宋曉兵 彭埃天 黃峰 湯亞飛 崔一平 凌金鋒

摘要：黃龍病是世界柑橘產(chǎn)業(yè)的毀滅性病害，引起柑橘黃龍病的病原分為亞洲種、非洲種和美洲種共3個(gè)種，目前我國(guó)柑橘黃龍病均由亞洲種引起，建立一套快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)我國(guó)柑橘黃龍病的防控具有重要意義。本研究根據(jù)柑橘黃龍病亞洲種16S rDNA基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了基于重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增（RPA）的檢測(cè)方法，并評(píng)價(jià)了該方法的靈敏度和檢測(cè)準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，本研究所建立的柑橘黃龍病亞洲種RPA快速檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作過程簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏度比常規(guī)PCR提高10倍，為基層農(nóng)技人員開展柑橘黃龍病的快速檢測(cè)提供了一種新方法。

關(guān)鍵詞：柑橘;柑橘黃龍病亞洲種;RPA;快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S436.661.1+9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）22-0137-04

收稿日期：2021-02-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD0201500、2017YFD0202000）;廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2020KJ108）;廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)共性關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2020KJ134）。

作者簡(jiǎn)介：宋曉兵（1980—），男，山東膠南人，博士，副研究員，主要從事柑橘病害防控技術(shù)研究。E-mail：xbsong@126.com。

通信作者：彭埃天，研究員，主要從事果樹病害防控技術(shù)研究。E-mail：pengait@163.com。

柑橘黃龍病是一種影響全球的毀滅性病害，具有暴發(fā)性強(qiáng)、發(fā)展迅速、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，柑橘黃龍病正在全世界柑橘產(chǎn)區(qū)不斷擴(kuò)散蔓延，尤其在亞洲、非洲、美洲等地區(qū)泛濫成災(zāi)[1-3]。華南柑橘產(chǎn)區(qū)是柑橘黃龍病的重度流行區(qū)，柑橘黃龍病發(fā)生流行持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、發(fā)病范圍廣、發(fā)病率高，是造成柑橘壽命縮短、產(chǎn)量降低、生產(chǎn)成本提高、經(jīng)濟(jì)損失慘重的重要因素，嚴(yán)重制約了柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-5]。

目前，柑橘黃龍病普遍認(rèn)為是由局限于韌皮部的候選韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter spp.）侵染引起[6]，但至今未獲得一致認(rèn)可的純培養(yǎng)[7-8]。根據(jù)病原的熱敏性、傳播媒介、保守序列特征等可以將其分為3個(gè)種，包括亞洲種、非洲種和美洲種[9-10]?；诟涕冱S龍病菌16S rDNA的同源性分析結(jié)果表明，侵染我國(guó)柑橘的黃龍病病菌均為亞洲種，通過序列測(cè)定與多重比對(duì)分析也表明在不同的地域病原菌沒有較大的分子變異[11-12]。

帶病苗木、帶菌接穗和田間病株是柑橘黃龍病的初侵染源，目前開發(fā)一種高效、精準(zhǔn)、低成本、操作簡(jiǎn)便的黃龍病病原檢測(cè)技術(shù)，依然是基層科研單位、廣大柑橘種植企業(yè)、柑橘育苗企業(yè)的迫切需求。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)是一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，目前已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)病原物的快速診斷、轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)、植物病害的病原檢測(cè)等[13-16]。本研究擬研發(fā)一種用于檢測(cè)柑橘黃龍病亞洲種的RPA引物及其檢測(cè)方法，以期為柑橘種苗的黃龍病早期檢測(cè)、田間疑似黃龍病樹的檢測(cè)確診、普及基層科研單位的檢測(cè)能力提供技術(shù)支持，對(duì)早期預(yù)警柑橘產(chǎn)區(qū)黃龍病的擴(kuò)散蔓延具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：感染柑橘黃龍病的陽(yáng)性植株由廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，健康樣品采自筆者所在實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)室內(nèi)種植的柑橘（砂糖橘），待測(cè)樣品采自田間疑似感染黃龍病的柑橘（廣東懷集砂糖橘2株、德慶貢柑2株）。

