魯海坤，于營(yíng)，隋昕，劉亞苓，于蕓澤，郭靖

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春130112）

種子老化是指種子活力自然衰退的過(guò)程，這是一種不可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程，成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及種質(zhì)資源保存的不利因素[1]，因此，研究種子老化機(jī)理，探求適宜種子的保存條件，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源保存和生物多樣性保護(hù)等具有重要意義[2]。目前普遍認(rèn)為活性氧造成的氧化脅迫是種子老化的主要原因[3]。1980年，Miquel等[4]提出了衰老的線粒體學(xué)說(shuō)，認(rèn)為活性氧、線粒體和種子老化三者密切相關(guān)。線粒體可以為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量，是進(jìn)行氧化磷酸化形成ATP的主要場(chǎng)所，被譽(yù)為細(xì)胞的“能量工廠”。此外，線粒體還參與細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等，在調(diào)控細(xì)胞和機(jī)體生命活動(dòng)方面發(fā)揮重要作用[5-7]；同時(shí)，線粒體也是活性氧產(chǎn)生的主要部位[8]，植物細(xì)胞消耗的氧中約有1%在線粒體中產(chǎn)生活性氧，其中由線粒體呼吸鏈底物端漏出的電子還原O2單電子生成的O2-是線粒體活性氧的主要來(lái)源[9]。O2-是多數(shù)活性氧的前體，可以被超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧化氫。在正常生理狀態(tài)下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)植物遭受脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧積累過(guò)多引起氧脅迫，線粒體最先受到傷害。Wang等[10]在榆樹(shù)種子老化研究初步揭示了種子老化過(guò)程中線粒體作用的機(jī)理，即活性氧可使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜電位降低，隨后釋放細(xì)胞色素c和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)因子，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）是一種廣譜活性氧抑制劑，可以有效清除細(xì)胞中的過(guò)氧化氫，超氧陰離子和羥自由基等活性氧有抑制細(xì)胞凋亡的作用，在生物醫(yī)藥研究中應(yīng)用廣泛[11-13]。環(huán)孢霉素A（CsA）可以與MPTP組件上的親環(huán)素蛋白結(jié)合，從而抑制MPTP開(kāi)放，維持線粒體膜電位，抑制細(xì)胞色素c釋放，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14,15]。

蒙古黃芪（Astragalus mongholicus Bunge）是豆科黃芪屬多年生藥用植物，其干燥根名為黃芪，是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材。由于近年來(lái)野生黃芪資源過(guò)度采挖，商品黃芪主要來(lái)源于人工栽培，種子是蒙古黃芪的主要繁殖材料，因此，為保證蒙古黃芪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保存，研究其種子老化機(jī)理和適宜的貯藏方法尤為重要。本試驗(yàn)通過(guò)NAC和CsA預(yù)處理蒙古黃芪種子，研究外源藥劑處理對(duì)種子活力、活性氧含量以及線粒體膜電位的影響，分析蒙古黃芪種子老化與活性氧和線粒體的關(guān)系，以期為探索種子老化機(jī)理和種子保存提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)種子購(gòu)于河北省安國(guó)市，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)所郭靖研究員鑒定為蒙古黃芪種子，種子初始發(fā)芽率為89%，發(fā)芽指數(shù)為30.3，含水量為9.8%。

1.2 方法

1.2.1 種子預(yù)處理 隨機(jī)挑選種子，用不同濃度的NAC（0、5、10、20、40 mmol/L）、CsA（0、30、60、90、120mol/L）浸泡4 h（濃度0為蒸餾水），之后用蒸餾水沖洗3遍，再于室溫下回干2 d，當(dāng)種子含水量降至初始含水量后，用鋁箔袋密封包裝，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 種子老化處理 將預(yù)處理后的蒙古黃芪種子置于恒溫水浴鍋（53±0.5℃）中進(jìn)行老化3 d處理。

