昝珂 李耀磊 王丹丹 金紅宇 馬雙成 劉麗娜 王瑩

【摘 要】 目的：建立UPLC-MS/MS法測定炮制前后款冬花中款冬堿的含量。方法：采用沃特世CORTECS UPLC C18（100 mm × 2.1 mm， 1.6 μm）色譜柱，流動相為0.05%甲酸水溶液（A）及含0.05%甲酸的乙腈（B）（4∶[KG-*3/5]1）;電噴霧離子源，正離子多反應(yīng)模式監(jiān)測，外標(biāo)法測定。結(jié)果：款冬堿在1.005～100.5 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r>0.9990）;平均加樣回收率分別為92.28%，RSD分別為2.83%;炮制后款冬堿含量下降。結(jié)論：該方法經(jīng)驗(yàn)證可用于款冬花中款冬堿的含量測定。

【關(guān)鍵詞】 款冬花;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;款冬堿;含量測定

【中圖分類號】R284?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）20-0028-04

Determination of Tussilagine in Crude and Prepared Farfarae Flos by UPLC-MS/MS

ZAN Ke1 LI Yaolei2 WANG Dandan1 JIN Hongyu1 MA Shuangcheng1 LIU Lina1* WANG Ying1*

1.National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China;

2. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102488， China

Abstract：Objective To establish an UPLC-MS/MS method for quantitative analysis of tussilagine in crude and prepared Farfarae Flos. Methods The assay was performed on an Waters CORTECS UPLC C18（100 mm×2.1 mm， 1.6 μm） column and the sample was eluted with a mobile phase consisted of 0.05% formic acid in water （A）-0.05% formic acid in acetonitrile （B） （4：1）. The MS system was operated by using electrospray ionization （ESI） in the positive ion mode， and the scan mode was in multiple reaction monitoring （MRM） mode. External standard method was used in the experiment. Results? The linear range of tussilagine was 1.005-100.5 ng·mL-1 （r>0.9990）. The average recovery was 92.28% with RSD of 2.83%. After processing， the content of tussilagine decreases in Farfarae Flos. Conclusion The proposed method can be used as content determination of tussilagine in Farfarae Flos.

Key words：Farfarae Flos; Ultra-high Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry; Tussilagine; Content Determination

款冬花為菊科植物款冬（Tussilago farfara L.）的干燥花蕾，別名冬花，主要分布于甘肅、陜西、山西及河南等地區(qū)[1]?，F(xiàn)代臨床多用于新久咳嗽，喘咳痰多，勞嗽咳血的治療，療效顯著。臨床多用蜜炙品（蜜款冬花），中醫(yī)認(rèn)為，蜂蜜炮制款冬花能夠增強(qiáng)止咳化痰、潤肺下氣的功效[2]。款冬花中含有吡咯里西啶生物堿類成分，款冬堿是從款冬花中分離得到的一種吡咯里西啶生物堿類成分[3]。1，2-不飽和的吡咯里西啶生物堿具有肝毒性，但款冬堿是飽和的吡咯里西啶生物堿（結(jié)構(gòu)式見圖1），不具有肝毒性[4]。吡咯里西啶生物堿類成分往往具有抗菌、抗膽堿等藥理作用[5]。款冬堿至今僅在少數(shù)幾個植物中有報道[6]，具有較強(qiáng)的專屬性，含量測定至今未見報道。本文建立UPLC-MS/MS法，同時測定蜜炙前后的款冬花中款冬堿的含量，對其炮制前后含量的變化進(jìn)行比較。

1 儀器與材料

H-CLASS超高效液相色譜儀（沃特世）;三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測器（沃特世）;R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi公司）;KQ-3200DV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Quintix125D-1CN電子分析天平（賽多利斯公司）。Oasis MCX固相萃取小柱（150 mg/6 cc，沃特世公司）。

對照品款冬堿（批號：11782）由上海欽誠生物科技有限公司提供;純度大于98%;乙腈、甲醇、甲酸和甲酸銨均為質(zhì)譜級（Fisher），屈臣氏超純水，其他試劑為分析純。

