任莉莉，楊凌鑒，彭勇，陳紫成，金華峰，徐世明

（1.安康學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，陜西安康725000；2.安康學(xué)院秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西安康725000；3.北京大學(xué)安康藥物研究院，陜西安康725000；4.北醫(yī)大院士工作站，陜西安康725000）

苦參（Sophorae flavescens Radix）為豆科植物苦參的干燥根，性寒，味苦，歸心、肝、胃、大腸及膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、殺蟲、抗菌和利尿的功效?？鄥⒑罅可飰A，其中苦參堿和氧化苦參堿約占苦參總生物堿的70%，除此之外，苦參中還含有其他各類生物堿，如槐果堿、槐定堿等[1-3]?？鄥A（matrine）純品為柱狀或針狀結(jié)晶，易溶于水、甲醇、乙醇、苯、氯仿及乙醚等有機(jī)溶劑，微溶于石油醚。苦參堿具有很多藥理活性，包括抗腫瘤、抗肝炎病毒、保肝、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗菌和殺蟲等，已被廣泛的應(yīng)用于臨床[2,4,5]。氧化苦參堿（oxymatrine）也常與苦參堿一同存在于苦參藥材中[2,4]。根據(jù)生產(chǎn)需求，可以將氧化苦參堿和苦參堿互相轉(zhuǎn)化，從而獲得更多目標(biāo)產(chǎn)物[6]。

苦參中生物堿常用提取方法為溶劑提取法，依據(jù)相似相溶的原理選用對(duì)生物堿溶解度大而對(duì)其他成分溶解度小的溶劑，常用酸水提取法和乙醇提取法[7,8]。具體操作包括浸提、回流和滲漉等，另外還有超聲輔助提取法和微波輔助提取法等。分離純化方法包括陽離子交換樹脂層析、大孔吸附樹脂層析、硅膠柱層析、氧化鋁柱層析、重結(jié)晶和鹽析等[9,10]。很多分離純化方法用到大量有毒試劑，威脅生命安全且污染環(huán)境，并且很難高效獲得較純的目標(biāo)產(chǎn)物[2]。工業(yè)生產(chǎn)要求最大程度利用原材料并獲得純度較高的產(chǎn)物，且提取工藝盡可能不使用毒性溶劑。在此，本研究以苦參為原料，在提取過程中，將氧化苦參堿還原為苦參堿，從而獲得更多的目標(biāo)產(chǎn)物苦參堿；同時(shí)基于工業(yè)生產(chǎn)對(duì)苦參提取工藝的要求，選用制藥公司常用的7種大孔吸附樹脂進(jìn)行苦參堿的分離研究，優(yōu)選最佳分離樹脂及條件，為工業(yè)生產(chǎn)提供支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC2000，上海天美科學(xué)儀器有限公司）；電子調(diào)溫加熱套（DZTW，天津工興實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE5286A，上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（B-260，上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（SQP，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料

苦參，由安康北醫(yī)大制藥股份有限公司提供，經(jīng)徐世明教授鑒定為正品?？鄥A（M109802）、氧化苦參堿（A111286）對(duì)照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，98%。無水乙醇，天津天力化學(xué)試劑有限公司，分析純。大孔樹脂D101、HPD450、HPD722購自滄州寶恩化工有限公司。大孔樹脂LSA20、LSA21、LSA700B、AB8購自西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司。樹脂的物理性能指標(biāo)見表1。

表1 7種大孔吸附樹脂基本性能Table 1 The basic properties of seven kinds of macroporous adsorption resins

