呂樹(shù)泉 張淑芳 王元松 蘇秀海

(河北中醫(yī)學(xué)院附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌糖尿病科，河北 滄州 061001)

糖尿病腎病是糖尿病臨床上常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其主要特征表現(xiàn)為腎小球肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚、腎小管間質(zhì)纖維化等，糖尿病腎病是導(dǎo)致腎衰竭的重要原因〔1〕。有研究表明，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與多種細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激等因素有關(guān)。臨床上通常以藥物進(jìn)行治療，西藥起效快，但西藥會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同程度的損傷〔2〕。中藥歷史悠久，對(duì)于糖尿病腎病的治療有重要意義，有學(xué)者認(rèn)為，健脾固腎化瘀湯有降低血清三酰甘油、總膽固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、α-金屬硫蛋白(MT)-1、α-肌動(dòng)蛋白(SMA)、微管輕鏈Ⅰ蛋白3-Ⅱ型(LC3-Ⅱ)、Beclin等指標(biāo)水平的作用,對(duì)腎組織病理改變有改善和保護(hù)作用〔3〕。因此本研究運(yùn)用健脾固腎化瘀湯對(duì)糖尿病腎病大鼠進(jìn)行治療，為臨床上健脾固腎化瘀湯的應(yīng)用提供了新的循證參考。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：選取SPF級(jí)60只SD健康大鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào)：11401300065459，單位許可證號(hào)：SYXK(津)2014-0002，鼠齡(3.9±0.3)個(gè)月，體重(227.7±10.8)g。所有大鼠養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間1 w。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：健脾固腎化瘀湯(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)；大鼠抗小鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1 mRNA抗體(北京百奧萊博科技有限公司)；兔抗小鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)抗體、C-C型趨化因子配體(CCL)5 試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)；人抗大鼠腎小球足細(xì)胞裂隙膜蛋白(podocin)抗體(廈門研科生物技術(shù)有限公司)；大鼠抗兔腎小球足細(xì)胞nephin mRNA抗體及兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抗體(上?？泼羯锟萍加邢薰?；超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組、建模及給藥 隨機(jī)選取60只大鼠中10只作為正常組，剩余50只大鼠采用鏈脲佐菌素(STZ)〔4〕誘導(dǎo)建立糖尿病腎病大鼠模型，造模前，所有大鼠禁食12 h，腹腔一次性注射STZ(65 mg/kg)，STZ使用枸櫞酸鈉緩沖液(0.1 mol/L,pH=4.5)進(jìn)行配制，須在10 min內(nèi)使用完；72 h后，取尾靜脈血測(cè)空腹血糖(FPG)，連續(xù)3次，取其平均值，當(dāng)FPG>16.7 mmol/L提示造模成功，成功率為70%，去除未成功建模大鼠。建模成功后，均在12 h后開(kāi)始給藥，雷米普利組使用雷米普利片進(jìn)行灌胃，0.001 g/kg，1次/d；健脾固腎化瘀湯是由黃芪、西洋參、白術(shù)、山藥、芡實(shí)、金櫻子、山茱萸、熟地黃、當(dāng)歸、丹參、水蛭、茯苓、酒大黃組成，按比例加入純凈水制成混懸液，然后對(duì)低、中、高劑量組進(jìn)行灌胃處理，1次/d，使用劑量分別為：1.9 g/kg、3.8 g/kg、7.6 g/kg；正常組與模型組以同等劑量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)8 w。

1.2.2樣本采集 所有大鼠在給藥8 w后，靜脈采血后處死，離心半徑5 cm、3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80℃保存，待用。

