矯淑芹 林愛慶 李雪婷

(煙臺市牟平區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 1腦病科，山東 煙臺 264100；2心血管病科)

缺血性腦卒中將會導(dǎo)致局部腦組織及其功能的損害，其損害程度與缺血的時間長短有關(guān)〔1〕。因此，及時恢復(fù)腦組織的供血對缺血性腦卒中病人的恢復(fù)至關(guān)重要。但是再灌注可誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，引起神經(jīng)元損傷。因此，預(yù)防再灌注引起的神經(jīng)元損傷成為缺血性腦卒中研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前，再灌注引起的神經(jīng)元損傷的機(jī)制尚未得到充分闡明，需要進(jìn)一步尋找關(guān)鍵的調(diào)控因子，為臨床的治療和藥物研發(fā)提供分子靶點(diǎn)。

微小RNA(miRNAs)是一種長度為22個核苷酸左右的單鏈內(nèi)源性的RNA分子〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在調(diào)控腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及恢復(fù)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，是一種潛在的缺血性腦卒中治療靶點(diǎn)〔4～6〕。有研究發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血小鼠恢復(fù)供血后3 h，血液中miR-448的表達(dá)量就達(dá)到峰值，說明miR-448可能在腦缺血再灌注過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔7〕。另外，降低miR-448的表達(dá)可降低缺血再灌注引起的脊髓神經(jīng)元的凋亡〔8〕。盡管如此，尚無報(bào)道探討miR-448在腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡中的作用。本文擬通過構(gòu)建氧葡萄糖剝奪/再恢復(fù)(OGDR)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞模型，分析miR-448在OGDR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用及潛在機(jī)制，探討miR-448在腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。Trizol和SYBR GREEN qPCR Super Mix購自Invitrogen。CCK8試劑盒和膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天。Western印跡一抗及二抗購自Abcam。miR-448抑制劑(inhibitor)及陰性對照(NC)由蘇州吉瑪基因合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 SH-SY5Y細(xì)胞10%胎牛血清完全培養(yǎng)基中置于常氧條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置：95%的空氣，5%的CO2，37℃)。傳代首先用0.25%胰酶室溫下消化1 min，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，2～3 d傳代1 次。根據(jù)細(xì)胞的生長情況，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及OGDR模型構(gòu)建 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：按照Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑的說明進(jìn)行操作。OGDR模型構(gòu)建培養(yǎng)條件：待細(xì)胞貼壁后，將完全培養(yǎng)基換成Hank平衡鹽溶液(HBSS)，并置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置：94%的N2，1%的O2和5%的CO2，37℃)；培養(yǎng)4 h后，將HBSS換成完全培養(yǎng)基，并在常氧條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.3細(xì)胞分組 正常培養(yǎng)組：按照SH-SY5Y細(xì)胞正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。OGDR組：待細(xì)胞貼壁后，按照OGDR模型構(gòu)建條件培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染試劑+正常培養(yǎng)組(Ⅰ組)：添加轉(zhuǎn)染試劑后，按照SH-SY5Y細(xì)胞正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。NC預(yù)轉(zhuǎn)染+OGDR組(Ⅱ組)：使用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染NC后24 h，按照OGDR模型構(gòu)建條件培養(yǎng)。miR-448 inhibitor預(yù)轉(zhuǎn)染+OGDR組(Ⅲ組)：使用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-448 inhibitor后24 h，按照OGDR模型構(gòu)建條件培養(yǎng)。

1.2.4熒光定量PCR 按照Trizol常規(guī)方法提取各組細(xì)胞的總RNA；經(jīng)過去基因組和純度鑒定后，進(jìn)行RNA濃度測定；按照miRNA莖環(huán)引物的說明，取1 μg 總RNA，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行逆轉(zhuǎn)；按照SYBR GREEN qPCR Super Mix的說明進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用U6小核RNA作為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt的方法計(jì)算miR-448的相對表達(dá)量。miR-448的正向引物和反向引物序列分別為5′ TCGGCAGGTTGCATATGTAGGA 3′和5′ CTCAACTGGTGTCGTGGA 3′。U6小核RNA的正向引物和反向引物序列分別為5′ CTCGCTTCGGCAGCACA 3′ 和5′ AAC GCTTCACGAATTTGCGT 3′。

