬蛋白酶的活性延緩皮膚衰老[20]；人參皂苷Rb1可以通過降低皮膚黑色素含量提亮膚色[21]；人參寡糖能通過抑制ROS介導的MAPK和NF-B信號通路發(fā)揮抗光老化功效[22]。但人參活性成分對表皮損傷修復的研究鮮有報道。從本研究結(jié)果看，人參中可能存在兩種不同極性的具有表皮損傷修復作用的組分，即正丁醇層和水層組分。

本研究通過BALB/c無毛小鼠動物模型做了進一步驗證，明確了人參正丁醇層和水層組分具有表皮損傷修復功效，能有效恢復紫外線UVB對表皮結(jié)構(gòu)造成的損傷，并且可能改善因表皮損傷后引起的干燥失水、粗糙、脫屑、紅腫發(fā)炎和色素沉著等癥狀?；诒疚膶嶒灁?shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這兩種人參功效組分可顯著性地恢復皮膚的TEWL、角質(zhì)層含水量、紅斑值和黑色素沉著。為了更直觀地表達其對表皮損傷的修復作用，文中采用免疫熒光實驗，實驗結(jié)果表明，外用涂抹人參正丁醇層和水層組分可有效抑制小鼠因UVB照射后下調(diào)的表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白FLG的表達，這與細胞水平結(jié)果相符。

綜上所述，本實驗從人參中篩選出的正丁醇層和水層組分具有顯著的表皮損傷修復功效，其可通過增強表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白及補水、鎖水因子的表達，恢復受損的表皮結(jié)構(gòu)，這將為其作為皮膚損傷修復成分的研制提供有效的實驗數(shù)據(jù)和參考價值，為中醫(yī)藥更為廣泛的應用提供了強有力的科學依據(jù)。