楊曉麗，劉 里，丁夢(mèng)娜，王秀連

(曲靖師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

白及[1]味苦、甘澀、性微寒，是應(yīng)用歷史悠久的藥食同源類中藥.白及具有清熱利濕、收斂止血、消腫生肌等功效，可治療肺傷咳血、外傷、胃及消化道潰瘍出血、燙火灼傷、皮膚皸裂等病癥[2-3].白及也是一種良好的天然生物工程材料，無毒副作用、安全舒適、可降解、無污染.另外，白及還有減少刺激、保護(hù)皮膚、美白、延緩衰老等功效[4].白及主要功能性成分是多糖[5]，其他主要化學(xué)成分還包括聯(lián)芐、菲衍生物，還含有少量的揮發(fā)油和粘液質(zhì)[1].

已有文獻(xiàn)考察了加水量、浸泡時(shí)間、水浴溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、醇沉濃度對(duì)白及多糖提取的影響[6-7].為了縮短提取時(shí)間，提升提取品質(zhì)和效率，也嘗試將超聲[8-11]、酶解[12]、堿提[13]、微波協(xié)同技術(shù)[14]用于提取白及多糖.常用單因素[2]、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]、響應(yīng)曲面法[6]探究白及多糖的最佳提取方案.單因素法對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)孤立分析，簡單直接，但無法獲得參數(shù)間相互影響信息；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)逐個(gè)水平進(jìn)行分析，探討參數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響；響應(yīng)曲面法在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)的過程中可以連續(xù)分析并給出直觀圖形，克服了單因素和正交試驗(yàn)的孤立性[15].

微波提取技術(shù)具有提取效率高、節(jié)省時(shí)間、節(jié)省溶劑、節(jié)能、污染小等優(yōu)點(diǎn)[16].近年微波提取技術(shù)逐漸用于多種藥物、食品中多糖的提取[17-23].直接用微波提取白及多糖的報(bào)道較少.本文探討了微波樣品制備儀在提取白及多糖中的應(yīng)用，并采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波提取工藝.

1 材料與方法

1.1 材料

白及塊莖來自于曲靖某農(nóng)業(yè)公司，將新鮮塊莖用清水洗凈，切片，60℃鼓風(fēng)干燥箱烘干，中藥粉碎機(jī)粉碎，制樣機(jī)制樣，過80目篩.使用前60℃鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒重，置于干燥器中備用.

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Multi-wave PRO 微波樣品制備儀：安東帕；紫外可見分光光度計(jì)：瓦里安 cary50；電子天平：奧豪斯AR224CN；超聲波清洗器：昆山超聲KQ3200B；電熱鼓風(fēng)干燥箱：恒科DHG-9245A；高速中藥粉碎機(jī)：百信 LG-100；數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華 HH-4；離心機(jī)：凱達(dá) TD5A；制樣粉碎機(jī)：開元 5E-PCIX100.

1.2.2 試劑

苯酚(重蒸)，濃硫酸，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，無水乙醇.

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

精確稱取混勻的白及塊莖粉末0.2000g，加入一定的水做提取劑，震蕩混勻樣品；在設(shè)定的參數(shù)下采用微波樣品制備儀進(jìn)行多糖的提取；4000r / min離心10min得多糖提取液.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照國標(biāo)SNT4260-2015中的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.3 多糖物質(zhì)含量的測定

精確移取2mL提取液，加入1mL 5g/L 淀粉酶，在60℃恒溫水浴中水解1h，加入12mL無水乙醇，將多糖沉淀析出.4000r/min離心10min得多糖.用水溶解多糖并定容至50mL得待測液.取0.5mL待測液用國標(biāo)SNT4260-2015中硫酸苯酚法進(jìn)行顯色反應(yīng)，并以淀粉酶為空白在490nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得待測液濃度并計(jì)算多糖提取率.

1.3.4 微波樣品制備儀參數(shù)設(shè)定

結(jié)合儀器溫度波動(dòng)范圍、儀器的壓力等要求，multi-wave PRO 微波樣品制備儀參數(shù)設(shè)置如表1.

表1 微波樣品制備儀的參數(shù)設(shè)定

2 結(jié)果與討論

所有實(shí)驗(yàn)均平行測定三次，結(jié)果為平均值.

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線與換算因子

實(shí)驗(yàn)測得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=0.079289c-0.004988(相關(guān)系數(shù)r=0.9983)，A—吸光度、c—濃度(單位mg/L).回歸分析結(jié)果表明，在2.8～14mg/L范圍內(nèi)葡萄糖的質(zhì)量濃度和吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系.按照國標(biāo)SNT4260-2015中的方法取多糖換算因子f=0.9.

