吳成武 王偉 湯休書 張凱

(黔西南州中醫(yī)院骨傷科，貴州 興義 562400)

骨關節(jié)炎是一種以關節(jié)軟骨損傷為主要病變的慢性關節(jié)疾病，多發(fā)生于中老年人群，嚴重危害患者健康。目前，臨床常采用非甾體抗炎藥治療骨關節(jié)炎，但其有較多副作用，如引起胃腸消化道出血、心血管疾病等〔1,2〕。研究顯示，天然植物化學物因有安全、高效、副作用較小等優(yōu)點在骨關節(jié)炎的治療中有潛在的應用前景〔3〕。徐長卿丹皮酚是中藥徐長卿的主要活性成分之一，與非甾體抗炎藥有相似的藥理作用，有鎮(zhèn)痛、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等功效〔4〕。研究顯示，徐長卿丹皮酚可抑制骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡〔5〕，緩解痛風性關節(jié)炎〔6〕。目前，還未有徐長卿丹皮酚影響骨關節(jié)炎軟骨細胞作用機制的相關報道。研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路在調節(jié)軟骨細胞、維持軟骨基質健康等方面起重要作用，與骨關節(jié)炎的發(fā)病機制存在密切聯(lián)系〔7〕。本研究通過白細胞介素(IL)-1β誘導體外分離培養(yǎng)的大鼠軟骨細胞，探討徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞損傷的影響及其是否通過調控Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1細胞和實驗試劑 雄性SD大鼠：8周齡，質量160～220 g，健康清潔級購自北京維通利華公司，合格證號SCXK(京)2018-0006；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶公司；酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、酶切caspase-9、Wnt和β-catenin抗體均購自美國Cell Signaling公司；基質金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-9和MMP-13抗體均購自福州邁新生物技術有限公司；性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)-9和二型膠原蛋白(Col-Ⅱ)抗體均購自美國Santa Cruz公司；干擾素(IFN)-γ、IL-6和IL-8試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗方法

1.2.1軟骨細胞分離和培養(yǎng) 參照文獻方法分離培養(yǎng)大鼠軟骨細胞〔8〕。SD大鼠脫頸椎處死，碘伏乙醇消毒，暴露膝關節(jié)，用刀刮取表面軟骨，手術剪剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，采用酶消化法分離培養(yǎng)軟骨細胞。原代軟骨細胞分離后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、置于37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)7 d后，進行換液處理，此后每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。細胞融合至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細胞分組處理 軟骨細胞分為對照(NC)組：正常培養(yǎng)24 h；IL-1β組：10 μg/L〔8〕的IL-1β作用軟骨細胞24 h；低劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組：10 μg/L的IL-1β與60 μg/ml徐長卿丹皮酚共同作用24 h；中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組：10 μg/L的IL-1β與120 μg/ml徐長卿丹皮酚共同作用24 h；高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組：10 μg/L的IL-1β與180 μg/ml徐長卿丹皮酚共同作用24 h；徐長卿丹皮酚+IL-1β+Wnt/β-catenin信號通路激活劑(LiCl)組：20 μmol/L〔9〕LiCl作用24 h后，10 μg/L的IL-1β與120 μg/ml徐長卿丹皮酚共同作用24 h。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 取第4代對數(shù)生長期的軟骨細胞，以每孔1×104個接種于24孔細胞培養(yǎng)板中。細胞貼壁后，按照上述分組處理。培養(yǎng)結束后，收集細胞培養(yǎng)上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。胰酶消化細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明，分別取各組1.0×106個細胞，加入400 μl結合緩沖液，細胞混懸后，加入10 μl Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min。然后再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μl結合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測。

