劉立娜，楊寶明，王永芬，3，曾 莉，黃玉玲，李永平，尹可鎖，李迅東，彭學彬，徐勝濤，番華彩，白亭亭，張 晶，4，李 舒，鄭泗軍，5

(1 云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點實驗室，昆明，650205；2 云南農(nóng)業(yè)大學/省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明，650201；3 云南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所，云南保山，678000；4 云南大學農(nóng)學院/云南大學資源植物研究院，昆明，650500；5 國際生物多樣性中心，昆明，650205)

香蕉在熱帶和亞熱帶國家是非常重要的經(jīng)濟作物和糧食作物之一[1]。然而，全球香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展正受到枯萎病的嚴重威脅。云南作為我國香蕉重要產(chǎn)區(qū)之一，大面積栽培的優(yōu)良品種巴西蕉是易感病品種，缺乏綜合農(nóng)藝性狀良好的抗病種質(zhì)資源[2]。因此，遴選和儲備抗病香蕉種質(zhì)資源對云南有效防治香蕉枯萎病具有戰(zhàn)略性的意義。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf. sp.cubense侵染引起的維管束壞死的真菌病害，其分布廣、擴散快、毀滅性強、尚無有效的防控措施[3-4]。特別是4號生理小種熱帶型(TR4)為害尤為嚴重，大量香蕉種植園因TR4而被撂荒[5-7]。香蕉無性繁殖和遺傳基礎單一加大了傳統(tǒng)方法選育抗病種質(zhì)資源的應用難度，在現(xiàn)有香蕉資源中遴選抗病種質(zhì)資源對于防控TR4十分關鍵。傳統(tǒng)的抗病性評價通常在田間進行，對親本品系的選擇至關重要，但是該種評價方式耗時耗力，病原菌在大田分布不均勻且需要大量農(nóng)田[8]。溫室枯萎病抗性的評價利用有限空間、可控生長條件和防止其他生物交叉感染等方面優(yōu)勢，大多數(shù)種質(zhì)資源的評價周期短且評估準確[9-10]。蒲金基等認為香蕉對枯萎病的抗性不僅與寄主本身的遺傳特性有關，還會受到病原菌種類、濃度以及環(huán)境因素的影響[11-12]。由于各個香蕉產(chǎn)區(qū)枯萎病菌的遺傳背景不同，在一地表現(xiàn)抗病的種質(zhì)資源很可能在其他環(huán)境中表現(xiàn)為感病[10]。研究表明不同來源的菌株對寄主植株表現(xiàn)出不同的致病力[13]，香蕉對不同來源的TR4響應中也發(fā)現(xiàn)了差異，GCTCV-119在苗期接種TR4菌株VCG01213/16表現(xiàn)為抗病，對TR4菌株FOC35表現(xiàn)為中抗[9，14]。VCG01213/16分離于廣東省，而FOC35由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分離于海南省，因此分離于不同地區(qū)的TR4菌株致病力和致病寄主范圍都有可能存在差異?；谖覀円褟膰H生物多樣性研究中心引進百余份香蕉種質(zhì)資源和在云南西雙版納分離到強致病力的TR4菌株[10，15]，本研究在溫室內(nèi)測定不同濃度云南菌株TR4(15-1)侵染下香蕉種質(zhì)資源球莖的病情指數(shù)，評估香蕉種質(zhì)資源對云南菌株TR4(15-1)的抗性，確定具有抗性的種質(zhì)資源；結(jié)合本文香蕉種質(zhì)資源對其他來源TR4菌株侵染的響應，篩選具有廣譜抗病性的香蕉種質(zhì)資源，為云南產(chǎn)區(qū)香蕉抗病資源的儲備、抗病種質(zhì)資源的應用和抗病基因的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從國際生物多樣性研究中心引進，保存于云南省農(nóng)業(yè)科學院的11份香蕉種質(zhì)資源，種質(zhì)資源信息見表1。11份種質(zhì)資源包含有AA基因型2份，AAA基因型8份，AAB基因型1份，其中Pahang為抗病種質(zhì)，Baxi Jiao為感病種質(zhì)。