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 苦參堿含量測(cè)定

參考2020版藥典苦參藥材項(xiàng)下苦參堿含量測(cè)定方法，利用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行苦參堿的含量測(cè)定。對(duì)照品溶液制備：精密稱定苦參堿，加乙腈-無水乙醇（80:20）制成每mL含苦參堿50g。供試品溶液制備：二氯甲烷提取溶液中的苦參堿后，回收溶劑至干，加無水乙醇定量溶解。氨基鍵合硅膠柱（4.6 mm 250 mm，5m）；流動(dòng)相為乙腈-無水乙醇-3%磷酸（80:10:10）；流動(dòng)相流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長220 nm；柱溫25℃。分別精密吸取對(duì)照品和供試品各20L進(jìn)樣檢測(cè)，每組平行檢測(cè)3次?？鄥A保留時(shí)間約8.9 min（圖1 A）。

2.2 苦參堿粗提液制備

稱取苦參藥材200 g，粉碎并過100目篩。將苦參粉末和7倍量60%乙醇混合，回流2.5 h，收集提取液；第2次和第3次回流提取溶劑加入量均為5倍量，回流時(shí)間1 h，過濾收集并合并濾液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，然后加40% HCl調(diào)pH 2～3，加4.4 g亞硫酸氫鈉攪拌過夜，將氧化苦參堿轉(zhuǎn)化為苦參堿，靜置，過濾，待用。按照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)得提取液中苦參堿濃度為302.83g/mL（高效液相色譜圖見圖1 B）。

圖1 對(duì)照品（A）和苦參待分離液（B）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC Chromatograms of the reference substance(A)and the preparation solution of Sophora flavescens(B)

2.3 樹脂預(yù)處理

分別量取一定量樹脂，濕法裝柱，2%NaOH淋洗（2 BV），流速為1.5 BV/h左右，然后用蒸餾水以相同流速洗至中性；5% HCl淋洗（2 BV），流速為1.5 BV/h左右，然后用蒸餾水以相同流速洗至中性；95%乙醇淋洗（2 BV），流速為1.5 BV/h左右，然后用蒸餾水以相同流速洗至無醇味[11]。

2.4 靜態(tài)吸附法初選樹脂

分別準(zhǔn)確量取7種大孔吸附樹脂各5mL于25mL錐形瓶中，加堿性苦參提取液（pH 9）12 mL，搖勻，靜態(tài)吸附2 h，過濾，收集濾液。按“2.1”項(xiàng)下高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。苦參堿的吸附率=（苦參堿總量－未吸附苦參堿量）/苦參堿總量100%。濾液苦參堿量及苦參堿吸附率結(jié)果，見表2。LSA21靜態(tài)吸附率最大，其次是HPD722和D101。后續(xù)選擇LSA21、HPD722和D101進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附及解析實(shí)驗(yàn)。

表2 7種大孔吸附樹脂吸附苦參堿情況Table 2 Adsorption of matrine by seven macroporous resins

2.5 動(dòng)態(tài)吸附及解析優(yōu)選樹脂

準(zhǔn)確量取3種樹脂D101、LSA21和HPD722各10 mL，濕法裝柱，分別連續(xù)添加堿性苦參提取液（pH 9），流速2 BV/h，收集流出液，進(jìn)行薄層色譜（TLC）定性檢測(cè)，與苦參堿對(duì)照品相同位置出現(xiàn)斑點(diǎn)即為動(dòng)態(tài)吸附終點(diǎn)。薄層色譜方法如下：取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品，分別加無水乙醇制成每1 mL含0.2 mg溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取收集樣品和對(duì)照品分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-25%氨水（5:0.5:0.2）為展開劑，展開，晾干，噴碘化鉍鉀試液。D101、LSA21和HPD722最大吸附苦參提取液體積分別為22mL、32mL和58mL，最大吸附量為提取液體積 苦參堿濃度。其中HPD722動(dòng)態(tài)吸附苦參堿量最大（圖2），為17.56 mg/mL±1.82 mg（1.76 mg/mL±0.18 mg/mL樹脂）。

圖2 3種樹脂動(dòng)態(tài)條件下苦參堿最大吸附量Fig.2 The maximum adsorption capacity of matrine of the three resins under dynamic conditions