1.2.4Western印跡法檢測蛋白表達 細胞分組和處理同1.2.3。培養(yǎng)結束后，收集細胞，加入RIPA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白。使用BCA對蛋白定量后，取適量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，濕轉至硝酸纖維素膜，置于5%脫脂牛奶中進行封閉，時間1 h。加入一抗，4℃孵育過夜。再加入辣根過氧化酶標記的二抗IgG，室溫孵育1 h。加入ELC顯影液，避光顯影。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IFN-γ、IL-6和IL-8水平 取1.2.3中保存的各組細胞培養(yǎng)上清液，3 500 r/min離心10 mim，分別參照IFN-γ、IL-6和IL-8試劑盒操作說明，檢測細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-6和IL-8水平。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較，低、中、高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均顯著降低(均P<0.05)。與低劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組比較，中、高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均顯著降低(P<0.05)；而中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組和高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組上述指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表1、圖2。

圖1 流式細胞術檢測軟骨細胞凋亡

2.2徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥因子分泌的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細胞IFN-γ、IL-6和IL-8水平均顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較，低、中、高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細胞IFN-γ、IL-6和IL-8水平均顯著降低(均P<0.05)。與低劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組比較，中、高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組IFN-γ、IL-6、IL-8水平均顯著降低(P<0.05)；中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組和高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組上述指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞IFN-γ、IL-6、IL-8及凋亡的影響

2.3中劑量徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞MMP和Col-Ⅱ表達的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細胞SOX-9和Col-Ⅱ表達均顯著降低(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表達均顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較，中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細胞SOX-9和Col-Ⅱ表達均顯著升高(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表達均顯著降低(均P<0.05)。見圖3和表2。

1～5:NL組，IL-1β組,低劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組,中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組,高劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組圖2 Western印跡檢測軟骨細胞酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白的表達

1～3：NC組、IL-1β組、中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組；圖4同圖3 Western印跡檢測軟骨細胞SOX-9、Col-Ⅱ、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達

表2 中劑量徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞Wnt-β-catenin信號通路、MMP和Col-Ⅱ表達的影響

2.4中劑量徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞Wnt-β-catenin信號通路的影響 與NC組比較，IL-1β組軟骨細胞Wnt1和β-catenin蛋白表達均顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較，中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組軟骨細胞Wnt1和β-catenin蛋白表達均顯著降低(均P<0.05)。見表2和圖4。

圖4 Western印跡檢測軟骨細胞Wnt1和β-catenin表達

2.5Wnt-β-catenin信號通路激活劑對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響 與中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組比較，徐長卿丹皮酚+IL-1β+LiCl組軟骨細胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)，IFN-γ、IL-6和IL-8炎性因子表達均顯著升高(均P<0.05)。見圖5和表3。

表3 Wnt-β-catenin信號通路激活劑和徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡、凋亡蛋白和炎癥因子分泌的影響

圖5 Western印跡檢測軟骨細胞酶切caspase-3蛋白和酶切caspase-9蛋白的表達

2.6Wnt-β-catenin信號通路激活劑和徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞MMP和ColⅡ表達的影響 與中劑量徐長卿丹皮酚+IL-1β組比較，徐長卿丹皮酚+IL-1β+LiCl組軟骨細胞SOX-9和Col-Ⅱ表達均顯著降低(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表達均顯著升高(均P<0.05)。見表4和圖6。

表4 Wnt-β-catenin信號通路激活劑和徐長卿丹皮酚對IL-1β誘導的軟骨細胞MMP和ColⅡ表達的影響

1,2：徐長卿丹皮酚+IL-1β組，徐長卿丹皮酚+IL-1β+Licl組圖6 Western印跡檢測軟骨細胞SOX-9、Col-Ⅱ、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達

3 討 論

隨著年齡的增長，骨關節(jié)炎的發(fā)病率呈上升趨勢，對中老年人的生命健康造成極大威脅〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，骨關節(jié)炎涉及到軟骨、滑膜釋放炎癥介質等過程，可導致MMP表達增多，最終引起軟骨細胞凋亡〔11〕。軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一的一種細胞，在調節(jié)胞外基質合成和降解、維持軟骨基質穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用〔12〕。IL-1β是一種致炎性細胞因子，可引起軟骨細胞退變，加速骨關節(jié)炎的病理進程〔13〕。研究顯示，徐長卿丹皮酚有抑制軟骨細胞凋亡及MMP-1表達的作用〔14〕，可治療骨關節(jié)炎，但其作用機制目前還未明確。