試驗(yàn)試劑：AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，TwistAmp Basic RPA試劑盒購(gòu)自英國(guó)TwistDx公司，Premix TaqTM和DNA片段純化試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

本研究中RPA引物設(shè)計(jì)原則見www.twistdx.co.uk網(wǎng)站TwistAmp反應(yīng)試劑盒說明附錄中的引物設(shè)計(jì)部分，通過在線軟件https：//primer3.ut.ee/設(shè)計(jì)引物。基于柑橘黃龍病亞洲種（GenBank序列登錄號(hào)：AY192576.1）的16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物HLBas-F/HLBas-R，基于柑橘黃龍病亞洲種（GenBank序列登錄號(hào)：AY842429.1）的OMP序列設(shè)計(jì)引物OMP-F1/OMP-R1、OMP-F2/OMP-R2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2.2 總DNA提取

取適量的供試植物新鮮葉片，采用植物DNA提取試劑盒抽提其總DNA。具體操作按照試劑盒廠商說明書的步驟進(jìn)行。提取的植物總DNA沉淀溶解于50? μL TE緩沖液中，保存于 -20 ℃ 冰箱，備用。

1.2.3 RPA反應(yīng)

以柑橘黃龍病陽(yáng)性植株總DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的RPA引物HLBas-F/HLBas-R、OMP-F1/OMP-R1、OMP-F2/OMP-R2進(jìn)行擴(kuò)增。按照TwistAmp Basic RPA試劑盒的說明配制RPA反應(yīng)體系（50 μL）：向0.2 mL的TwistAmp反應(yīng)管中加入Rehy-dration Buffer 29.5 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、模板DNA 2 μL、280 mmol/L醋酸鎂2.5 μL、不含RNA酶的水12 μL。在40 ℃溫度下，分別反應(yīng)20、30、40、50、60 min;反應(yīng)結(jié)束后，用純化試劑盒對(duì)RPA產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，取純化后的RPA產(chǎn)物10 μL于1.0% 瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)20 min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4 常規(guī)PCR

以柑橘黃龍病陽(yáng)性植株總DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物HLBas-F/HLBas-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 2 μL、rTaqTM Premix 25 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、滅菌水19 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min;變性94 ℃ 45 s，退火54 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);延伸72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL于1.0% 瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)20 min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.5 RPA靈敏度

取柑橘黃龍病陽(yáng)性樣品的DNA模板進(jìn)行梯度稀釋，分別為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5? 6個(gè)稀釋梯度，分別進(jìn)行RPA檢測(cè)和普通PCR檢測(cè)，分析比較兩者的檢測(cè)靈敏度。RPA反應(yīng)體系同“1.2.3”節(jié)，在40 ℃條件下溫浴 40 min，從而完成RPA的靈敏度測(cè)定試驗(yàn);常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同“1.2.4”節(jié)。

1.2.6 樣品檢測(cè)

從廣東省各地采集疑似感染黃龍病的柑橘樣品4份，分別提取總DNA，用本研究建立的RPA擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并用常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)加以驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA引物篩選

以柑橘黃龍病陽(yáng)性植株總DNA為模板，40 ℃反應(yīng)條件下，利用引物HLBas-F/HLBas-R進(jìn)行RPA擴(kuò)增。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）可知，水浴20 min無特異性擴(kuò)增，水浴30 min獲得397 bp的目的條帶，水浴40 min中獲得的目的條帶更亮、擴(kuò)增條帶單一，隨著時(shí)間延長(zhǎng)條帶亮度無明顯變化。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，確定反應(yīng)40 min為最佳的反應(yīng)時(shí)間。

