施守濤，李村富，劉正杰，林春，杜江，蘇為耿，毛自朝,4

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201 ；2.云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，云南 昆明 650503；3.云南省林業(yè)和草原技術(shù)推廣總站，云南 昆明 650204 ；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)特色小宗作物研究中心，云南 昆明 650201 )

地不容(StephaniaepigaeaLo)屬毛茛目(Ranunculales)防己科(Menispermaceae)千金藤屬(Stephania)多年生草質(zhì)藤本植物，是我國的傳統(tǒng)中藥，以塊根入藥，在西南等地廣泛應(yīng)用于消腫散淤、健胃止痛以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瘧疾治療和促進(jìn)術(shù)后白細(xì)胞生長等[1]。主要活性成分為生物堿，已分離鑒定的化合物有原小檗型[2]、阿樸菲型[3]、原阿樸啡型[4]、嗎啡型[5]、雙芐基異喹啉型生物堿[6]等，其中千金藤素在地不容中含量較高，達(dá)1.3%，對(duì)放療或白細(xì)胞減少癥具良好效果[7-9]。

地不容的塊根形似烏龜，上部美觀，生長迅速、綠化面積大、管理容易，常用于園林景觀及綠化，開發(fā)利用前景廣闊。地不容為雌雄異株，授粉需要一定的種群數(shù)量，加之種子自身存在休眠現(xiàn)象，因此自然結(jié)實(shí)率和種子繁殖力相對(duì)較低。在市場經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，亂采濫挖進(jìn)一步加劇了野生資源的減少，因此，通過采挖野生塊莖繁殖已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足其市場需求。

開展種子繁殖、莖段扦插、組培快繁等研究，是解決當(dāng)前地不容資源不足的重要途徑。生產(chǎn)實(shí)踐中，地不容種子具有休眠特性，現(xiàn)采現(xiàn)播難以萌發(fā)，但其休眠機(jī)制和解除方法尚未見報(bào)道。本研究為明確地不容種子的休眠機(jī)制，采用機(jī)械劃破種皮、摩擦處理、熱水及硫酸浸泡等方法處理其種子，比較不同處理方法對(duì)解除種子休眠的效果，以期為種子育苗及種質(zhì)資源保護(hù)與利用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

地不容植株為野外引種，移栽于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)大棚。2018年8月采集其成熟后的果實(shí)，去除果肉后自然晾干種子，備用。地不容的種子外形呈馬蹄形(圖1c)，平均直徑0.51 cm，千粒重18.81 g。

供試藥劑主要有紅四氮唑(1%TTC，298-96-4，購于上海源葉生物科技有限公司)、H2SO4、NaOH等均為分析純(廣東省佛山市華希盛化工有限公司)。試驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)特色小宗作物研究所完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 地不容種子活力檢測(cè)

(1)種子生活力檢測(cè) 在人工去種皮時(shí)，除去了不飽滿、腐爛、組織軟化等種胚，挑選飽滿白色種胚(圖1e)的地不容種子，備用。采用紅四氮唑(1%TTC)染色法[10]測(cè)定新采收的地不容種子活力，胚被染成有光澤鮮紅色的(圖1f)記為組織狀態(tài)正常有活力的種子。每重復(fù)處理50粒種子，重復(fù)3次，取平均值。

(2)萌發(fā)試驗(yàn) 取不做任何處理的地不容飽滿種子在培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，萌發(fā)床為經(jīng)高溫滅菌濾紙，光照條件20 μmol/(m2·s)，12 h/d(每天光照時(shí)間為12 h)，溫度(25±2)℃下培養(yǎng)。以下所有處理的萌發(fā)條件都保持一致，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子，重復(fù)3次，分別在試驗(yàn)14、28 d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率，之后的試驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定與此保持一致。

(3)吸水率 隨機(jī)取50粒飽滿種子于去離子水中浸泡，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔6 h取出種子，用濾紙吸干種子表面水分稱重，直到種子吸水量不會(huì)再增加[11]。

(4)萌發(fā)抑制物質(zhì)存在與否的生物檢測(cè) 為確定地不容種子是否含萌發(fā)抑制物，取地不容種子的種皮2～4 g在研缽中搗碎后溶于40 mL的去離子水中，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)浸提48 h;使用小白菜(Brassicarapavar.glabra) 種子做為生物測(cè)定種子，在9 cm培養(yǎng)皿中，以濾紙為萌發(fā)床，加3 mL種皮浸提液，播小白菜種子50粒，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，24 h后測(cè)小白菜種子的發(fā)芽率，培養(yǎng)48 h后測(cè)其種子的胚根長度[12]。對(duì)照組將浸提液替換為3 mL去離子水，其他培養(yǎng)條件保持一致。

