蔡佳友，董天一，傅靖棋，范新蕊，張麗杰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院/遼寧省林木遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng)110161）

高等植物成花是其生命周期的一個(gè)重要過(guò)程，植物在合適的時(shí)間開(kāi)花保證了植物的正常授粉以及種子的正常發(fā)育。因此，成花與植物產(chǎn)量及品質(zhì)密切相關(guān)，是植物生產(chǎn)的關(guān)鍵所在，也成為各國(guó)學(xué)者探索的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，在對(duì)模式植物擬南芥成花的研究中發(fā)現(xiàn)，有4條主要的成花途徑：光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑[1]。CO作為光周期途徑中的關(guān)鍵基因，在植物開(kāi)花中發(fā)揮著重要作用[2]。將光信號(hào)與生物鐘信號(hào)進(jìn)行整合，激活下游成花FT基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)植物開(kāi)花[3]。PUTTERILL等[4]在1995年克隆得到擬南芥的CO基因，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CO基因的擬南芥植株可以實(shí)現(xiàn)提前開(kāi)花。在此之后又相繼在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了16個(gè)CO-like基因，形成一個(gè)基因家族[5]，該基因家族由保守的B-boxes鋅指結(jié)構(gòu)、CCT結(jié)構(gòu)域以及不保守的中間結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中B-boxes和CCT結(jié)構(gòu)域在誘導(dǎo)植物開(kāi)花中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。CO基因作為植物成花過(guò)程中非常重要的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在光周期與開(kāi)花過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用。RUIZ-GARCIA等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)，CO基因可以激活SCO1基因進(jìn)而啟動(dòng)花芽發(fā)育相關(guān)LFY基因進(jìn)行表達(dá)以促進(jìn)植物提早開(kāi)花。

胡桃楸（Juglans mandshurica）為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）落葉喬木[9]，是我國(guó)東北地區(qū)珍貴的用材樹(shù)種，同時(shí)也是我國(guó)重要木本糧油樹(shù)種和果材兼用的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，集經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值于一身。因此，胡桃楸的開(kāi)發(fā)利用具有廣闊發(fā)展前景。課題組在前期對(duì)胡桃楸生殖物候特征進(jìn)行調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，該物種由于具有雌雄同株異型異熟的生殖特性[9-10]，導(dǎo)致其雌花與雄花發(fā)育不同步，同一植株花期不同，不同植株間雌雄花成熟先后有序，且十分穩(wěn)定，這種生殖特性影響其授粉及坐果數(shù)量及質(zhì)量。目前，對(duì)胡桃楸雌雄花芽發(fā)育及花期不同步等方面的研究較少，且對(duì)其雌雄性別分化過(guò)程中成花的分子機(jī)制尚未完全解析。因此，為更好地了解CO基因在光周期途徑中調(diào)控胡桃楸花芽分化的分子機(jī)制，探究胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因的功能和表達(dá)模式，本研究根據(jù)胡桃楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到CO基因片段，利用C O基因的差異片段設(shè)計(jì)上下游引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增克隆得到該基因的全長(zhǎng)序列，并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)J mCO基因進(jìn)行蛋白聚類及序列特征分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析等。利用熒光定量PCR技術(shù)分析JmC O基因在胡桃楸不同器官、組織中的表達(dá)量情況，為進(jìn)一步研究胡桃楸成花的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)的植物材料為2020年5月取自遼寧省實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)胡桃楸天然林幼嫩葉片、雌、雄花芽、果實(shí)等，經(jīng)過(guò)液氮速凍，存于超低溫冰箱-80℃中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)

利用胡桃楸花芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選的CO基因差異片段，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)上下游引物，由賽百盛生物公司合成，用于擴(kuò)增C O基因全長(zhǎng)。其引物序列見(jiàn)表1。

表1 胡桃楸C O基因片段和DNA全長(zhǎng)擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for full-length DNA of the J u glans mands hurica CO gene

1.3 胡桃楸基因組DNA及RNA提取

利用DNAsecurePlantKit試劑盒（G-CLONE公司）提取胡桃楸基因組DNA，利用RNAsecurePlantKit提取試劑盒（天根公司）提取胡桃楸不同器官的RNA，具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用核酸蛋白儀（Thermo）檢測(cè)核酸質(zhì)量及純度。