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)白及塊莖多糖提取的影響

固定功率100W、時(shí)間7min，液料比75～175mL/g，考察液料比對(duì)白及塊莖多糖提取效果影響，結(jié)果見圖2.

圖2 液料比對(duì)白及塊莖多糖提取影響

從圖2可見，隨著液料比增大，多糖提取率先提高后降低，整體波動(dòng)在24.5%～26%范圍內(nèi)，波動(dòng)幅度不大.推測液料比對(duì)白及塊莖多糖提取影響較小.當(dāng)液料比為75mL/g時(shí)，雖然由于多糖類物質(zhì)的粘性可以使白及很好地分散和懸浮，但是當(dāng)溫度升高時(shí)，白及粉末易黏附在容器壁上，使得提取不完全.當(dāng)液料比大于125mL/g后，提取液較稀，不易發(fā)生黏附容器的現(xiàn)象，但溶液的粘度降低，使白及粉末的分散性不好，易沉于底部，使多糖溶出受限.當(dāng)液料比為100mL/g時(shí)，白及塊莖多糖提取率最高.

2.2.2 微波功率比對(duì)白及塊莖多糖提取的影響

固定微波時(shí)間7min、液料比100mL/g，微波功率50～150W，考察微波功率對(duì)白及塊莖多糖提取效果影響，結(jié)果見圖3.

從圖3可見，隨著微波功率從75W增大到100W，白及塊莖多糖提取率快速提高而后降低.微波功率改變使得多糖提取率在21.5%～26%之間波動(dòng)，波動(dòng)范圍較大.推測微波功率對(duì)多糖提取率影響較大.當(dāng)微波功率為50W時(shí)，7min后提取液升溫至64℃，微波功率和提取液溫度均低，多糖溶出慢，提取率低.當(dāng)微波功率為75W時(shí)，7min后提取液升溫至83℃，多糖快速溶出.而當(dāng)微波功率大于100W時(shí)，微波對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞作用突出，使得多糖提取率降低.當(dāng)微波功率為100W時(shí)，白及塊莖多糖提取率最高.

圖3 微波功率對(duì)白及塊莖多糖提取影響

2.2.3 微波時(shí)間比對(duì)白及塊莖多糖提取的影響

固定微波功率100W、液料比100mL/g，考察微波功率對(duì)白及塊莖多糖提取效果影響，結(jié)果見圖4.

圖4 微波時(shí)間對(duì)白及塊莖多糖提取影響

微波時(shí)間5min內(nèi)，多糖提取率提升并不明顯.考察提取液溫度，3min后提取液溫度升高至58℃，5min后提取液溫度升高至83℃，之后微波時(shí)間的延長提取液都恒定在85℃.結(jié)合多糖提取率變化，發(fā)現(xiàn)溫度提升范圍內(nèi)，多糖溶出增多但不快速.提取液溫度穩(wěn)定在85℃后，多糖開始快速溶出.當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到15min后，雖然提取液達(dá)到設(shè)定溫度使得微波功率衰減，但微波對(duì)多糖的破壞作用開始突顯，使得多糖提取率降低.

2.3 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析

選擇微波功率、微波時(shí)間、提取液料比(mL/g)三個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù).采用Box-Behnken模型設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案，表2中給出了各實(shí)驗(yàn)參數(shù)的高、中、低水平.

表2 微波樣品制備儀提取白及塊莖多糖實(shí)驗(yàn)參數(shù)水平及編碼

采用MATLAB對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析.

2.4 模型的擬合

根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果(表3)，得到相應(yīng)的二次擬合方程：

提取率Y/%=22.6689+0.7312A-0.01716B-0.01765C-0.01079A2+0.001391AB-0.004301AC-0.0002982B2+0.0005832BC-0.0000438C2

擬合模型方差分析結(jié)果見表4.從擬合模型方差分析結(jié)果可見，試驗(yàn)選用的模型極顯著(p=0.0001)，失擬不顯著p=0.3816，說明擬合模型恰當(dāng).模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9924.根據(jù)擬合模型失擬性分析可知所建立的三元二次回歸方程擬合度較好，可以用于提取條件的估算.

表3 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 中心組合設(shè)計(jì)二次擬合模型方差分析

擬合模型中各回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果列于表5.

表5 二次擬合模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

擬合模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，各項(xiàng)因素均達(dá)到顯著水平，說明實(shí)驗(yàn)參數(shù)均可以顯著影響提取率.

2.5 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的交叉影響

多元二次擬合方程所得的響應(yīng)曲面圖及對(duì)應(yīng)等高線圖，見圖5～7.據(jù)此分析兩因素的交互影響.