1.2.2 物理方法處理

(1)劃破種皮處理 為探究透氣性對(duì)種子萌發(fā)的影響，對(duì)種皮進(jìn)行不同程度處理：在胚根端開孔、去1/4種皮、去1/2種皮、完全去除種皮，將處理過的種子進(jìn)行濾紙萌發(fā)試驗(yàn)。

(2)摩擦處理 取兩張砂紙，將種子置于中間，兩張砂紙水平做相對(duì)旋轉(zhuǎn)摩擦種子[13]，在盡量保證種胚的完整性的基礎(chǔ)上，使種皮產(chǎn)生一定程度的擦破，處理干凈種皮的碎屑，進(jìn)行濾紙萌發(fā)試驗(yàn)。

(3)熱水處理 在1 L的燒杯中分別用500 mL初溫為40、50、60、70、80、90、100 ℃的7種溫度的水浸泡種子至水溫到達(dá)室溫[14]，浸泡時(shí)用培養(yǎng)皿蓋住，進(jìn)行濾紙萌發(fā)試驗(yàn)。

1.2.3 化學(xué)試劑處理

(1)濃H2SO4處理 將種子放入250 mL的燒杯中，加濃度為98%的濃H2SO4(比重1.84)，用玻璃棒不停攪拌，分別浸種10、20、30、40、50、60、70 min，濃H2SO4處理完后立即取出用流水沖洗10 min[15]，進(jìn)行濾紙發(fā)芽試驗(yàn)。

(2)NaOH處理 將種子放入250 mL的燒杯中，用40%、30%、20%、10%的NaOH[16]溶液分別浸泡20、40、60、80、100、120、140 min，不同濃度、時(shí)間組合處理后立即取出用流水沖洗10 min，進(jìn)行濾紙發(fā)芽試驗(yàn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行差異顯著性分析。

吸水率(%)=(吸水前-吸水后)/吸水前×100%；

萌發(fā)率(%)= 種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=發(fā)芽勢(shì)天數(shù)內(nèi)正常發(fā)芽種子粒數(shù)/試驗(yàn)種子的總粒數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子活力、吸水率和生物檢測(cè)

種子生活力是種子發(fā)芽的潛在能力或種胚具有的生命力，具有生活力的種子不一定都具有發(fā)芽能力，如果種子生活力顯著大于種子發(fā)芽率，說明種子存在休眠現(xiàn)象[10]。TTC染色結(jié)果(圖1f)表明種子生活力為100%，而不做任何處理的完整種子萌發(fā)率為0，種子生活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于發(fā)芽率，說明新采收的地不容種子存在顯著的休眠現(xiàn)象。

圖1 地不容植株、果實(shí)與種子

地不容種子種皮為硬木質(zhì)化(圖1c)，如圖2所示，種子在前6 h內(nèi)快速吸水，6～48 h進(jìn)入緩慢吸水期，48 h后種子含水量達(dá)到飽和，在一定程度上說明，種子不存在吸水障礙問題，種皮有較好的透水性，表明種皮透水性不是引起種子休眠的原因。

圖2 地不容種子吸水率

很多具有休眠性的植物種子都含有抑制萌發(fā)的物質(zhì)，試驗(yàn)中常常通過測(cè)定種子浸提液對(duì)小白菜種子發(fā)芽抑制作用來確定種子抑制物質(zhì)的存在與否[17]。為確定地不容種子是否含萌發(fā)抑制物，采用相同的方法測(cè)定表明，對(duì)照組與地不容種子浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)率、胚根長沒有顯著性差異，且根生長形態(tài)和根毛稀疏程度未存在較大差異(表1)，說明種皮中不存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)，進(jìn)一步明確了地不容種子休眠是由種皮機(jī)械束縛導(dǎo)致的。