完成動(dòng)態(tài)吸附后，用3 BV蒸餾水進(jìn)行沖洗，流速控制在2 BV/h左右，然后用90%乙醇溶液洗脫載樣樹脂，洗脫體積為5 BV，流速控制在2 BV/h左右。收集洗脫液，通過高效液相色譜法檢測(cè)其含量，理論解析率為洗脫苦參堿量/苦參堿總量100%。3組樹脂苦參堿解析率結(jié)果如圖3所示。LSA21和HPD722都有較高的解析率，分別為85.35%和86.45%。結(jié)合動(dòng)態(tài)最大吸附量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以選擇吸附量大、解析率高的樹脂，盡可能充分地分離和回收目標(biāo)產(chǎn)物為目的，故選擇HPD722為最佳樹脂進(jìn)行后續(xù)工藝條件的研究。

圖3 3種樹脂動(dòng)態(tài)解析率Fig.3 Desorption rate of the three resins under dynamic conditions

2.6 最佳樹脂分離條件研究

2.6.1 上樣速度準(zhǔn)確量取HPD722 10 mL共5份，分別裝柱并以2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h、6 BV/h進(jìn)行上樣，每組堿性苦參提取液用量為3BV（pH為9），收集流出液；用2BV去離子水進(jìn)行沖洗，收集流出液，并與之前收集流出液合并。按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定?？鄥A吸附率為（苦參堿總量未吸附苦參堿量）/苦參堿總量100%。由圖4可以看出，在不同上樣速度條件下，HPD722樹脂對(duì)苦參堿的吸附率均較高，在速度為2 BV/h和3 BV/h時(shí)，用高效液相色譜儀幾乎檢測(cè)不到流出液中苦參堿的信號(hào)，吸附率接近100%，故選擇3 BV/h為最佳上樣速度。

圖4 不同上樣速度時(shí)HPD722樹脂對(duì)苦參堿的吸附率Fig.4 The adsorption rate of matrine by HPD722 resin at different flow rates

2.6.2 上樣pH準(zhǔn)確量取HPD722 10 mL，共5份，分別裝柱，取苦參提取液30 mL共5份，用25%NH3·H2O調(diào)pH分別至3、5、7、9和11。以3 BV/h上樣，收集流出液；20 mL去離子水沖洗，收集流出液，并與之前流出液合并。按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定?？鄥A吸附率計(jì)算公式同2.6.1。由圖5可以看出，在pH為3時(shí)，HPD722樹脂對(duì)苦參堿幾乎沒有吸附效果；隨著pH增大，吸附率逐漸增大，最大吸附率時(shí)（98.47%）上樣pH為9；當(dāng)pH為11時(shí)，吸附率有所降低。故選擇pH為9時(shí)為最佳上樣pH。

圖5 不同上樣pH時(shí)HPD722樹脂對(duì)苦參堿的吸附率Fig.5 The adsorption rate of matrine by HPD722 resin at different loading pH

2.6.3乙醇洗脫濃度和體積準(zhǔn)確量取HPD72210mL，裝柱，取苦參提取液30mL進(jìn)行上樣（pH 9），20 mL去離子水沖洗。用不同濃度乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%）進(jìn)行洗脫。每個(gè)濃度洗脫體積為5 BV，流速控制在2 BV/h。收集每個(gè)濃度洗脫液，進(jìn)行薄層色譜定性檢測(cè)，乙醇在低濃度（＜20%）時(shí)無明顯產(chǎn)物點(diǎn)，≥30%時(shí)有產(chǎn)物點(diǎn)，≥70%時(shí)無產(chǎn)物點(diǎn)（圖6 A）。說明低濃度乙醇可洗脫除去雜質(zhì)，高濃度乙醇可洗脫苦參堿?？紤]實(shí)際生產(chǎn)情況及后續(xù)濃縮操作，選用20%乙醇洗脫除雜，70%乙醇洗脫產(chǎn)物。從TLC結(jié)果可以看出，乙醇洗脫液中主要產(chǎn)物點(diǎn)為苦參堿，且無明顯氧化苦參堿，說明該工藝過程的可行性，進(jìn)一步可通過結(jié)晶獲得純度較高的苦參堿[9]。