1.2.3切片及染色 取腎臟組織，4%多聚甲醛固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、蘇木素-伊紅(HE)染色，之后脫水、透明，切片厚度為4 μm，待封片晾干后在顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.2.4生物化學(xué)檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)尿素、肌酐、三酰甘油、總膽固醇進(jìn)行檢測(cè)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)24 h尿蛋白進(jìn)行檢測(cè)，取50 mmol/L碳酸鹽緩沖液對(duì)24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP進(jìn)行稀釋，加入聚苯乙烯的反應(yīng)孔中，加蓋處理后，在4℃下置留24 h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液(pH值為7.4，0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋待測(cè)標(biāo)本0.1 ml，加入陽(yáng)性、陰性對(duì)照標(biāo)本，在42℃下置留60 min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP抗體0.1 ml，再次置留60 min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸)混勻，且加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L H2SO40.05 ml放置各孔內(nèi)，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450，分析24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP水平。采用羅氏Accu-Chck血糖檢測(cè)儀對(duì)FPG進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)檢測(cè) RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照定量PCR儀的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。依次加入2.5 μl稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5 μl MgCl2溶液，0.5 μl上游引物和下游引物，最后加水配成總體積25 μl的反應(yīng)體系。94℃ 1 min；55℃ 1 min；72℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，重復(fù)最少3次。采用2-△△Ct方法計(jì)算出需要檢測(cè)的IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)水平。IGF-1 mRNA引物序列：上游cDNA 為模板、GAPDH 為內(nèi)參照，用以下引物(上游:5′-CCAGTCACATCCTCCTCG-3′；下游：5′-TACATCTCCAGCCTCCTCA-3′)；nephrin mRNA引物序列：上游cDNA 為模板、GAPDH 為內(nèi)參照，用以下引物(上游:5′-CCCTGCCTCTGTCTTCTCTG-3′；下游：5′-GGTGGTCTTCTGCTGCTCTC-3′)。

1.2.6CTGF、podocin、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè) 使用免疫組化染色對(duì)CTGF、podocin、NF-κB蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，將二甲苯更換放置10 min后進(jìn)行酒精水化，加入蛋白酶修復(fù)液，進(jìn)行孵化30 min，溫度為：37℃，棄抗原；將切片移至濕盒中，加入3%H2O2，恒溫冰箱孵育10 min，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗；再次加入山羊血清，常溫下封閉30 min，使用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，再次加入二抗，孵育1 h，進(jìn)行PBS沖洗，經(jīng)過(guò)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色處理10 min，觀察棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)，采用PBS沖洗1 min；使用蘇木素染色3 min，使用濃度為1%的鹽酸乙醇進(jìn)行分化處理，使用自來(lái)水沖洗1 min，脫水、封片處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 與正常組相比，模型組腎小球血管壁狹窄，腎小球上皮細(xì)胞變性，腎小管周圍明顯炎癥侵蝕；雷米普利組腎小管血管壁有所改善，仍伴有炎性細(xì)胞；低、中、高劑量組腎組織明顯改善，且高劑量組最為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組腎組織病理組織學(xué)觀察(HE，×400)

2.2各組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平比較 與正常組相比，其余各組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，雷米普利組、低劑量組、中劑量組、高劑量組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平均顯著降低(P<0.05)；與雷米普利組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白水平比較

2.3各組FPG、CCL5、hs-CRP水平比較 與正常組相比，其余各組FPG、CCL5、hs-CRP水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，雷米普利組、低劑量組、中劑量組、高劑量組FPG、CCL5、hs-CRP水平均顯著降低(P<0.05)；與雷米普利組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組FPG、CCL5、hs-CRP水平均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組FPG、CCL5、hs-CRP水平比較

2.4各組腎皮質(zhì)IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)水平比較 與正常組相比，其余各組IGF-1 mRNA水平顯著升高，而nephrin mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，雷米普利組、低劑量組、中劑量組、高劑量組IGF-1 mRNA水平顯著降低，而nephrin mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與雷米普利組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組IGF-1 mRNA水平均顯著降低，而nephrin mRNA水平均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表3。

1～6：正常組，模型組，雷米普利組，低劑量組，中劑量組，高劑量組圖2 RT-PCR檢測(cè)各組IGF-1 mRNA、nephrin mRNA的表達(dá)

表3 各組腎皮質(zhì)IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表達(dá)水平比較

2.5各組CTGF、podocin、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 與正常組相比，其余各組CTGF、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高，而podocin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，雷米普利組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CTGF、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低，而podocin蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與雷米普利組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組CTGF、NF-κB蛋白水平顯著降低，而podocin蛋白水平顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 各組腎組織中CTGF、podocin、NF-κB免疫組化染色(DAB，×400)

表4 各組CTGF、podocin、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

糖尿病腎病是導(dǎo)致腎衰竭的主要原因之一，其病情隱匿，早期無(wú)明顯癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)，已進(jìn)入臨床期，主要表現(xiàn)為蛋白尿、漸進(jìn)性腎功能損害、高血壓、等病理特征〔5〕。其發(fā)病機(jī)制尚不明確。中醫(yī)上將其歸為“水腫”“尿濁”等范疇，遷延日久，導(dǎo)致陰陽(yáng)兩虛，脾腎衰弱〔6〕。早期糖尿病腎病病位在脾，脾氣虧虛，機(jī)體失養(yǎng)則疲倦乏力，脾虛日久，后天失養(yǎng)，累及先天，腎氣虧虛則小便短少，或夜尿頻多；脾腎氣虛，固攝失權(quán)，精微漏出，則尿濁〔7〕。