表1 種皮浸提液對(duì)種子萌發(fā)及胚根伸長的影響

2.2 物理處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

對(duì)種皮不同程度的處理，能解除種胚與外界的隔離，增強(qiáng)胚的氣體交換和吸脹能力。由表2可見，在胚根端開小孔，幫助地不容種胚與外界進(jìn)行氣體交換，種子仍不能萌發(fā)。在種子萌發(fā)過程中，去1/4、1/2種皮、完全去除種皮等3種處理后的種子在4～5 d后開始萌發(fā)，且去1/2種皮具有最高的萌發(fā)率，達(dá)96%。方差分析結(jié)果表明：去除1/4、1/2種皮、完全去除種皮之間萌發(fā)率沒有顯著性差異，且去除1/4、1/2種皮、完全去除種皮的種子在14 d 的萌發(fā)率幾乎與28 d的萌發(fā)率相等，說明種皮障礙束縛一旦被破除，種子萌發(fā)就能啟動(dòng)。結(jié)果表明：種皮透氣性不是引起地不容種子休眠的原因，種皮束縛才可能是導(dǎo)致地不容種子休眠的原因。

表2 不同物理處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

在種皮機(jī)械束縛導(dǎo)致種子休眠的解除方法中使用機(jī)械摩擦較為普遍，其中砂紙摩擦可以使種皮均勻變薄或者擦破局部種皮，讓種胚失去與外界的隔離以及減少種皮機(jī)械束縛，增強(qiáng)胚的氣體交換和吸脹能力，加快種子萌發(fā)。由表2可見，經(jīng)摩擦處理后地不容種子的萌發(fā)率約達(dá)63.33%，低于人工去種皮，原因可能是砂紙?jiān)谀Σ吝^程中對(duì)種胚造成一定程度傷害或摩擦不均勻?qū)е路N胚不能沖破殘留種皮的束縛而萌發(fā)，該結(jié)果也證明種皮束縛是地不容種子萌發(fā)率低的主要限制因素。

高溫處理不僅對(duì)種皮具有一定的軟化作用，降低機(jī)械束縛，而且可以溶解種皮內(nèi)的蠟質(zhì)和油脂，增加種皮的透性，以及浸出種子內(nèi)源抑制物等其他原因引起的種子休眠，具有操作方法簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠及效果顯著等優(yōu)點(diǎn)[14]。經(jīng)熱水處理后的種子萌發(fā)率為0(表2)，表明熱水處理對(duì)地不容種皮機(jī)械束縛的解除無效果，說明地不容種子可能對(duì)高溫敏感，或是地不容種皮的硬實(shí)程度較高，通過高溫?zé)崴能浕圆荒芷瞥菝摺?/p>

2.3 化學(xué)試劑對(duì)種子萌發(fā)的影響

用濃H2SO4處理可以腐蝕種皮，使種皮變薄，減少種皮對(duì)胚的機(jī)械束縛[19]。種子用濃H2SO4處理20 min后流水沖洗10 min，地不容種子的硬實(shí)骨質(zhì)種皮外層開始脫落，主要是覆蓋背部的小肋橫角質(zhì)部分；處理60 min，種皮完全脫落，種子內(nèi)部完全裸露。種皮與種胚之間有胚乳(圖1d)，其所占比例較小，對(duì)胚起到一層膜的保護(hù)作用，在濃H2SO4處理過程中，可在一定程度上防止對(duì)種胚造成迅速酸害。由表3可見，處理50 min后，地不容種子開始萌發(fā)，處理60 min時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)88.67%。處理70 min后種子萌發(fā)率不升高反而降低。由此可見，通過濃H2SO4浸種可有效解除種皮束縛進(jìn)而打破地不容種子休眠，但處理時(shí)間過長會(huì)對(duì)種胚造成一定程度的酸害。

表3 不同化學(xué)試劑及處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)率的影響

NaOH是強(qiáng)堿，有強(qiáng)烈的腐蝕性，對(duì)一些種皮薄的種子可以減輕種皮的束縛作用，解除種子休眠。經(jīng)不同濃度NaOH浸泡不同時(shí)間處理的地不容種子，在培養(yǎng)14 、28 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率都為0，表明NaOH處理未能打破種子休眠，對(duì)解除地不容種子休眠無效果。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)：經(jīng)NaOH處理、流水沖洗10 min的種子，在萌發(fā)床濾紙上種子周圍逐漸變黑，更換3次濾紙后仍有這種現(xiàn)象。由于地不容種皮具有較好的透性，變黑的原因可能是NaOH溶液滲入種皮內(nèi)部后有殘留，流水不能將其清洗干凈，導(dǎo)致種胚被腐蝕，種子未萌發(fā)，其發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率均為0。