以柑橘黃龍病陽(yáng)性植株總DNA為模板，利用引物OMP-F1/OMP-R1、OMP-F2/OMP-R2分別進(jìn)行RPA擴(kuò)增。根據(jù)凝膠電泳結(jié)果（圖2）可知，反應(yīng)溫度為40 ℃，分別水浴20～60 min，2對(duì)引物水浴20 min時(shí)都可以獲得相應(yīng)的目的條帶，反應(yīng) 30 min 獲得的目的條帶較亮，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)目的條帶的亮度明顯模糊不清。引物OMP-F1/OMP-R1 出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增（圖2左側(cè)），引物OMP-F2/OMP-R2在40、50、60 min的擴(kuò)增條帶模糊不清（圖2右側(cè)）。鑒于3對(duì)RPA引物的電泳結(jié)果，最終選定引物HLBas-F/HLBas-R作為柑橘黃龍病RPA的檢測(cè)引物。

2.2 RPA檢測(cè)方法的靈敏度

以柑橘黃龍病陽(yáng)性植物總DNA為模板進(jìn)行稀釋，濃度梯度為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 6個(gè)稀釋度，分別進(jìn)行RPA和普通PCR檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RPA在模板稀釋倍數(shù)為10-3時(shí)仍能擴(kuò)增出目的條帶（圖3），普通PCR在模板稀釋倍數(shù)為10-2時(shí)尚能擴(kuò)增出目的條帶（圖4），因此，本研究所建立的RPA檢測(cè)方法比普通PCR檢測(cè)方法靈敏度提高10倍。

2.3 田間樣品的檢測(cè)

從廣東省各地采集疑似柑橘黃龍病樣品4份，用本研究建立的RPA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖5）顯示，4份疑似病樣品中3份檢測(cè)均為陽(yáng)性，同時(shí)采用普通PCR方法加以驗(yàn)證，其檢測(cè)結(jié)果（圖6）與RPA檢測(cè)結(jié)果一致，兩者的符合率為100%。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的RPA檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)柑橘黃龍病田間疑似樣品的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)與診斷。

3 討論

RPA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，對(duì)引物要求比常規(guī)PCR嚴(yán)格，RPA引物一般由30～38個(gè)核苷酸組成，而常規(guī)PCR引物長(zhǎng)度通常為15～25個(gè)核苷酸[17-18]。與普通PCR檢測(cè)方法相比，RPA擴(kuò)增過程中不需要熱循環(huán)，可在恒溫水浴鍋或金屬浴中進(jìn)行，檢測(cè)耗時(shí)較短，經(jīng)濟(jì)適用，無需PCR儀、熒光定量PCR儀等昂貴儀器設(shè)備[19-20]。目前已建立的PCR、巢式PCR、熒光定量PCR等柑橘黃龍病病原檢測(cè)技術(shù)[21-23]，雖然不斷提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確率，但是檢測(cè)時(shí)間依然比較費(fèi)時(shí)，熒光定量PCR由于需要昂貴的試驗(yàn)設(shè)備和試劑耗材，檢測(cè)費(fèi)用偏高。

本研究建立的柑橘黃龍病亞洲種RPA檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏性好，擴(kuò)增反應(yīng)快速，在40 ℃溫度條件下最短30 min就可以完成擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度比普通PCR高10倍，是一種新型的柑橘黃龍病檢測(cè)方法，筆者所在研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利（專利申請(qǐng)?zhí)?02011285512.9）。盡管目前RPA檢測(cè)方法的靈敏度與巢式PCR、熒光定量PCR相比仍存在較大差距[24]，柑橘黃龍病亞洲種RPA檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)單易學(xué)、省時(shí)省力，適用于田間疑似黃龍病樹的快速診斷，為基層科研單位的黃龍病檢測(cè)提供技術(shù)支持，未來應(yīng)用前景廣泛。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bové J M. Huanglongbing：a destructive，newly-emerging，century-old disease of citrus[J]. Journal of Plant Pathology，2006，88（1）：7-37.

[2]宋曉兵，彭埃天，陳 霞，等. 柑橘黃龍病病原培養(yǎng)及分子檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（23）：65-69.