1.2.5CCK8檢測 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，接種在96孔板；按照細(xì)胞分組所述的方法進(jìn)行細(xì)胞處理；待處理結(jié)束后，每孔加入10 μl CCK8溶液；培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，接種在6孔板；按照細(xì)胞分組所述的方法進(jìn)行細(xì)胞處理；待處理結(jié)束后，胰酶消化細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min，4℃離心5 min收集細(xì)胞。加入100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，輕輕混勻；避光、室溫反應(yīng)10～15 min；加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液，混勻后放置于冰上，隨即流式細(xì)胞儀檢測，BD FACSDiva 8.0.1軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7Western印跡分析 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，接種在6孔板；按照細(xì)胞分組所述的方法進(jìn)行細(xì)胞處理；待處理結(jié)束后，加入RIPA裂解液提取總蛋白。根據(jù)蛋白濃度測定的結(jié)果，計(jì)算每孔的蛋白上樣量；每孔加入30 μg的總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白；半干法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)；5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入稀釋好的二抗4℃孵育過夜；第2天，TBST緩沖液洗去多余的一抗，加入稀釋好的二抗，室溫孵育40 min后，TBST緩沖液洗去多余的二抗；暗室內(nèi)，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液，使用X-ray曝光。利用Image Pro-Plus6.0軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-448在OGDR處理的SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá) OGDR組細(xì)胞存活率為(50.46±4.54)%，與正常培養(yǎng)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(100.00±2.00)%;t=17.3，P<0.000 1〕，說明模型構(gòu)建成功。熒光定量PCR的結(jié)果顯示，miR-448的表達(dá)水平在OGDR組的SH-SY5Y細(xì)胞中顯著升高(8.49±0.97 vs 1.00±0.06;t=13.41，P=0.000 2)，表達(dá)水平為正常組的8.49倍。

2.2miR-448 inhibitor抑制miR-448表達(dá)驗(yàn)證 與NC組相比，miR-448 inhibitor組SH-SY5Y細(xì)胞中miR-448的表達(dá)水平顯著降低(0.99±0.06 vs 0.17±0.07;t=15.66，P<0.000 1)。miR-448 inhibitor對SH-SY5Y細(xì)胞中miR-448表達(dá)的抑制率為83%，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3抑制miR-448表達(dá)對OGDR處理的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響 與Ⅰ組相比，Ⅱ組的細(xì)胞存活率顯著降低〔(100.00±4.00)% vs (50.13±5.63)%,P<0.05〕。Ⅲ組的細(xì)胞存活率顯著高于Ⅱ組〔(70.25±2.00)%,P<0.05〕。

2.4抑制miR-448表達(dá)對OGDR處理的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡水平的影響 如圖1，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的細(xì)胞凋亡率顯著升高〔(6.50±0.79)% vs (38.11±4.26)%,P<0.05〕，Ⅲ組細(xì)胞凋亡率顯著低于Ⅱ組〔(16.67±1.62)%,P<0.05〕。與Ⅰ組相比，Ⅱ組Bax表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2的表達(dá)明顯降低。與Ⅱ組相比，Ⅲ組的細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2的表達(dá)明顯升高。見表1、圖1、圖2。

表1 各組Bax、Bcl-2、SIRT1蛋白表達(dá)

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡水平

圖2 Western印跡檢測Bax和Bcl-2的表達(dá)

2.5miR-448靶基因SIRT1在OGDR處理的SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá) 如圖3所示，與正常培養(yǎng)組(3.15±0.06)相比，miR-448靶基因SIRT1在OGDR組中的表達(dá)水平明顯降低(1.54±0.11，P<0.05)。