根據(jù)圖5a可見，在7～11min范圍內(nèi)，隨著微波時(shí)間的延長多糖提取率快速提高，隨后提升緩慢.當(dāng)微波時(shí)間和液料比確定的時(shí)候，微波功率提高使得多糖提取率略提高.從等高線圖可見，微波功率較高使多糖提取率先提高后降低，可以在較短的時(shí)間范圍內(nèi)使多糖提取率提高，這是因?yàn)檩^強(qiáng)微波功率可以使得提取液溫度快速升高到85℃，實(shí)現(xiàn)多糖快速溶出.當(dāng)提取液溫度升高到85℃后，微波功率會(huì)出現(xiàn)衰減，多糖溶出變慢.當(dāng)微波時(shí)間過長的時(shí)候，微波對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞作用將突顯，使得溶出的多糖量反而減少.微波功率低于75W時(shí)，多糖溶出較慢且容易因?yàn)槲⒉〞r(shí)間較長使得破壞作用突出.微波功率高于120W，也容易破壞多糖結(jié)構(gòu).

圖5 微波時(shí)間與微波功率交互影響的響應(yīng)曲面圖(a)和等高線圖(b)

由圖6a知，微波功率恒定時(shí)，液料比提高使得多糖提取率略有降低；隨著微波時(shí)間的延長，多糖提取率得到提升.觀察提取液，推測較小的液料比使得提取液粘稠，白及均勻分散，有利于多糖溶出.微波前期使得多糖快速溶出，之后再對(duì)提取液進(jìn)行微波提取，使得提取出來的多糖結(jié)構(gòu)被破壞.當(dāng)微波功率較小時(shí)，微波時(shí)間的延長對(duì)多糖的溶出有明顯促進(jìn)作用.由圖6b可見，較小的液料比有利于多糖提取.而液料比較大時(shí)，白及易沉淀在底部，不利于多糖溶出，即使延長微波時(shí)間也不能使多糖充分溶出.

圖6 微波時(shí)間與液料比交互影響的響應(yīng)曲面圖(a)和等高線圖(b)

圖7a表明，微波時(shí)間恒定為10min時(shí)，液料比的減小和微波功率的增加都會(huì)使多糖提取率出現(xiàn)小幅度提高，等高線也說明了這一點(diǎn).等高線圖還表明較小的液料比結(jié)合較低的微波功率有利于多糖的溶出.

圖7 微波功率與液料比交互影響的響應(yīng)曲面圖(a)和等高線圖(b)

對(duì)比圖5～7可見，微波時(shí)間的改變使得響應(yīng)曲面變化幅度最大，說明微波時(shí)間長短對(duì)多糖提取影響最顯著；微波功率影響居中；液料比的影響最小.較低的液料比、適當(dāng)增加的微波功率和微波時(shí)間有利于白及多糖提取率的提高.

根據(jù)擬合曲線的優(yōu)化結(jié)果，確定最優(yōu)提取參數(shù)為微波時(shí)間15min、液料比75mL/g、微波功率100W，理論計(jì)算提取率為27.06%.用此參數(shù)進(jìn)行5次平行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)提取率為(27.10±0.10)%，與預(yù)測值吻合.文獻(xiàn)表明白及中多糖回流提取需要2.5～3小時(shí)[6]，酶解提取需要82min[12]，超聲提取需要50min[9]，而本文采用微波提取僅需要15min.這也說明了微波技術(shù)可以更快速提取白及多糖.

為了考察微波快速提取白及塊莖多糖的效率，應(yīng)用最優(yōu)提取參數(shù)進(jìn)行三次提取，混合三次提取液，測定三次提取多糖總含量.平行測定三次，多糖提取率結(jié)果為：(28.43±0.22)%.一次即可提取出約95%的多糖.和文獻(xiàn)報(bào)道的需要2～3次的提取[7]相比，微波提取一次即可提取完全，提取效率高.

3 結(jié) 論

用微波樣品制備儀對(duì)白及塊莖中的多糖進(jìn)行快速提取.通過響應(yīng)曲面得出微波時(shí)間、微波功率、液料比3個(gè)因素對(duì)多糖提取的影響主次順序?yàn)椋何⒉〞r(shí)間﹥微波功率﹥液料比.確定微波提取的最佳工藝為：微波時(shí)間15min、微波功率100W、液料比75mL/g.在此條件下多糖提取率達(dá)(27.10±0.10)%.一次可提取出約95%的多糖.結(jié)果表明微波樣品制備儀用于白及塊莖多糖提取方便快捷、提取時(shí)間短、效率高，是一種理想的提取方法.