健脾固腎化瘀湯重用黃芪，味苦甘，性微溫，益氣健脾，消腫利尿，補(bǔ)諸虛不足，補(bǔ)齊力強(qiáng)且能生陽(yáng)；西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰；熟地黃、山茱萸、山藥均有補(bǔ)虛益腎之用；芡實(shí)、金櫻子、五味子固精益腎；白術(shù)益氣健脾，茯苓利水淡滲，兩者合用，能夠利水濕從小便去；當(dāng)歸養(yǎng)血活血；丹參、酒大黃、水蛭能活血化瘀〔8〕。全方諸藥使用，標(biāo)本兼顧，共奏健脾固腎、化瘀通絡(luò)之功。

FPG主要用于檢測(cè)血糖濃度〔9〕。CCL5是一種分泌性蛋白，屬于CC家族中的一員，且參與調(diào)節(jié)免疫的過(guò)程。CCL5在多個(gè)細(xì)胞中均有表達(dá)，其中包括脂肪細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞、血小板等〔10〕。hs-CRP是一種急性相反應(yīng)蛋白，主要通過(guò)肝細(xì)胞分泌，并且受多種炎性因子的調(diào)控和誘導(dǎo)〔11〕。有研究表明，hs-CRP炎性反應(yīng)時(shí)，可通過(guò)促進(jìn)尿蛋白漏出增加糖尿病腎病的發(fā)生。hs-CRP不僅能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，還是炎癥反應(yīng)的重要生化指標(biāo)〔13〕。本研究結(jié)果說(shuō)明健脾固腎化瘀湯可一定程度減輕糖尿病腎病大鼠炎性因子水平，降低血糖，且呈劑量依賴。

IGF-1能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，且能促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖等。研究表明IGF-1是一種有代謝效應(yīng)的細(xì)胞因子，并且在生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用〔14,15〕。在糖尿病腎病中，高血糖致使細(xì)胞嚴(yán)重缺氧損傷，導(dǎo)致腎臟局部IGF-1旁分泌增高，降解減少，從而導(dǎo)致IGF-1水平升高。IGF-1還能通過(guò)誘導(dǎo)腎臟激肽釋放酶激活，致使腎小球血流改變。nephrin屬于腎小球的濾過(guò)屏障，其一共分為3層，是最早發(fā)現(xiàn)的一種裂孔隔膜蛋白，能維持關(guān)鍵裂空隔膜蛋白分子，是檢測(cè)腎小球損傷的重要標(biāo)志物〔16，17〕。本研究結(jié)果說(shuō)明健脾固腎化瘀湯在一定程度上可改善糖尿病腎病大鼠IGF-1、nephrin的表達(dá)，效果顯著，且呈劑量依賴。

CTGF廣泛存在于體內(nèi)，在各個(gè)器官和細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，但廣泛存在于腎組織中，生理狀態(tài)下，腎小球分泌較少的CTGF，但在機(jī)體出現(xiàn)纖維化時(shí)，其水平會(huì)顯著升高〔18〕。CTGF能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和成纖維細(xì)胞的聚集等，促進(jìn)膠原和黏蛋白的合成。podocin是一種跨膜蛋白，是Sto-matin家族的一員，主要存在于腎組織中〔19〕。NF-κB是一種與炎癥作用產(chǎn)生、細(xì)胞增生和細(xì)胞凋亡等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB的活化能夠使細(xì)胞因子和外基質(zhì)上調(diào)。NF-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)綠因子，是由p50和p65兩個(gè)多肽鏈組成。當(dāng)細(xì)胞靜息條件下，其處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，IκB與NF-κB迅速分離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，參與基因轉(zhuǎn)錄，因此在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用〔20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明健脾固腎化瘀湯可在一定程度上改善糖尿病腎病大鼠CTGF、podocin、NF-κB表達(dá)，效果顯著，且呈劑量依賴。

綜上，健脾固腎化瘀湯有降低尿素氮、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白定量、CCL5、hs-CRP等水平的作用，對(duì)腎組織病理改變有改善和保護(hù)作用。