弘子姍，王君毅，劉俊佑，龔加順

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

楓香樹(Liquidambar formosanaHance)又名楓樹、大葉楓、黑飯木，是金縷梅科楓香屬落葉喬木[1-2]。楓香性平，味辛、苦，具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛和解毒之功效[3]。楓香常被民間用作食物著色的色素原料[4]，用其汁液染制糯米，蒸出的米飯烏黑發(fā)亮，味道誘人，是云南和貴州等地少數(shù)民族的特色食品“五彩飯”之一[5]。楓香樹葉黑色素是一種多酚類物質(zhì)[6-7]，具有抗氧化[8-9]、抗衰老[10]、抗病毒[11]、抗炎[12-13]、降血壓[14]和抗過敏[15]等生物活性。

針對(duì)植物天然色素提取及其抗氧化活性的研究很多，如鄒青飛等[16]和黃建蓉等[17]對(duì)不同植物色素的提取工藝及抗氧化活性進(jìn)行了研究；也有針對(duì)楓香黑色素的研究，如張莉等[18]研究得出楓香樹葉黑色素的最佳提取工藝條件為60%提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、微波功率700 W、料液比為1∶30、提取時(shí)間55 s；謝宇奇等[19]對(duì)楓香樹葉黑色素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的清除DPPH自由基能力，且清除能力大于二丁基羥基甲苯 (BHT)。但目前在天然色素對(duì)糯米染色方面的研究極少，特別是針對(duì)地方特色“五彩飯”中楓香色素對(duì)糯米的染色作用研究鮮見報(bào)道。楓香色素染制大米，除賦予大米天然色澤外，染色后的米可能具有抗氧化活性等功能，這可能是少數(shù)民族熱衷于利用天然植物制作“五彩飯”的主要原因之一。徐塬等[20-22]對(duì)烏飯樹葉色素對(duì)大米蛋白和淀粉的相互作用進(jìn)行研究，認(rèn)為烏飯樹葉色素與大米蛋白之間以疏水作用和氫鍵作用進(jìn)行結(jié)合，因此，理論上認(rèn)為楓香色素與糯米淀粉和蛋白質(zhì)等的相互作用存在類似情況。

本研究以云南產(chǎn)的人工種植楓香樹葉為原料，采用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)楓香黑色素進(jìn)行提取工藝優(yōu)化；通過體外抗氧化試驗(yàn)，評(píng)價(jià)楓香提取物和糯米在染色前后的抗氧化活性變化；以氣味、外觀結(jié)構(gòu)、適口性、滋味和冷飯質(zhì)地等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)楓香黑米飯感官品質(zhì)進(jìn)行綜合比較；通過掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)初步研究?jī)?yōu)化提取的色素對(duì)糯米的染色表觀性能。綜合以上結(jié)果以期獲得楓香色素最佳提取工藝，明確染色糯米的抗氧化活性，初步揭示楓香色素染色糯米的作用，為楓香染制糯米的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和楓香色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為少數(shù)民族特色食品“五彩飯”的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

楓香樹葉：采自云南省曲靖市師宗縣人工栽培的楓香，楓香鮮葉于30 ℃低溫干燥，避光于室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。糯米?019年產(chǎn)自云南昆明，購(gòu)于云南滇鵬產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

參照謝宇奇等[23]的研究結(jié)果，以60%乙醇溶液為提取溶劑，以270 nm處的吸光度為指標(biāo)，考察提取時(shí)間 (1～8 h)、提取溫度 (30～70 ℃)和料液比 [1∶25～1∶50 (g/mL)]等3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，確定最佳工藝的因素水平。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) (表1)對(duì)楓香黑色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab.1 Independent variables and their levels used in response surface analysis

1.2.3 楓香黑米飯制作及其感官評(píng)價(jià)

(1) 樣品制備

參考傳統(tǒng)民間植物染飯工藝，經(jīng)多次試驗(yàn)確定楓香黑米飯的制作流程。按照確定的最優(yōu)色素提取工藝提取色素溶液(即染料)，將染料加熱至60 ℃，稱取原料糯米，淘洗干凈后倒入染料于室溫下浸泡染色30 min，倒出米，將染料加熱至60 ℃，再次倒入米浸泡染色，重復(fù)3次后將米濾干，于100 ℃蒸制15 min，以備感官評(píng)價(jià)。

(2) 楓香黑米飯感官評(píng)價(jià)