1.4 RT-PCR

PCR采用LA Taq酶（TAKARA），依照LA Taq酶說(shuō)明書(shū)冰上操作。

1.5 胡桃楸成花相關(guān)C O基因CDS序列的克隆

反應(yīng)擴(kuò)增程序：95℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃7min，4℃∞。PCR反應(yīng)體系(25μL)：11.9μL ddH2O，加入上游引物1μL，下游引物1μL，加入模板DNA3μL，加入LA Taq Mix 4.1μL，體系共20μL。用1%瓊脂糖凝膠測(cè)試擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 目的片段回收純化、連接、轉(zhuǎn)化

用DNA膠回收試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行片段回收，并利用pGM-T克隆載體做連接載體，轉(zhuǎn)化至TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選并進(jìn)行PCR鑒定。搖菌后送金唯智生物公司測(cè)序分析。

1.7 qRT-PCR

利用上海生物工程公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海生工）合成胡桃楸不同組織cDNA，利用蘭博利德熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，具體操作按照說(shuō)明書(shū)冰上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡桃楸核酸質(zhì)量和濃度檢測(cè)

將提取的胡桃楸基因組DNA和RNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由圖1可知，DNA條帶清晰無(wú)雜帶，位于DL2000 marker的上方，位置正確，DNA濃度為50.9ng·μL-1，達(dá)到要求滿足后續(xù)試驗(yàn)要求；RNA條帶檢測(cè)到2條譜帶，清晰明亮，說(shuō)明RNA完整性較好，不同器官組織的RNA OD260/OD280比值均在1.85～1.93之間，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖1 胡桃楸基因組DNA和RNA電泳圖Figure 1 DNA and RNA electrophoresis of J u glans mands hurica

2.2 胡桃楸成花相關(guān)C O基因的CDS序列克隆

以胡桃楸基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度600bp左右的1條特異性條帶(圖2)，將回收的目的基因連接到T載體并進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性菌液并進(jìn)行PCR檢測(cè)，菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3，得到一條長(zhǎng)度582bp左右的特異性條帶。測(cè)序結(jié)果表明，該基因序列長(zhǎng)度為582 bp，DNAMAN軟件可通順的翻譯成194個(gè)氨基酸，具有完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，表明已克隆獲得了胡桃楸C O基因CDS序列。

圖2 PCR擴(kuò)增C O基因結(jié)果Figure 2 Ju glans mandsh uri ca CO amplification results

圖3 胡桃楸成花相關(guān)C O基因菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 Results of colony PCR amplification of Juglans mand shurica C O gene

2.3 胡桃楸成花相關(guān)J mC O基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 胡桃楸成花相關(guān)J m C O基因同源性分析 將克隆得到的胡桃楸成花相關(guān)JmC O基因的CDS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因同源性比對(duì)。結(jié)果表明，Blast比對(duì)得到的胡桃楸C O同源基因與核桃(Ju glans regia)核苷酸同源性達(dá)到97%、板栗(Castanea mol lissima)核苷酸同源性達(dá)到80%，并且與楊梅(Morella rub ra)、白櫟(Quercus l obat e)、千金榆(Car pinus f angiana)、栓皮櫟(Quercus sub er)等物種的CO基因同源性均達(dá)到78%以上(表2)。因此，將胡桃楸成花相關(guān)CO基因命名為JmC O基因。2.3.2 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，氨基酸成分編碼的蛋白質(zhì)C O基因共編碼192個(gè)氨基酸；通過(guò)ProtParamExPASy在線軟件分析胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因的氨基酸序列理化參數(shù)。結(jié)果表明，其蛋白質(zhì)分子式為C927H1451N275O298S11，分子量為2962，理論等電點(diǎn)pI值為8.3。不穩(wěn)定指數(shù)為31.56，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。利用ProtParam在線軟件對(duì)胡桃楸JmCO蛋白氨基酸組成進(jìn)行分析；JmCO氨基酸組成中絲氨酸(S)最多，為11.4%；纈氨酸(V)、精氨酸(A)和天冬氨酸Asp(D)次之，分別為9.3%、8.3%；并且，此蛋白質(zhì)中不含色氨酸(W)、吡咯賴氨酸(O)和吡硒半胱氨酸(M)。其中帶正電荷總數(shù)為27個(gè)，帶負(fù)電荷酸性氨基酸為25個(gè)，即整個(gè)蛋白質(zhì)帶正電荷。

表2 胡桃楸成花相關(guān)JmCO同源基因氨基酸序列與其他物種同源性比較Table 2 Comparison of amino acid sequence of JmC O homologous gene between Juglans mandsh urica and other species