供試病原菌為在云南西雙版納分離的強致病性野生型菌株TR4(15-1)[10，15]。

表1 11份保存于云南省農(nóng)業(yè)科學院的香蕉種質(zhì)

1.2 香蕉幼苗培養(yǎng)

供試11份香蕉種質(zhì)資源組織培養(yǎng)幼苗在椰糠基質(zhì)中培養(yǎng)約6周，生長至高10 cm后接種菌株TR4(15-1)，每份種質(zhì)每批接種20株以上，2019年7月和2019年8月分別接種2批。

1.3 菌株TR4(15-1)孢子的培養(yǎng)

將-80 ℃保存的菌株TR4(15-1)接種于PDA平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d產(chǎn)孢，用無菌水洗脫PDA平板上的分生孢子，注入裝有300 mL PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，25 ℃下150 rpm搖瓶培養(yǎng)3 d；兩層紗布過濾去除菌絲，采用血球計數(shù)板在顯微鏡下將孢子液濃度調(diào)整至1×106個孢子/mL和1×108個孢子/mL。

PDA培養(yǎng)基配置方法：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，用1 000 mL水煮沸15 min，四層紗布過濾去馬鈴薯殘渣，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。PDA液體培養(yǎng)基為不加瓊脂粉的PDA培養(yǎng)基。

1.4 接種方法

采用傷根浸菌法接種[16]，略作修改。取出椰糠中培養(yǎng)的香蕉苗，把待接種的香蕉苗按照種質(zhì)資源編號有序取出擺好，用剪刀將香蕉苗根系修剪至長5 cm左右，將根浸沒于孢子懸浮液中(濃度分別為1×106個孢子/mL和1×108個孢子/mL)，間隔5 min攪拌1次懸浮液；30 min后取出浸泡香蕉苗移栽于混合基質(zhì)土(質(zhì)量250 g)的盆缽中，再分別以接種量1×106個孢子/mL和1×108個孢子/mL灌根。

1.5 病情指數(shù)調(diào)查

分別在接種14 d和20 d解剖球莖調(diào)查發(fā)病情況，枯萎病情況按照0～4級分級[17]，計算病情指數(shù)。病情指數(shù)=Σ(各級病株數(shù)×相應級數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高級數(shù))×100。采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，TTEST進行差異顯著性檢驗。

1.6 抗病性評估

不同種質(zhì)資源的抗病性評估參考文獻[9]，根據(jù)接種后20 d病情指數(shù)將香蕉種質(zhì)資源對TR4的抗性分為6個等級，分別為植株免疫(I)，病情指數(shù)=0；高抗(HR)，0<病情指數(shù)<20；抗病(R)，20≤病情指數(shù)<40；中抗(MR)，40≤病情指數(shù)<60；感病(S)，60≤病情指數(shù)<80；高感(HS)，80≤病情指數(shù)≤100。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉種質(zhì)對云南菌株TR4(15-1)侵染的響應

試驗結(jié)果看出，不同種質(zhì)資源接種菌株TR4(15-1) 1×106個孢子/mL后14 d和20 d，抗病種質(zhì)Pahang病情指數(shù)分別為10.42和28.57，感病種質(zhì)資源Baxi Jiao病情指數(shù)分別為43.75和79.43，表明接種數(shù)據(jù)可靠，可用于進一步分析。接種后14 d，Baxi Jiao的病情指數(shù)顯著高于其他種質(zhì)，其他種質(zhì)之間病情指數(shù)無顯著性差異；接種20 d，Baxi Jiao、Banksii、Ibwi的病情指數(shù)顯著高于Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira以及抗病種質(zhì)Pahang?？共》N質(zhì)Pahang與Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira接種14 d的病情指數(shù)范圍為3.12～18.75，接種20 d的病情指數(shù)范圍為20.31～29.27，劃分等級為抗病R。香蕉種質(zhì)資源Akpakpak病情指數(shù)高于Pahang，分別為28.75和40.42，顯著低于感病種質(zhì)資源Baxi Jiao，抗性等級為中抗MR。說明接種TR4(15-1) 1×106個孢子/mL條件下，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Pahang是云南菌株TR4(15-1)的抗病種質(zhì)資源。