楓香黑米飯及對(duì)照白米飯感官評(píng)價(jià)參照GB/T 15682—2008進(jìn)行并略作修改，由氣味(20分)、外觀結(jié)構(gòu)(30分)、適口性(25分)、滋味(20分)和冷飯質(zhì)地(5分)等5個(gè)部分組成，分別設(shè)立評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以有效地對(duì)楓香黑米飯產(chǎn)品感官品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)比。每組產(chǎn)品由10位品評(píng)員評(píng)分，并以平均分作為產(chǎn)品的最終得分。

1.2.4 楓香黑糯米的微觀形貌分析

樣品制備同1.2.3節(jié)。觀察未染色生糯米和糊化糯米及楓香樹葉黑色素染色生糯米和糊化糯米的微觀結(jié)構(gòu)。用刀片將糯米橫向切斷，米粒的斷面朝上，用離子衍射儀 (Cressington 108，英國(guó))在糯米橫斷面表面進(jìn)行噴金和固定。色素粉末均勻地分散在樣品處理臺(tái)上，采用S-4800 SEM在10.0 kV工作電壓下分別放大200、5 000和10 000倍觀察并記錄。

1.2.5 楓香黑糯米的抗氧化活性評(píng)價(jià)[24-27]

樣品制備同1.2.3節(jié)。以Trolox 作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程，DPPH自由基清除能力回歸方程為：y=0.055x+8.636，R2=0.995；ABTS自由基清除能力回歸方程為：y=0.136x+24.664，R2=0.993；鐵離子還原能力(FRAP)回歸方程為：y=0.004x+0.098，R2=0.991；氧自由基吸收能力(ORAC)回歸方程為：y=0.421x+7.477，R2=0.998。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的抗氧化活性，結(jié)果以每克樣品所需Torlox 的量表示 (μmol/g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；利用SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析和顯著性分析；采用Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面分析；采用Origin 9.1和Graphpad Prism 6.01作圖。所有試驗(yàn)重復(fù)3 次以上，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件對(duì)楓香樹葉黑色素提取效果的影響

由圖1可知：楓香黑色素提取效果隨料液比、提取溫度和提取時(shí)間的增加而均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶40 (g/mL)時(shí)提取效果最好，且與其他料液比相比差異顯著(P<0.05)；當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí)提取效果最好，且與其他提取溫度相比差異顯著(P<0.05)；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到6 h時(shí)提取效果最好，且與除提取時(shí)間7 h外的其他提取時(shí)間相比差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同提取條件對(duì)色素提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction factors on the yield of pigments

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化楓香樹葉黑色素提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到吸光度與提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)的二次方程模型為：Y=0.073 8+0.467 3X1-0.037 1X3+0.000 6X1X2-0.001 0X1X3+0.000 2X2X3-0.039 7X12-0.000 1X22+0.000 4X32?；貧w模型的方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of response surface analysis

由表3可知：模型中一次項(xiàng)X1對(duì)色素提取效果達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，X2對(duì)色素提取效果達(dá)到顯著水平(P<0.05)；模型中交互項(xiàng)X2X3對(duì)色素提取效果達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，X1X3對(duì)色素提取效果達(dá)到顯著水平(P<0.05)；模型中二次項(xiàng)X12和X32對(duì)色素提取效果達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。楓香黑色素提取工藝回歸模型顯著性檢驗(yàn)P<0.000 1，說明該模型達(dá)到極顯著水平；楓香黑色素提取工藝回歸模型失擬項(xiàng)檢驗(yàn)=0.386 9>0.05，可以認(rèn)為所選提取二次回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性充分模型失擬不顯著。試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜎Q定系數(shù)R2=0.978 6，表明方程的擬合度良好，可用于預(yù)測(cè)楓香黑色素提取效果。離散系數(shù)(CV值)為1.014 6%，表明試驗(yàn)的可靠性較高。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確的分析和預(yù)測(cè)楓香黑色素提取工藝，說明試驗(yàn)操作可信度高。由回歸系數(shù)顯著性表明：在所取因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)楓香黑色素提取工藝影響的順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>提取溫度>料液比。

表3 楓香黑色素提取效果回歸模型方差分析表Tab.3 Analysis of variance analysis of degree of the effect of pigments

2.2.2 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

響應(yīng)面圖中越陡峭顯示該因素對(duì)其影響越明顯，反之，越平坦則影響不明顯[28]。由圖2a、2b可知：提取時(shí)間和提取溫度交互作用的等高線圖呈圓形，響應(yīng)面曲面坡度較平緩，表示兩因素交互作用不顯著；而圖2c、2d中提取時(shí)間和料液比、圖2e、2f中提取溫度和料液比交互作用的等高線圖和響應(yīng)面曲面呈馬鞍形，表示兩因素交互作用顯著[29]。在提取溫度和料液比交互作用的等高線圖中，等高線沿料液比的增加方向密集、降低方向稀疏，說明增加料液比會(huì)更顯著地影響色素提取效果。同理，增加提取時(shí)間會(huì)更顯著地影響色素提取效果。