1.2.3 種子發(fā)芽測(cè)定 種子發(fā)芽率測(cè)定參照ISTA（1996）方法進(jìn)行[16]，挑選大小一致的蒙古黃芪種子，置于培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙上，每皿100粒，3次重復(fù)，于光照培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，溫度和光照控制為15/25℃（高溫8 h/低溫16 h，高溫時(shí)光照，低溫時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度為36 mol m-2s-1）逐日檢查發(fā)芽種子數(shù)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。

1.2.4 活性氧和線粒體膜電位測(cè)定 參照Ratajczak[17]的方法，使用DCFH-DA（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）探針檢測(cè)活性氧含量。取吸脹后的蒙古黃芪種子，用鑷子去掉種皮，切下胚軸，并用雙刀片進(jìn)行徒手切片，將切片浸入5M DCFH-DA（用0.01 M PBS稀釋?zhuān)琾H7.4），于室溫黑暗下染色30 min，然后用PBS沖洗3次，每次5 min。用生物熒光顯微鏡（Olympus BX53）觀察并拍照，激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為464～495 nm（藍(lán)色）和515～555 nm（綠色）。

參照Kobayashi[18]的方法，使用JC-1熒光染料檢測(cè)線粒體膜電位變化。取蒙古黃芪種子胚軸的手工切片，浸入10g/mL JC-1（用0.01M PBS稀釋?zhuān)琾H7.4），于黑暗下染色20 min，然后用PBS沖洗3次，每次5 min。用生物熒光顯微鏡（Olympus BX53）觀察并拍照，激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為528～554 nm（綠色）和575～633 nm（紅色）。以圖片灰度值表示熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NAC預(yù)處理對(duì)人工老化種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

如圖1所示，不同濃度NAC處理的蒙古黃芪種子經(jīng)人工老化3 d后，其發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)存在顯著差異（P＜0.05）。蒸餾水對(duì)照試驗(yàn)的種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為60%和18.0，相比空白種子（未經(jīng)人工老化和外援藥劑預(yù)處理）分別下降32.7%和40.6%；40 mmol/L NAC處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)最低，分別為13%和3.7；20 mmol/L NAC處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽指標(biāo)稍高于40 mmol/L NAC，分別為41%和11.9；5 mmol/L NAC處理的種子與0 mmol/L NAC處理之間發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），且高于20 mmol/L和40 mmol/L NAC處理，而10 mmol/L NAC處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他處理（P＜0.05），發(fā)芽率為78.7%，發(fā)芽指數(shù)為24.9，相比0mmol/LNAC（蒸餾水）處理，其發(fā)芽率提高31.2%，發(fā)芽指數(shù)提高38.3%。以上研究結(jié)果表明，低濃度NAC處理有益于種子活力的保持，可提高種子老化后的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，而高濃度NAC可能對(duì)種子有毒害作用導(dǎo)致種子活力降低，且10mmol/LNAC預(yù)處理能有效提高種子抗老化能力，發(fā)芽指標(biāo)顯著高于蒸餾水處理。

圖1 不同濃度NAC處理對(duì)種子老化后發(fā)芽指標(biāo)的影響Fig.1 The effect of different concentrations of NAC treatments on the germination indicator of seeds after aging

2.2 不同濃度CsA處理對(duì)人工老化蒙古黃芪種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

如圖2所示，不同濃度CsA預(yù)處理對(duì)老化后蒙古黃芪種子活力影響不同。隨著CsA濃度升高，種子老化后其發(fā)芽率和發(fā)芽指標(biāo)整體呈先降低后上升，之后基本保持恒定。與 蒸餾水空白處理相比，30mol/L CsA預(yù)處理再老化3 d后，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)下降，分別為55.3%和15.5；60mol/L CsA處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽指標(biāo)未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）；90mol/L CsA處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別提高16.2%和21.1；120mol/L處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別提高14.5%和16.1，但與90mol/L CsA處理組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說(shuō)明適宜濃度的CsA可以有效提高種子活力，且在一定濃度之上再提高其濃度，種子發(fā)芽指標(biāo)不再提高。

圖2 不同濃度CsA預(yù)處理對(duì)種子老化后發(fā)芽指標(biāo)的影響Fig.2 The effect of different concentrations of CsA treatments on the germination indicator of seeds after aging