圖4 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸組成Figure 4 The amino acid composition of J u glans mandh urica JmC O gene encoded protein

2.3.3 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因編碼的蛋白質(zhì)疏水性/親水性及跨膜預(yù)測(cè)分析 通過(guò)在線軟件ProtScale對(duì)胡桃楸成花相關(guān)JmC O基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)分析（圖5），可以看出，超一半圖像位于負(fù)坐標(biāo)處，這表明該JmCO蛋白屬于親水蛋白。

圖5 胡桃楸成花相關(guān)J mC O基因所編碼的蛋白質(zhì)疏水性/親水性Figure 5 Hydrophobic/hydrophilic of J u glans mands hurica JmCO gene encoded protein

跨膜結(jié)構(gòu)能夠準(zhǔn)確了解蛋白質(zhì)的特性。圖6橫坐標(biāo)代表蛋白質(zhì)各個(gè)氨基酸的位置，縱坐標(biāo)為跨膜區(qū)域的可能性。若兩者交換位置則表示此處經(jīng)過(guò)了跨膜，通過(guò)在線分析軟件SOPMA預(yù)測(cè)胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。由圖6可知，胡桃楸JmCO蛋白的1～192位氨基酸位于細(xì)胞膜外，且胡桃楸JmCO蛋白無(wú)跨膜功能。

圖6 胡桃楸成花相關(guān)J mC O基因所編碼的蛋白質(zhì)跨膜預(yù)測(cè)Figure 6 Transmembrane prediction of the protein encoded by J mCO gene related to flower formation of Juglans mand shurica

2.3.4 胡桃楸成花相關(guān)JmC O基因編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位 通過(guò)在線軟件Plant-mPLoc來(lái)預(yù)估胡桃楸成花相關(guān)JmCO蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)可能存在的位置，輸入氨基酸序列后得到預(yù)測(cè)結(jié)果表明，胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因編碼蛋白存在于細(xì)胞核中（圖7）。利用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)JmCO蛋白保守區(qū)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)胡桃楸成花相關(guān)JmCO蛋白含有CCT和BBox保守結(jié)構(gòu)域，隸屬于CCT超家族。

圖7 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因所編碼的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析Figure 7 Subcellular localization analysis of the protein encoded by J u gl ans mandshur ica J mCO gene

2.3.5 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因編碼蛋白聚類分析 為進(jìn)一步了解胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因的功能和特征，利用MEGA7.0生物軟件對(duì)包含胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因在內(nèi)的21個(gè)物種的CO基因編碼的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖8可知，胡桃楸成花相關(guān)JmCO蛋白首先與核桃(J uglans r e gi a)JrCO的親緣關(guān)系最近，然后與楊梅（Morella r ub ra）MrCO、白櫟（Quercus lobate）QlCO、栓皮櫟（Quer cus suber）QsCO聚在一個(gè)分支上，與巴旦木（Amygdalus communis）AcCO、紅梅（Prunus mume）PmCO、秋子梨（Pyrus ussuriensis）PuCO、蘋(píng)果（Malus pumila）MpCO、川桑（Morus notabilis）MnCO和棗樹(shù)（Ziziphus jujuba）ZjCO的親緣關(guān)系較近，與其他8種C O基因關(guān)系稍遠(yuǎn)，最后聚在一個(gè)大的分支上。

圖8 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因所編碼的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 8 Phylogenetic tree of proteins encoded by J mC O gene related to flowering of J u glans mands hurica

將胡桃楸成花相關(guān)J mC O基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與核桃、板栗、楊梅、白櫟等其他物種CO蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果如圖9所示，可以發(fā)現(xiàn)胡桃楸成花相關(guān)JmCO蛋白具有N端的纈氨酸富集區(qū)及CCT結(jié)構(gòu)域。

圖9 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因所編碼的蛋白質(zhì)與其他物種同源蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)Figure 9 Amino acid sequence alignment of J mC O encoden protein related to flower formation of Ju gl ans mands hurica with CO homologous proteins in other species

2.3.6 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以幫助我們了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。因此，本研究通過(guò)在線分析軟件SOPMA胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。胡桃楸JmCO蛋白由4種狀態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，無(wú)規(guī)卷曲的氨基酸占整個(gè)蛋白的56.48%，延伸鏈占11.92%，β-折疊占5.92%，α螺旋占3.62%。