圖2 各兩因素交互作用對(duì)色素提取率的響應(yīng)面Fig.2 The response surface interaction of various factors to the yield of pigments

二次回歸模型擬合結(jié)果顯示：提取時(shí)間5.74 h、提取溫度69.55 ℃、料液比1∶49.98 (g/mL)時(shí)預(yù)測(cè)吸光度為0.766 3。為了驗(yàn)證模型的有效性并考慮到實(shí)際情況，將最佳工藝條件改進(jìn)為提取時(shí)間6 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶50 (g/mL)，并在此條件下的6 次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明吸光度為0.734，與預(yù)測(cè)值接近，說明模型準(zhǔn)確可靠。

2.3 楓香黑米飯的抗氧化活性評(píng)價(jià)

由圖3可知：楓香染料具有較強(qiáng)的抗氧化活性，隨著染色時(shí)間的增加，其抗氧化活性逐漸降低，其DPPH、ABTS、FRAP和ORAC活性顯著降低(P<0.001)，而糯米經(jīng)染色后其抗氧化活性極顯著增加(P<0.001)。此外，空白組(空白水溶液、白糯米)的ABTS、FRAP和ORAC變化均無顯著性差異(P>0.05)。因此，糯米在染色后可以從楓香黑色素中得到較強(qiáng)的抗氧化能力，且差異極顯著(P<0.001)。

圖3 樣品的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of samples

2.4 楓香黑米飯感官評(píng)價(jià)及其微觀形貌分析

2.4.1 楓香黑米飯染色感官評(píng)價(jià)

由表4可知：染色糯米飯的氣味和滋味、彈性和粘性以及總體評(píng)分均顯著低于白米飯 (P<0.05)。

表4 米飯感官評(píng)定結(jié)果Tab.4 Results of sensory evaluation for rice

2.4.2 楓香黑米飯的SEM分析

(1) 楓香黑色素微觀形貌

在SEM掃描電鏡下觀察楓香黑色素的形貌如圖4所示：楓香黑色素顆粒不規(guī)則且多樣，呈現(xiàn)棉絮狀、扁片狀等。

圖4 楓香黑色素顆粒微觀結(jié)構(gòu)(10 000×)Fig.4 Microstructure of melanin from Liquidambar formosana

(2) 生糯米染色前后微觀形貌變化

未染色糯米(簡(jiǎn)稱“白糯米”)和楓香樹葉黑色素染色糯米(簡(jiǎn)稱“黑糯米”)的微觀形態(tài)見圖5。由圖5c可以明顯看出胚乳細(xì)胞顆粒表面有碎屑，可能是淀粉粒與色素發(fā)生相互作用所致。由圖5b、5d可看出：淀粉粒表面由光滑變成皺縮、凹凸不平、粗糙且不均勻，且淀粉粒尺寸明顯增大。

圖5 染色前后生糯米胚乳細(xì)胞表面微觀結(jié)構(gòu)Fig.5 Microstructure of albuminous cells of raw glutinous rice before and after dyeing

(3) 糊化糯米染色前后微觀形貌變化

糊化白糯米和糊化黑糯米的微觀形態(tài)見圖6。由圖6c可看出：糯米胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍處于完整未分解狀態(tài)，而圖6a無胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)，說明相同處理?xiàng)l件的白糯米糊化度明顯高于黑糯米，因此可以推斷色素對(duì)淀粉粒的附著包埋會(huì)降低糯米粒的吸水作用，阻礙淀粉分子散開，減慢糊化進(jìn)程。由圖6d可以看出：黑糯米的淀粉粒糊化是混亂無序的，糯米胚乳細(xì)胞截面孔洞大小不一，裂縫為撕裂形態(tài)，與白糯米形成整齊的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)完全不同。

圖6 染色前后糊化糯米胚乳細(xì)胞表面微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructure of albuminous cells of gelatinized glutinous rice before and after dyeing