3 討論與結(jié)論

3.1 地不容種子休眠

休眠是種子植物為了種群的生存和發(fā)展，在長期進(jìn)化過程中逐漸演化形成的對(duì)不良環(huán)境的有效適應(yīng)機(jī)制。為適應(yīng)不同的脅迫環(huán)境，植物種子進(jìn)化形成了不同的休眠類型及機(jī)制[18]。從生殖發(fā)育看，采用種子播種進(jìn)行地不容育苗需2～3 a后植株才開花，并于當(dāng)年7—9月結(jié)實(shí)。破除休眠的種子在翌年3月才開始萌發(fā)，從果實(shí)成熟到來年種子發(fā)芽需要6～8個(gè)月的時(shí)間，休眠有利于地不容度過不適宜其萌發(fā)和生長的寒冷干燥的冬季。成熟的地不容果實(shí)為鮮艷紅色(圖1b)，是許多鳥類等動(dòng)物喜愛的食物，利于種子遠(yuǎn)距離傳播。其堅(jiān)實(shí)的種皮有利于動(dòng)物類過腹后與糞便一起發(fā)酵仍能保證種子在來年更適宜的生長條件下萌發(fā)及生長，成功實(shí)現(xiàn)后代的繁衍，保持物種的延續(xù)[20]。Jerry等[21]在對(duì)Nikolaeva[22]休眠分類系統(tǒng)進(jìn)行修訂和完善的基礎(chǔ)上提出了新的分類系統(tǒng)，將種子休眠概括為5種類型，分別是：物理休眠[23-24]、生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠和復(fù)合型休眠[25]。在本研究中，地不容果實(shí)變紅后采收，種胚已發(fā)育完全，有較好的染色率(圖1f)及萌發(fā)率，故不存在胚的形態(tài)休眠；地不容種皮具有較好的透性，也排除由于種皮或果皮的不透氣、不透水從而抑制種子萌發(fā)引起的物理休眠；經(jīng)生物檢測(cè)試驗(yàn)說明地不容種皮中也不存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)(表1)，證明地不容堅(jiān)硬的種皮束縛是限制其種子萌發(fā)的主要因素，符合Jerry分類系統(tǒng)中生理休眠的描述：種子種皮能夠透水，種胚也分化完全，但種胚的生理抑制作用阻礙了種子的萌發(fā)；或種胚的生長力較弱，不能突破種皮等包被物的束縛同樣對(duì)胚的萌發(fā)具有抑制作用[19]。因此，本研究結(jié)論認(rèn)為：導(dǎo)致地不容種子休眠的主要原因是種皮束縛，破除種皮障礙是解決地不容休眠的主要方式。

3.2 機(jī)械處理對(duì)地不容種子萌發(fā)的影響

機(jī)械處理是解決種皮障礙最直接、有效、簡單的方法，包括劃破種皮、摩擦處理和輕輾等[25]，地不容種子由于種皮厚度不均(圖1c)，不宜輕搗或輕輾。伊風(fēng)艷等[26]用砂紙打磨和劃破種皮處理野生黃花苜蓿(Medicagofalcata)種子，使得其發(fā)芽率高達(dá)93%；李欣瑞等[13]經(jīng)過摩擦處理和劃破種皮處理的武陵假儉草(Eremochloaophiuroides)種子，發(fā)芽率分別達(dá)93.33%和88.67%；侯文煥等[27]用沙子研磨菜用黃麻(Corchoruscapsularis)種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該處理也能顯著地提高其發(fā)芽率。在本研究中經(jīng)劃破種皮和摩擦處理過的地不容種子，種子發(fā)芽率都顯著提高，達(dá)96%和63.33%，可見通過以上2種方法處理可有效破壞種皮，減少胚根突破種皮時(shí)受到的機(jī)械阻力，促進(jìn)種子萌發(fā)。但是這兩種種子處理方法效率較低，處理過程中也會(huì)誤傷種胚，只適用于處理樣品量少的情況。