[3]許美容，戴澤翰，孔維文，等. 基于分子技術(shù)的柑橘黃龍病研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2015，32（2）：322-334.

[4]柏自琴，周常勇. 柑橘黃龍病病原分化及發(fā)生規(guī)律研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（1）：133-137.

[5]鄧曉玲，鄭永欽，鄭 正，等. 柑橘黃龍病菌基因組學(xué)的研究進(jìn)展[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，40（5）：137-148.

[6]Hocquellet A，Toorawa P，Bové J M，et al. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the beta operon[J]. Molecular and Cellular Probes，1999，13（5）：373-379.

[7]Davis M J，Mondal S N，Chen H，et al. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus with Actinobacteria from Citrus with Huanglongbing[J]. Plant Disease，2008，92（11）：1547-1550.

[8]Sechler A，Schuenzel E L，Cooke P，et al. Cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus，‘Ca. L. africanus，and ‘Ca. L. americanus associated with Huanglongbing[J]. Phytopathology，2009，99（5）：480-486.

[9]Garnier M，Jagoueix-Eveillard S，Cronje P R，et al. Genomic characterization of a liberibacter present in an ornamental rutaceous tree，Calodendrum capense，in the Western Cape Province of South Africa. Proposal of ‘Candidatus Liberibacter africanus subsp. capensis[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50（6）：2119-2125.

[10]Texeira D C，Ayres J，Kitajima E W，et al. First report of a Huanglongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State，Brazil and association of a new liberibacter species，“Candidatus Liberibacter americanus”，with the disease[J]. Plant Disease，2005，89（1）：107.

[11]丁 芳，洪 霓，鐘 云，等. 中國(guó)柑橘黃龍病病原16SrDNA序列研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2008，35（5）：649-654.

[12]婁兵海. 柑橘黃龍病菌亞洲種全基因組測(cè)序及遺傳多樣性研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2018.

[13]哈登楚日亞，樊曉旭，趙永剛，等. 非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2017，44（11）：3270-3277.

[14]李 凱，金蕪軍，李 亮，等. 轉(zhuǎn)基因玉米Bt11品系特異性熒光RPA檢測(cè)[J]. 分子植物育種，2017，15（11）：4741-4745.

[15]宋 建，薛 俊，孫海波，等. 一種基于RPA的番茄褪綠病毒檢測(cè)方法[J]. 植物保護(hù)，2020，46（4）：168-170，184.

[16]凌 莉，席 靜，王 瑩，等. 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（4）：73-76.

[17]李華偉，林志堅(jiān)，張 鴻，等. 甘薯薯瘟病菌RPA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，49（5）：583-588.

[18]龍 海，李一農(nóng)，李芳榮.不同PCR引物對(duì)柑橘黃龍病菌的特異性檢測(cè)[J]. 植物檢疫，2012，26（4）：38-41.

[19]Chen L，Jiao Z Y，Liu D M，et al. One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of maize chlorotic mottle virus in maize[J]. Journal of Virological Methods，2017，240：49-53.

[20]馮黎霞，魏 霜，余 辛，等. 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）快速檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2020，47（1）：217-218.

[21]Jagoueix S，Bové J M，Garnier M. PCR detection of the two ‘Candidatus Liberobacter species associated with greening disease of citrus[J]. Molecular and Cellular Probes，1996，10（1）：43-50.

[22]李韜，柯 沖. 應(yīng)用Nested PCR技術(shù)檢測(cè)柑橘木虱及其寄主九里香的柑桔黃龍病帶菌率[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2002，29（1）：31-35.

[23]Li W，Hartung J S，Levy L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing[J]. Journal of Microbiological Methods，2006，66（1）：104-115.

[24]程保平，彭埃天，宋曉兵，等. 三種 PCR 方法檢測(cè)柑橘黃龍病菌的效果比較[J]. 植物保護(hù)，2014，40（5）：106-110.