李春芽， 陳遠(yuǎn)兵， 梁銀華， 唐 淼， 曹武陽

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的80%，年發(fā)病率約為6.6/10萬[1-2]。目前，最大安全范圍內(nèi)的手術(shù)切除腫塊是膠質(zhì)瘤最有效的治療方式。而膠質(zhì)瘤位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有局部侵襲和破壞神經(jīng)功能區(qū)的特點(diǎn)，手術(shù)全切困難且易復(fù)發(fā)，使其具有較高的致殘性和致死性，整體5年存活率約為35%[3]。迄今為止，雖然有部分分子能夠有效預(yù)測患者的預(yù)后[2，4-6]，但膠質(zhì)瘤仍缺乏特異性的分子標(biāo)志物用于準(zhǔn)確判斷患者預(yù)后以及作為靶向治療的有效分子靶點(diǎn)[7]。因此，進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志物及潛在的分子治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)損傷在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，且在相關(guān)研究中均提示DNA損傷的調(diào)控也參與腫瘤的治療抵抗，故有必要針對參與DNA損傷的分子進(jìn)行研究[8-10]。而乳酸脫氫酶A的α復(fù)合體4-L2[NADH dehydrogenase(ubiquinone) 1 alpha subcomplex 4-like 2，NDUFA4L2]是線粒體中電子傳輸鏈(electron- transport chain，ETC)復(fù)合物I亞基的一個(gè)組成部分，在缺氧環(huán)境中高度表達(dá)，同時(shí)也是缺氧誘導(dǎo)因子的下游靶基[11]。且NDUFA4L2可以介導(dǎo)線粒體中的氧化磷酸化和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，并且NDUFA4L2蛋白能夠抑制癌細(xì)胞中ROS的生成，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，進(jìn)而保護(hù)由ROS誘導(dǎo)的DNA損傷[8，12]。目前，在骨肉瘤、肺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肝癌等惡性腫瘤的研究中，均發(fā)現(xiàn)NDUFA4L2發(fā)揮癌基因的功能作用[8，12-16]。然而，目前鮮見NDUFA4L2在膠質(zhì)瘤中的相關(guān)研究。因此，為明確NDUFA4L2在膠質(zhì)瘤中的作用，本研究通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)數(shù)據(jù)庫分析膠質(zhì)瘤組織中NDUFA4L2的表達(dá)，探討NDUFA4L2與患者臨床病理分級的相關(guān)性，并通過收集臨床資料進(jìn)行驗(yàn)證，從而探討其臨床診斷及預(yù)后判斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2017年1月至2019年6月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為膠質(zhì)瘤的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本62例，在組織獲取后立即凍存于-80 ℃冰箱備檢。同時(shí)收集相應(yīng)患者的臨床資料，并開展臨床隨訪。本研究獲得了所有患者的書面知情同意及中南大學(xué)湘雅醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2生物信息學(xué)分析 本研究中生物信息學(xué)分析的相關(guān)數(shù)據(jù)均來自以下公共數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站：TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)和CGGA(http://www.cgga.org.cn/)。通過下載數(shù)據(jù)，然后將基因表達(dá)量與對應(yīng)的臨床信息進(jìn)行匹配。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)病理分級系統(tǒng)可將其分成Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級，然后提取相對應(yīng)患者的NDUFA4L2表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)分析NDUFA4L2表達(dá)量對患者生存期的預(yù)測價(jià)值。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測 將膠質(zhì)瘤組織、切碎、研磨，加入1 ml Trizol裂解組織，并按Trizol抽提總RNA的試劑盒(Invitrogen公司)說明書提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再使用RT-PCR儀進(jìn)行檢測，設(shè)定RT-PCR的運(yùn)行程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min 35個(gè)循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)照。RT-PCR引物序列：NDUFA4L2正向引物：5′-CTGGGACAGAAAGAACAACCCG-3′，反向引物：5′-CAGCCTGGCTTAGAAGTCTGGC-3′；β-actin正向引物：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′，反向引物：5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′。

1.4免疫組織化學(xué)法檢測 切取腦膠質(zhì)瘤組織的石蠟包塊制備病理切片，并進(jìn)行烤片，后置于枸緣酸鈉緩沖液中加熱行抗原修復(fù)，加入3%過氧化氫溶液中以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)沖洗3次。然后孵育NDUFA4L2一抗(Proteintech公司；兔源性，1∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，加入二抗，室溫反應(yīng)90 min，再以PBS沖洗3遍，最后進(jìn)行染色、脫水、封片。