另相同條件下裝柱、上樣，用5 BV 20%乙醇洗脫除雜，再用10 BV 70%乙醇進(jìn)行洗脫，定量收集流出液（每20 mL一瓶），按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定，解析率為洗脫苦參堿量/苦參堿總量100%。由圖6 B可以看出，隨著洗脫液體積的增加，累計(jì)解析率不斷增大。大部分苦參堿在乙醇用量為20 mL時(shí)就能達(dá)到接近90%的解析率，當(dāng)乙醇用量達(dá)到40 mL時(shí)，解析率接近100%。所以在此操作條件下，洗脫體積為60 mL，即6 BV時(shí)洗脫較為完全。

圖6 A：HPD722樹脂解析TLC結(jié)果。B：不同洗脫溶劑用量時(shí)苦參堿的累計(jì)解析率Fig.6 A.The dynamic desorption at different concentrations of ethanol.B.The cumulative desorption rate of matrine at different eluent volume.

2.6.4 洗脫速度準(zhǔn)確量取HPD722 10 mL 5份，分別裝柱并取苦參提取液30 mL進(jìn)行上樣（pH為9），20 mL去離子水沖洗，60 mL 70%乙醇進(jìn)行洗脫。洗脫速度分別是2BV/h、3 BV/h、4BV/h、5BV/h和6BV/h。收集洗脫液，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定。理論解析率為洗脫苦參堿量/苦參堿總量100%。在各種洗脫流速條件下，苦參堿解析率均較高（圖7），均大于85%。在乙醇洗脫速度為2 BV/h和3 BV/h時(shí)，解析率分別為96.49%和96.10%。實(shí)際操作時(shí)，可選擇3 BV/h為最佳洗脫流速，既節(jié)約時(shí)間又能達(dá)到較高的解析效果。

圖7 不同洗脫速度時(shí)苦參堿的解析率Fig.7 The desorption rate of matrine at different elution flow rates

3 討論

7種大孔樹脂靜態(tài)吸附苦參堿吸附率有明顯差別，可能由于苦參堿屬于弱堿物質(zhì)，有一定的親水性，有利于非極性或弱極性樹脂的吸附，并且LSA21具有較大的比表面積，靜態(tài)吸附量較大[11,12]，其次是HPD722和D101。由于動(dòng)態(tài)吸附和靜態(tài)吸附過程有所不同，導(dǎo)致在兩種情況下被吸附物質(zhì)量有所差異，最終樹脂選擇還是以實(shí)際生產(chǎn)中使用的動(dòng)態(tài)吸附情況為參考，即選擇動(dòng)態(tài)吸附量最大的HPD722為該條件下的最優(yōu)吸附樹脂。

HPD722樹脂對(duì)苦參堿吸附性能較好。在pH為3時(shí)，HPD722樹脂對(duì)苦參堿幾乎沒有吸附效果，因?yàn)樵趶?qiáng)酸性條件下苦參堿成鹽后更易溶于水并隨水流出。隨著pH增大，吸附率逐漸增大。當(dāng)pH為11時(shí)，吸附率有所降低，可能是因?yàn)榭鄥A在強(qiáng)堿性條件下水解開環(huán)所致[13]。使用不同濃度乙醇為洗脫溶劑，對(duì)環(huán)境比較友好，產(chǎn)物收率高。大孔吸附樹脂分離純化苦參提取液中的苦參堿操作簡單，樹脂容易再生。HPD722樹脂可進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)放大生產(chǎn)分離純化苦參堿，并結(jié)合萃取、結(jié)晶等操作進(jìn)一步增加產(chǎn)物的純度。