款冬花采自甘肅省，經(jīng)中檢院昝珂副研究員鑒定為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。每批樣品分為2份，一份為生品（編號分別標(biāo)記為S1～S4），另一份按照《中國藥典》通則規(guī)定，照蜜炙法用蜜水炒至不粘手（編號分別標(biāo)記為Z1～Z4）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18（100 mm × 2.1 mm， 1.6 μm）;柱溫：40 ℃;流動相：0.05%甲酸水溶液（A）及含0.05%甲酸的乙腈（B）（4∶[KG-*3/5]1）;流速：0.3 mL·min-1;進(jìn)樣體積：2 μL。質(zhì)譜離子源為電噴霧離子化源（ESI）;正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）;毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度150 ℃;去溶劑溫度500 ℃?？疃瑝A對照品溶液進(jìn)樣后得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 200.20[M+H]+（圖2）;準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)子離子掃描，得到主要碎片為m/z 57.03和m/z 83.18（圖3），選定m/z 57.03為定量離子，m/z83.18為定性離子。經(jīng)手動優(yōu)化錐孔電壓和碰撞電壓，錐孔電壓為24 V，定量離子碰撞電壓為30 V，定性離子碰撞電壓為36 V。對照品及樣品的色譜圖如圖4所示。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取款冬堿適量，用10%乙腈水溶解配成濃度分別為1.005 μg·mL-1的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液適量，用10%乙腈水配成濃度為20.10 ng·mL-1 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取款冬花粉末1.0 g，精密稱定，加入 0.05 mol·L-1硫酸溶液40 mL，超聲提取 （300 W， 40 kHz）30 min，過濾，取濾液20 mL進(jìn)行固相萃取富集純化。具體流程為甲醇5 mL活化SPE-PCX小柱，0.05 mol·L-1硫酸溶液5 mL平衡小柱，將硫酸溶液樣品20 mL上柱，甲醇10 mL淋洗除雜， 8%氨水-甲醇溶液10 mL洗脫，收集洗脫液并濃縮至1 mL左右，用10%乙腈水稀釋定容至100 mL量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系和靈敏度考察 分別精密吸取對照品儲備液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mL，置100 mL量瓶中，加10%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，按照“2.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測定。以對照品的峰面積為Y，對應(yīng)的濃度為X進(jìn)行線性回歸?？疃瑝A的回歸方程為Y= 23621X-1876，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，表明款冬堿的線性關(guān)系良好。以定量離子對的色譜峰信噪比S/N≥3對應(yīng)的最低濃度為檢測限（LOD），以定量離子對色譜峰信噪比S/N≥10對應(yīng)的最低濃度為定量限（LOQ），檢測限為0.10 ng·mL-1， 定量限為0.30 ng·mL-1。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果款冬堿的峰面積的RSD為2.35%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（S1），分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果款冬堿的峰面積的RSD （n=6）為2.62%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品（S1）溶液6份，分別進(jìn)樣測定。結(jié)果款冬堿的平均含量分別為20.76 μg·g-1，RSD （n=6）為2.87%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取款冬堿對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加10%乙腈水溶解配制成質(zhì)量濃度分別為10.05 μg·mL-1的對照品溶液。取已知含量的供試品粉末（S1）6份，每份各約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入上述對照品溶液各1.0 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 含量測定 分別準(zhǔn)確稱取不同產(chǎn)地的款冬花藥材1.0 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，依據(jù)外標(biāo)法計算款冬堿的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測方法的選擇 款冬堿為款冬花中特征性的吡咯里西啶生物堿類成分，為痕量成分，采用高靈敏度的UPLC-MS/MS法為首選方法。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法同時測定，正離子多反應(yīng)監(jiān)測被測成分的離子對，靈敏度高，定量離子峰形好，其他物質(zhì)無干擾，能夠?qū)Υ郎y物質(zhì)準(zhǔn)確測定。

3.2 流動相的選擇 本研究考察了不同配比乙腈-水以及含有甲酸、甲酸銨等含酸溶液作為流動相對吡咯里西啶生物堿的分離能力的影響。通過調(diào)節(jié)流動相比例，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定流動相為含0.05%甲酸的水溶液及含0.05%甲酸的乙腈（4∶[KG-*3/5]1）恒流洗脫，在該系統(tǒng)下能夠?qū)疃瑝A達(dá)到定量測定的要求。

3.3 定量分析結(jié)果 本文采用建立的UPLC-MS/MS法對炮制前后款冬花中的款冬堿的含量進(jìn)行的測定，炮制對款冬花中款冬堿的含量具有明顯影響，炮制后款冬堿呈明顯的下降趨勢，下降的成分是否轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)需要進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2021-03-02 編輯：陶希睿）