3.3 熱水處理對(duì)地不容種子萌發(fā)的影響

熱水浸種可軟化種皮，改善種子的透氣性，有利于種子突破種皮障礙，是一種操作簡單、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、效果顯著，且可大量處理種子的方法[27]。在蘇曉敏等[14]研究中用熱水浸種對(duì)苦豆子(Sophoraalopecuroides)、金合歡(Acaciafarnesiana)、銀合歡(Leucaenaglauca)、臺(tái)灣相思(Acaciaconfusa)、任豆(Zeniainsignis)等5種植物種子解除其休眠的效果極為為顯著，這些種子經(jīng)70 ℃熱水浸種30 min后發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到試驗(yàn)期間的較大值，萌發(fā)率可達(dá)78%、75%、90%、66%、100%，分別為對(duì)照萌發(fā)率的2.1倍、4.4倍、3.3倍、3.7倍和8倍；但在其他種子[如百喜草(Paspalumnatatu)、田菁(Sesbaniacannabina)、馬棘(Indigoferapseudotinctoria)、黃槐決明(Cassiasurattensis)]的休眠打破研究中，熱水處理效果并不明顯，甚至導(dǎo)致萌發(fā)率下降，而且在試驗(yàn)中隨著浸種水溫度升高、時(shí)間延長，對(duì)種胚損傷嚴(yán)重，腐爛種子數(shù)也有增多。本研究用相似的方法處理地不容種子，熱水處理過后的種子，在試驗(yàn)28 d后其種子仍未萌發(fā)，說明熱水處理對(duì)地不容種子萌發(fā)沒有效果，生產(chǎn)中不宜采用。這種無效處理的原因，可能是由于熱水沒有起到軟化種皮的作用或有軟化種皮的作用但對(duì)種胚造成一定傷害，其具體原因尚待進(jìn)一步研究。

3.4 化學(xué)試劑處理對(duì)地不容種子萌發(fā)的影響

除了物理處理方法外，化學(xué)試劑處理也常常被用于促進(jìn)種子萌發(fā)，高濃度的硫酸和NaOH可以腐蝕局部種皮，促進(jìn)種子萌發(fā)，其中使用濃硫酸最為普遍。岳利軍[29]用濃硫酸預(yù)處理，能提高梭梭(Haloxylonammodendron)、白刺(Nitrariatangutorum)和紅砂(Reaumuriasoongorica)的種子發(fā)芽率。由于植物種皮厚度存在差異，不同物種濃硫酸浸泡時(shí)間也存在差異，如甘肅棘豆(Oxytropiskansuensis)的最佳處理時(shí)間為5 min，甘草(Glycyrrhizauralensis)[30]和地八角(Astragalusbhotanensis)[31]的為20 min，白刺花(Sophoraviciifolia)為25 min[32]。對(duì)于地不容種子，用濃硫酸處理時(shí)間達(dá)50 min時(shí)種子開始萌發(fā)，60 min時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)88.67%，70 min后種子萌發(fā)率降低。在其他物種的種皮障礙休眠破除中，NaOH也同樣有效，但效果因物種不同而異，如用10%或20%的NaOH浸種4～10 h，異穗苔草(Carexheterostachya)種子的發(fā)芽率由0提高到90%以上[33]；結(jié)縷草(ZoysiajaponicaSteud)種子用30%NaOH 浸泡20～80 min，種子發(fā)芽率可達(dá)80%，高于對(duì)照30%[34]；而黑果枸杞(Lyciumruthenicum)的種子用濃度40%NaOH處理過后，其平均發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率與對(duì)照組相比沒有顯著變化[35]。研究發(fā)現(xiàn)堿液浸泡處理種子無法破除休眠的原因，可能是堿液不能破壞種皮中高含量鈣鹽或硅酸鹽的柵狀細(xì)胞或石細(xì)胞，或?qū)δ举|(zhì)化程度極高的細(xì)胞壁的軟化能力有限[36]。本研究中，經(jīng)不同濃度的NaOH不同時(shí)間組合處理的地不容種子，其發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率都為0，未能打破休眠，可能與地不容堅(jiān)硬的種皮使NaOH溶液對(duì)其軟化能力有限或浸泡過程中傷害種胚有關(guān)，但其無效機(jī)制還有待研究。本研究通過不同濃硫酸不同時(shí)間處理種子后，經(jīng)種胚形態(tài)和萌發(fā)率的比較分析，確定60 min濃硫酸處理后地不容種子種皮完全脫離，種皮障礙被打破，萌發(fā)率高達(dá)88.67%，可作為打破地不容種子休眠、進(jìn)行其規(guī)?；绲氖走x方法。

綜上所述，本研究確定地不容休眠的主要機(jī)制是種皮障礙，通過摩擦處理、劃破種皮和98%濃H2SO4處理，均可破除地不容種皮束縛，促進(jìn)種子萌發(fā)，不同處理方法的萌發(fā)率最高可達(dá)63.33%、96%、88.67%。其中，機(jī)械處理方法能大幅度提高地不容種子萌發(fā)率，但該方法只適用于少量種子處理。若要處理大量地不容種子，建議采用98%濃H2SO4浸種60 min的方法，種子萌發(fā)效果最好。