2.3 外源藥劑處理對(duì)人工老化蒙古黃芪種子活性氧含量的影響

應(yīng)用DCFH-DA探針標(biāo)記蒙古黃芪種子胚軸中的活性氧，分析不同濃度NAC預(yù)處理對(duì)種子老化后其胚軸內(nèi)活性氧含量變化的影響。如圖3所示，不加活性氧探針的陰性對(duì)照整個(gè)視野都沒(méi)有熒光信號(hào)，表明沒(méi)有自發(fā)熒光干擾（圖3 a）；未進(jìn)行老化處理的種子胚軸，可見(jiàn)有微弱的綠色熒光，表明胚軸內(nèi)有少量的活性氧（圖3 b）；蒸餾水預(yù)處理后老化3 d的種子胚軸，可見(jiàn)較亮的綠色熒光（圖3 c），說(shuō)明種子在老化3 d后其胚軸內(nèi)活性氧明顯增加；10 mmol/L NAC預(yù)處理后再老化3 d的種子胚軸（圖3 d），其綠色熒光較蒸餾水預(yù)處理后老化3 d處理的種子胚軸弱，說(shuō)明10mmol/L NAC預(yù)處理能大幅減少種子胚軸內(nèi)的活性氧積累；90mol/LCsA預(yù)處理后再老化3d的種子胚軸（圖3e），其綠色熒光強(qiáng)度明顯低于圖3 c，略高于圖3 d，說(shuō)明90mol/L CsA預(yù)處理有助于減輕老化過(guò)程中種子胚軸的活性氧積累。

圖3 外源藥劑處理對(duì)種子活性氧含量的影響Fig.3 The effect of exogenous medicament treatments on the active oxygen content of seed hypocotyls

2.4 外源藥劑處理對(duì)人工老化蒙古黃芪種子線粒體膜電位的影響

線粒體是機(jī)體供能的主要細(xì)胞器，而線粒體膜電位是維持線粒體內(nèi)氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件。用特異性熒光染料JC-1對(duì)不同處理的種子胚軸線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)。如圖4所示，不加JC-1染料的陰性對(duì)照（圖4 a）未檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明種子胚軸沒(méi)有自發(fā)熒光干擾；未進(jìn)行老化處理的種子胚軸（圖4 b），其紅色熒光強(qiáng)，表明其線粒體膜電位（△m）高；蒸餾水預(yù)處理后老化3 d的種子胚軸（圖4 c），其紅色熒光弱，膜電位低；經(jīng)10 mmol/L NAC預(yù)處理后再老化3 d的種子胚軸（圖4 d），其紅色熒光較強(qiáng)，膜電位較高；經(jīng)90mol/LCsA預(yù)處理后再老化3d的種子胚軸（圖4e），其紅色熒光較弱，膜電位較低。以上結(jié)果表明NAC和CsA預(yù)處理能有效提高老化種子的線粒體膜電位。

圖4 外源藥劑處理對(duì)蒙古黃芪種子線粒體膜電位的影響Fig.4 The effect of exogenous medicament treatments on the mitochondrial membrane potential of Astragalus mongolica seeds

3 討論

3.1 活性氧引起種子活力降低

種子衰老是一個(gè)復(fù)雜的量變到質(zhì)變的連續(xù)過(guò)程，表現(xiàn)出形態(tài)、物理化學(xué)反應(yīng)和生理生化代謝等一系列變化[19]。種子衰老的原因和機(jī)理有多種解釋?zhuān)は到y(tǒng)損傷、有毒物質(zhì)積累、酶活性降低、內(nèi)源激素不平衡和核酸蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解等多個(gè)方面。在種子衰老的眾多理論中，被廣泛接受的是衰老的自由基學(xué)說(shuō)[20]，認(rèn)為種子在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不斷進(jìn)行的有氧代謝產(chǎn)生了活性氧自由基，在種子采收貯藏期間隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷積累，過(guò)量的活性氧攻擊生物膜，誘導(dǎo)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并且抑制了種子內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的形成，造成種子內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除失衡，膜脂過(guò)氧化程度加劇，表現(xiàn)為丙二醛含量大幅增加，致使體內(nèi)維持細(xì)胞正常生理活性的酶失活及DNA降解等，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，種子活力降低[21-23]。