軟骨細胞外基質的丟失和異常重塑是骨關節(jié)炎的中心病理機制〔15〕。正常關節(jié)軟骨中，軟骨細胞的凋亡和增殖處于動態(tài)平衡。骨關節(jié)炎病變過程中，軟骨細胞凋亡增加，細胞外基質降解，進而引起關節(jié)軟骨的退行性病變〔16〕。caspase家族在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase-9是caspase級聯(lián)反應的啟動因子，而caspase-3是細胞凋亡執(zhí)行者，其活化后，細胞凋亡進入不可逆轉階段〔17〕。本研究說明IL-1β可加劇軟骨細胞凋亡，徐長卿丹皮酚可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡，延緩關節(jié)軟骨退變過程。

骨關節(jié)炎是一種慢性炎癥疾病，IL、IFN等炎性因子參與骨關節(jié)炎的發(fā)病過程，抑制軟骨細胞的炎癥反應有助于控制或減輕骨關節(jié)炎進展。正常關節(jié)中IFN-γ表達量極少，關節(jié)滑液和血清中IFN-γ表達越多，說明炎癥反應越嚴重〔18〕。IL-1β可促進IL-6等炎性因子的產(chǎn)生。陳亮等〔19〕研究顯示，骨關節(jié)炎患者血清中炎性因子IFN-γ、IL-6表達增加，可作為骨關節(jié)炎臨床診斷和治療的生物學指標。本研究結果表明IL-1β可增加軟骨細胞炎癥反應，徐長卿丹皮酚可能通過降低軟骨細胞炎癥因子的表達保護其免受損害。

骨關節(jié)炎軟骨細胞的顯著特征是既表達Col-Ⅱ和蛋白聚糖，又表達細胞肥大分化標記物如MMPs〔20〕。Col-Ⅱ是關節(jié)軟骨基質膠原的主要結構成分，約占膠原總量的90%。SOX-9是促進軟骨形成因子，參與骨骼系統(tǒng)發(fā)育，可增加軟骨細胞Col-Ⅱ的合成〔21〕。MMPs參與骨關節(jié)軟骨和基質的轉換過程。MMP-3在骨關節(jié)炎早期可降解Ⅸ型膠原，與骨關節(jié)炎早期膠原網(wǎng)絡水腫有關。MMP-9屬于明膠酶，可降解Col-Ⅱ。MMP-13是所有MMPs中最有效的Col-Ⅱ降解酶〔22〕。抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13等表達可有效抑制骨關節(jié)炎軟骨的降解，為骨關節(jié)炎的治療提供了新方向。本研究結果表明徐長卿丹皮酚可通過調控SOX-9、Col-Ⅱ及MMP的表達抑制軟骨降解。

Wnt/β-catenin信號通路是一條依賴Wnt細胞外信號和β-catenin核內信號發(fā)揮作用的信號通路，與軟骨基質代謝、關節(jié)軟骨去分化及軟骨細胞凋亡密切相關。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵調控因子，其表達過高可促進軟骨細胞凋亡，導致關節(jié)軟骨退變〔23〕。本研究結果表明Wnt/β-catenin信號通路信號通路被激活，徐長卿丹皮酚可抑制軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路的激活，徐長卿丹皮酚通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡、炎性因子及相關MMP的表達，并促進SOX-9和Col-Ⅱ蛋白表達，從而保護IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。

綜上，徐長卿丹皮酚可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路保護IL-1β誘導的軟骨細胞損傷，在骨關節(jié)炎治療中有一定的應用前景。