2.4 胡桃楸成花相關(guān)J mC O基因熒光定量表達(dá)分析

以Actin為內(nèi)參基因，對(duì)胡桃楸不同器官中CO基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。由圖10可知，胡桃楸成花相關(guān)Jm-C O基因在不同器官中均有表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量：雄花芽＞雌花芽＞莖＞果實(shí)＞葉片。胡桃楸成花相關(guān)基因J mC O在雌、雄花芽中表達(dá)量最高，而在葉片、果實(shí)和莖中表達(dá)量相對(duì)較低，說(shuō)明胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因參與了胡桃楸雌、雄花芽發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，可以推測(cè)JmC O基因在胡桃楸的成花過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

圖10 胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因在不同組織中的表達(dá)Figure 10 Expression of Juglans mandsh urica JmCO in different tissues

3 討論與結(jié)論

高等植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)，意味著植物的童期結(jié)束，因此，成花是植物生命周期非常重要的過(guò)程[10]。CO基因作為植物光周期途徑中的關(guān)鍵基因，在植物成花過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，可以誘導(dǎo)下游成花相關(guān)FT、LFY基因的表達(dá)，促進(jìn)植物開(kāi)花[11]。在長(zhǎng)日照植物中，CO基因編碼的蛋白質(zhì)含B-BOX和CCT結(jié)構(gòu)域，CCT結(jié)構(gòu)域參與多種植物中參加成花誘導(dǎo)[12]。植物中不同的C O基因?qū)﹂_(kāi)花時(shí)間的影響不同。在擬南芥中，過(guò)量表達(dá)C O L 1和COL2對(duì)開(kāi)花時(shí)間不會(huì)產(chǎn)生顯著的影響[13]，而COL3則抑制開(kāi)花，促進(jìn)側(cè)根和芽的發(fā)育，以及光形態(tài)建成[14]，COL5在短日照條件下正調(diào)控開(kāi)花[15]。CO基因在水稻[16]、小麥[17]、衣藻[18]中均有表達(dá)。陸地棉（Goss ypium h irsutum）GhCOL1參與了植物開(kāi)花誘導(dǎo)[19]，葡萄（Vitis vinifera）Vv CO L 1參與種子休眠調(diào)節(jié)[20]，美洲黑楊（Populus deltoid es）的CO1和C O2基因參與了植物形態(tài)調(diào)節(jié)[21]，擬南芥中的COL1基因、歐洲云杉（Picea abies）中的C O L 1基因與牽?；ǎ≒h arb i tis nil）中的C O L基因參與了植物晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[22-23]。趙志琴等[24]對(duì)草莓（Fra garia×ananassa）CO基因克隆和表達(dá)分析研究中發(fā)現(xiàn)Fa C O基因在草莓花芽發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的調(diào)控作用[23]。由此可知，CO基因不僅可以調(diào)節(jié)植物開(kāi)花，在種子休眠、植株形態(tài)調(diào)節(jié)、側(cè)枝(根)分化、果實(shí)成熟、光形態(tài)建成、塊莖發(fā)育等過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[25]。

本研究克隆獲得胡桃楸成花相關(guān)J mC O基因CDS序列長(zhǎng)為582bp，編碼194個(gè)氨基酸。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)表明：胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因與其他物種的CO基因同源性均在70%以上。胡桃楸JmCO蛋白分子式為C927H1451N275O298S11，分子量為21569.04Da；理論等電點(diǎn)8.3；對(duì)胡桃楸成花相關(guān)JmCO基因qRT-PCR進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)JmCO基因在胡桃楸雌、雄花芽中顯著表達(dá)，推測(cè)該基因可能是胡桃楸雌、雄成花過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。這與趙志琴等[24,26]對(duì)水稻（Oryz a sativa）和草莓中CO基因的研究結(jié)果相一致。然而，目前對(duì)胡桃楸成花過(guò)程與CO基因之間的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，且C O家族基因在胡桃楸中是否和其他物種中的C O基因一樣參與光周期調(diào)節(jié)也尚不清楚，其功能需要進(jìn)一步研究。因此，在后續(xù)研究中在本研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展胡桃楸成花相關(guān)基因分子機(jī)理的研究，以期通過(guò)研究深入探討L F Y、F T、C O、TF L、AP1等成花相關(guān)基因在胡桃楸成花過(guò)程中復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探明胡桃楸成花的分子機(jī)理，為胡桃楸良種選育及優(yōu)良基因資源保護(hù)奠定基礎(chǔ)。