本試驗(yàn)中，蒙古黃芪種子經(jīng)人工老化后，其活性氧含量上升，線粒體膜電位降低，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，種子活力降低。而經(jīng)10 mmol/L NAC預(yù)處理的種子，其胚軸活性氧含量降低，線粒體膜電位升高，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)都有顯著提升，可能是由于NAC提高了細(xì)胞內(nèi)非酶抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽（GSH）的含量，清除了多余的活性氧（ROS），增強(qiáng)了細(xì)胞抗氧化能力，從而減輕了細(xì)胞的氧化損傷[24]，增強(qiáng)了種子的抗老化能力，延緩了種子衰老。

3.2 線粒體參與種子老化過(guò)程

衰老的自由基學(xué)說(shuō)不斷發(fā)展完善，形成現(xiàn)在的脂質(zhì)過(guò)氧化學(xué)說(shuō)和衰老的線粒體學(xué)說(shuō)。衰老的線粒體學(xué)說(shuō)認(rèn)為，線粒體的呼吸電子傳遞鏈?zhǔn)欠N子內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的主要部位，在種子的衰老過(guò)程中，線粒體中活性氧積累導(dǎo)致其最先發(fā)生氧化損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞功能異常，加速種子衰老死亡[25]。在種子老化過(guò)程中，ROS攻擊線粒體膜中不飽和脂肪酸，脂質(zhì)過(guò)氧化作用破壞了線粒體膜的完整性，線粒體發(fā)生膨脹，增加的電子漏反過(guò)來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)ROS的產(chǎn)生和積累，形成惡性循環(huán)[26]。

線粒體膜電位是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的先決條件，同時(shí)也能反應(yīng)出線粒體內(nèi)膜通透性和細(xì)胞活性[27]。活性氧和膜損傷可以相互作用，Wang等[28]在煙草研究中發(fā)現(xiàn)，ROS可以使線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（MPTP）持續(xù)性開(kāi)放，分子質(zhì)量大的物質(zhì)可非選擇性進(jìn)入孔道，此時(shí)線粒體發(fā)生腫脹、外膜破裂，線粒體膜電位下降。膜電位的持續(xù)降低甚至完全崩解會(huì)導(dǎo)致ATP產(chǎn)生不足，凋亡誘導(dǎo)因子釋放，活性氧進(jìn)一步積累，啟動(dòng)PCD加速種子的老化[29,30]。

Wang等[10]在榆樹(shù)種子老化研究中，發(fā)現(xiàn)活性氧與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔組分的表達(dá)呈正相關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原電位失衡，線粒體外膜破裂，跨膜電位（△m）喪失，ATP產(chǎn)生水平下降，最終細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。而線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的不正常開(kāi)放可以被抗壞血酸（AsA）和CsA有效緩解，通過(guò)AsA和CsA預(yù)處理可以減緩膜電位的損失，降低人工老化對(duì)種子活力的影響。

本試驗(yàn)中，蒙古黃芪種子經(jīng)人工老化后，其活性氧含量升高，線粒體膜電位下降，種子活力大幅下降，而經(jīng)90mol/L CsA預(yù)處理的種子，其活性氧含量減少，線粒體膜電位有所提高，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指標(biāo)顯著高于蒸餾水處理的種子，可能是因?yàn)镃sA抑制了MPTP開(kāi)放，減少了細(xì)胞色素c和其他凋亡因子的釋放，減輕了種子老化過(guò)程中線粒體結(jié)構(gòu)與功能的損傷，保證了ATP的供應(yīng)，在一定程度上抑制了細(xì)胞凋亡，使種子活力下降速度減緩。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，蒙古黃芪種子老化后其活性氧含量增加，線粒體膜電位下降，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)降低。采用適宜濃度的NAC和CsA預(yù)處理蒙古黃芪種子，可以減少種子老化過(guò)程中活性氧的積累，抑制線粒體膜電位下降，增加種子抗老化能力，提高種子活力。