圖3 Western印跡檢測OGDR組SH-SY5Y細(xì)胞中miR-448靶基因SIRT1的表達(dá)水平結(jié)果

2.6抑制miR-448表達(dá)對OGDR處理的SH-SY5Y細(xì)胞中miR-448靶基因SIRT1表達(dá)的影響 如圖4所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組miR-448靶基因SIRT1的表達(dá)水平明顯降低。與Ⅱ組相比，Ⅲ組miR-448靶基因SIRT1的表達(dá)水平明顯升高。見表1、圖4。

圖4 Western印跡檢測抑制miR-448表達(dá)對OGDR處理的SH-SY5Y細(xì)胞中miR-448靶基因SIRT1表達(dá)的影響

3 討 論

作為內(nèi)源性非編碼RNA的一種，miRNAs在腦血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用〔4，9〕。如let-7、miR-224-3p和miR-155在腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔10～12〕。但miRNAs家族龐大，仍有眾多的miRNAs的功能尚未得到充分的闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-448在OGDR處理的SH-SY5Y細(xì)胞中明顯高表達(dá)。SH-SY5Y細(xì)胞是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤來源的細(xì)胞系，常被用來體外模擬神經(jīng)細(xì)胞的缺血再灌注〔13，14〕。OGDR常被用來體外模擬腦缺血再灌注。因此，推測miR-448可能在腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷中發(fā)揮調(diào)控作用。

本研究發(fā)現(xiàn)降低miR-448的表達(dá)可以減少OGDR引起的SH-SY5Y細(xì)胞死亡，降低miR-448的表達(dá)可以抑制OGDR引起的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示，miR-448可能促進(jìn)腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷，抑制miR-448的表達(dá)可能成為治療腦缺血再灌注損傷的新方向。雖然目前沒有關(guān)于miR-448在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮調(diào)控作用的報(bào)道，但其在脊髓缺血/再灌注損傷中的作用〔8〕可支持本研究的結(jié)論。Wang等〔8〕發(fā)現(xiàn)，miR-448在缺血再灌注損傷模型大鼠的脊髓組織和缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中高表達(dá)，且下調(diào)miR-448可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)功能。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血小鼠恢復(fù)供血后3 h，血液中miR-448的表達(dá)量就達(dá)到峰值〔7〕。因此，這些結(jié)果支持本研究的結(jié)論，即miR-448可能在腦缺血再灌注過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，抑制miR-448的表達(dá)可能成為治療腦缺血再灌注損傷的新方向。

miRNAs通過與mRNA的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)結(jié)合靶向調(diào)控靶mRNA的翻譯或者參與靶mRNA的降解，進(jìn)而參與多種疾病及生理過程的調(diào)節(jié)〔2，4，9，15〕。因此，鑒定miRNAs的靶基因?qū)﹃U明miRNAs的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。Wang等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-448通過靶向 SIRT1參與調(diào)控脊髓缺血/再灌注引起的損傷。SIRT1是高度保守的去乙?；讣易宄蓡T，對多種因素引起的神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用。如SIRT1參與保護(hù)剪切力誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷、缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷和缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)損傷〔8，16～18〕。基于SIRT1在神經(jīng)損傷保護(hù)中的重要作用，推測miR-448可能通過靶向SIRT1調(diào)節(jié)腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果說明，miR-448可以在OGDR處理的SH-SY5Y細(xì)胞中靶向調(diào)控SIRT1，miR-448可能通過靶向調(diào)控SIRT1參與腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷過程。但這尚屬于推論，仍需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以證明。另外，miR-448潛在的及已經(jīng)證明的靶基因有多個，miR-448是否通過其他靶基因參與腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元細(xì)胞損傷過程？仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證明。

綜上所述，OGDR處理引起miR-448在SH-SY5Y細(xì)胞中高表達(dá)，降低miR-448的表達(dá)可以抑制OGDR引起的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和死亡，說明降低miR-448的表達(dá)可以減輕OGDR引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。鑒于OGDR處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型常用來模擬神經(jīng)細(xì)胞的缺血再灌注，因此，推測miR-448可能在腦缺血再灌注過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，抑制miR-448的表達(dá)可能成為治療腦缺血再灌注損傷的新方向。