1.5隨訪 采用電話溝通的方式進(jìn)行隨訪?？偵嫫?overall survival，OS)為手術(shù)時(shí)間至最后隨訪日或死亡時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1NDUFA4L2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平 在TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫中，膠質(zhì)瘤組織中NDUFA4L2 mRNA的表達(dá)水平隨著WHO分級的增高而明顯升高(圖1??)。62例膠質(zhì)瘤組織樣本(包括WHO Ⅱ～Ⅳ級)的RT-PCR檢測結(jié)果也顯示，NDUFA4L2 mRNA也隨著膠質(zhì)瘤WHO分級的升高而上調(diào)(圖1?)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測不同級別膠質(zhì)瘤樣本(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級)中的NDUFA4L2蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NDUFA4L2蛋白的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤WHO分級的升高而上調(diào)(圖2)。

圖1 NDUFA4L2 mRNA在各級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平比較圖

?WHO Ⅱ級；?WHO Ⅲ級；?WHO Ⅳ級

2.2NDUFA4L2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)聯(lián)性 對TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫所獲取數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，高NDUFA4L2 mRNA表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者其OS較短(P<0.05)(圖3??)。同樣的，針對臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，NDUFA4L2 mRNA低表達(dá)者其OS更長(P<0.05)(圖3?)。

圖3 高、低NDUFA4L2 mRNA表達(dá)水平膠質(zhì)瘤患者的生存曲線圖

3 討論

3.1膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有侵襲性生長的特點(diǎn)，從而破壞或影響神經(jīng)系統(tǒng)功能，有較高的致死性和致殘性[17]。從惡性程度來分析，膠質(zhì)瘤作為腦腫瘤中惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)的中樞系統(tǒng)腫瘤，具有高浸潤性、瘤內(nèi)異質(zhì)性、增殖速度快及易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[18]。WHO分級系統(tǒng)是目前膠質(zhì)瘤惡性程度以及預(yù)后判斷的經(jīng)典方法，但是仍有一定的局限性[19]。近年來，分子靶向治療在癌癥治療中越來越重要，尤其在肺癌的分子靶向治療中[20]。因此，為膠質(zhì)瘤的診療及預(yù)后判斷尋找新的分子治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)NDUFA4L2的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的惡性程度及預(yù)后相關(guān)。

3.2已有研究證實(shí)，NDUFA4L2在相關(guān)腫瘤中呈高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)，提示NDUFA4L2可能是一種有應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物[8，14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)NDUFA4L2表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤WHO病理分級的增高而升高，表明NDUFA4L2的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。提示NDUFA4L2表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)，故有望通過檢測膠質(zhì)瘤中NDUFA4L2的水平來協(xié)助評估膠質(zhì)瘤的惡性程度。本研究的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示NDUFA4L2主要分布在胞漿中，而相關(guān)研究顯示NDUFA4L2主要位于線粒體并影響細(xì)胞的氧化磷酸化和ROS的產(chǎn)生[11-13]，也進(jìn)一步證實(shí)NDUFA4L2在膠質(zhì)瘤中也可能通過影響線粒體電子傳遞進(jìn)而影響能量轉(zhuǎn)化以及抗氧化應(yīng)激，最終影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，有可能通過靶向NDUFA4L2來影響膠質(zhì)瘤的能量代謝及抗氧化應(yīng)激能力，從而抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。

3.3本研究發(fā)現(xiàn)NDUFA4L2不但與膠質(zhì)瘤的病理分級相關(guān)，還與患者預(yù)后相關(guān)。NDUFA4L2的表達(dá)量越高，則膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后越差，這可能與NDUFA4L2影響膠質(zhì)瘤能量代謝和抗氧化應(yīng)激能力相關(guān)。當(dāng)NDUFA4L2改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能量代謝，同時(shí)提高膠質(zhì)瘤的氧化應(yīng)激能力后，就會促進(jìn)膠質(zhì)瘤的快速生長，從而增加患者的瘤負(fù)荷壓力，最終影響膠質(zhì)瘤患者的生存期。因此，NDUFA4L2有望作為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的分子標(biāo)志物，可通過檢測NDUFA4L2的表達(dá)量來協(xié)助預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的生存期。

綜上所述，NDUFA4L2有望成為膠質(zhì)瘤分級及預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物，在后續(xù)研究可以進(jìn)一步針對NDUFA4L2展開深入的研究，并設(shè)計(jì)靶向藥物進(jìn)行臨床應(yīng)用。