3 討論

楓香黑色素作為天然色素具有廣闊的開發(fā)利用前景。ZHANG等[30]研究發(fā)現(xiàn)：楓香樹葉提取物中含有豐富的酚類和單寧物質(zhì)，其DPPH和ABTS自由基清除能力分別為IC5012.04 μg/mL和IC5017.11 μg/mL；WANG等[31]對(duì)楓香葉提取物進(jìn)行抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)：所有提取物均有較高的抗氧化活性，且抗氧化活性強(qiáng)弱為：乙醇提取物>水提物>丙酮提取物。本研究表明：楓香黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其對(duì)DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力和氧自由基吸收能力分別為(798.516±13.544)、(494.664±0.957)、(993.000±20.418)和(2 202.293±51.375) μmol/g，與上述研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)：糯米經(jīng)染色后，其抗氧化能力隨著染色時(shí)間的增加而極顯著增加 (P<0.001)，楓香色素染制糯米不僅對(duì)糯米賦色，還賦予糯米抗氧化功效。少數(shù)民族“五彩飯”中其他顏色可能存在類似功效，還需進(jìn)行后續(xù)研究。

楓香黑米飯感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明：糯米經(jīng)楓香染色后，對(duì)糯米飯的感官品質(zhì)有一定影響，其感官評(píng)分與白糯米飯相比顯著下降 (P<0.05)，特別是氣味和滋味，需要進(jìn)一步改進(jìn)。原因可能是楓香植物中具有獨(dú)特的氣味物質(zhì)成分，部分人不能接受其氣味和風(fēng)味。因此，對(duì)楓香黑米飯染色工藝進(jìn)行優(yōu)化，特別是對(duì)染色糯米飯風(fēng)味物質(zhì)的研究尤其重要，染色米飯中影響感官品質(zhì)氣味和滋味的問題亟待解決。本研究還發(fā)現(xiàn)：染色米飯的粘性和彈性也顯著下降(P<0.05)，且染色米飯的糊化程度明顯較白米飯低，表明多酚類物質(zhì)與淀粉的結(jié)合會(huì)顯著降低淀粉的糊化及消化[32-34]。楓香黑色素的吸附導(dǎo)致黑糯米在相同處理?xiàng)l件下的糊化度較低，從而影響其粘性和彈性，因此，后續(xù)研究需考慮如何避免此情況引起的染色糯米飯感官品質(zhì)下降。

前人主要通過多酚或黃酮類物質(zhì)與淀粉或蛋白之間的相互作用對(duì)天然色素進(jìn)行研究。徐塬等[20-22]對(duì)烏飯樹葉色素對(duì)大米蛋白和淀粉的相互作用進(jìn)行研究，認(rèn)為烏飯樹葉色素與大米蛋白之間以疏水作用和氫鍵作用進(jìn)行結(jié)合。劉立增等[35]研究發(fā)現(xiàn)：羥基紅曲紅色素分子與淀粉顆粒間的吸附是以氫鍵為主的物理吸附。AMOAKO等[36]研究發(fā)現(xiàn)：直鏈淀粉和聚合原花青素之間形成II型半結(jié)晶V型包合物。TAKAHAMA等[37]在研究淀粉與花青素—兒茶素色素的相互作用中發(fā)現(xiàn)：淀粉與多酚絡(luò)合物的疏水作用可能會(huì)抑制淀粉消化。楓香黑色素屬于多酚類物質(zhì)，其對(duì)糯米的染色與糯米淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的相互作用存在類似情況，但目前針對(duì)“五彩飯”中楓香色素對(duì)糯米的染色作用研究鮮見報(bào)道。本研究用楓香對(duì)糯米進(jìn)行染色，通過觀察其微觀結(jié)構(gòu)確定其與色素發(fā)生了相互作用，為后期與淀粉和蛋白互作的研究提供了基礎(chǔ)。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)：經(jīng)染色后糯米淀粉粒由表面光滑變?yōu)榘櫩s、凹凸不平、粗糙且不均勻，在同一放大倍數(shù)下，糯米胚乳細(xì)胞中淀粉粒粒徑明顯增大，這一現(xiàn)象與劉立增等[35]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)色素吸附會(huì)影響淀粉的糊化，糊化程度降低，導(dǎo)致淀粉粒糊化狀態(tài)由三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)變?yōu)榛靵y無序的撕裂狀態(tài)，原因可能是色素的吸附影響了蒸制過程中淀粉的吸水作用，阻礙淀粉分子散開，使糊化進(jìn)程減慢，但在此過程中分子是如何推動(dòng)這些現(xiàn)象的發(fā)生亟待深入研究。

4 結(jié)論

提取楓香黑色素的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃、提取時(shí)間6 h、料液比1∶50 (g/mL)，此條件下楓香黑色素的吸光度可達(dá)0.734。楓香黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，糯米在染色后可以從楓香黑色素中獲得較強(qiáng)的抗氧化性。染色對(duì)糯米的感官品質(zhì)有一定影響，特別是氣味和滋味。糯米淀粉粒與色素發(fā)生相互作用，導(dǎo)致淀粉粒形態(tài)改變，尺寸增大，染色后糯米糊化度降低。