11份香蕉種質(zhì)資源接種菌株TR4(15-1)1×108個孢子/mL后14 d和20 d，Pahang的病情指數(shù)分別為21.25和31.25，為抗病種質(zhì)資源；Baxi Jiao為感病種質(zhì)資源，病情指數(shù)分別為71.25和70.31，表明接種條件可靠。接種14 d，Baxi Jiao和Banksii的病情指數(shù)顯著高于其他種質(zhì)。接種20 d，Baxi Jiao、Banksii、Ibwi、GCTCV-19、Gros Michel的病情指數(shù)顯著高于Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak以及Pahang?？共》N質(zhì)資源Pahang與Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak接種20 d的病情指數(shù)范圍是21.87～39.06，抗病等級為抗病R(見表2、圖1和圖2)。說明病菌高濃度條件下，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Pahang仍然是云南菌株TR4(15-1)的抗病種質(zhì)。

表2 11份香蕉種質(zhì)接種枯萎病菌TR4(15-1)不同濃度孢子懸浮液后病情指數(shù)比較

圖1 11份香蕉種質(zhì)接種香蕉枯萎病菌TR4(15-1)1×106 個孢子/mL后解剖球莖變化

圖2 11份香蕉種質(zhì)接種香蕉枯萎病菌TR4(15-1)1×108 個孢子/mL后解剖球莖變化

2.2 香蕉種質(zhì)對菌株TR4(15-1)不同濃度菌液的響應差異

試驗結(jié)果看出，Pahang、Igitsiri、Mbwazirume和Inkira病情指數(shù)在接種常規(guī)濃度(1×106個孢子/mL)條件下小于接種高濃度(1×108個孢子/mL)，但數(shù)據(jù)無顯著性變化，均為抗病R；Baxi Jiao、Banksii、Ibwi 3份種質(zhì)在接種低濃度和高濃度條件下均劃分為感病種質(zhì)；Gros Michel和GCTCV-119在不同濃度條件下病情指數(shù)變化較大，等級由中抗MR到感病S(見圖3)。說明對接種不同濃度菌株響應相同的香蕉種質(zhì)資源占81.82%，相關系數(shù)R2>0.78；香蕉種質(zhì)資源接種常規(guī)濃度即可明確其對菌株TR4的抗病等級。

注：線圈代表病情指數(shù)。

2.3 香蕉種質(zhì)對不同來源菌株TR4的響應差異

試驗結(jié)果看出，9份種質(zhì)對不同來源菌株TR4的抗病性基本一致，占比為81.83%。差異較大的種質(zhì)資源是Banksii和Ibwi，它們對廣東菌株TR4(VCG01213/16)表現(xiàn)為抗病，對云南菌株TR4(15-1)表現(xiàn)為感病。

篩選的6份抗病種質(zhì)，即Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang在不同來源菌株TR4侵染下，均表現(xiàn)為抗病，具有廣譜抗病性(見表3)。

表3 11份香蕉種質(zhì)資源對不同地區(qū)香蕉枯萎病菌4號生理小種的抗性評估

3 結(jié)論與討論

香蕉枯萎病已成為全球香蕉產(chǎn)業(yè)和糧食安全的主要威脅[19-20]，抗枯萎病種質(zhì)資源篩選是有效利用抗病材料或抗病基因的前提[21]。田間抗病性評價耗時耗力，需要大量農(nóng)田，且評估可重復性較差[8]。溫室枯萎病抗性評價可以在有限的空間、可控的條件下進行，可防止其他生物的交叉感染，且周期短，評估準確性高[10，18]。因此，我們選擇在溫室對引進的11份香蕉種質(zhì)資源進行抗病性評估。試驗篩選出6份抗病種質(zhì)資源，即Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang，下一步將在西雙版納枯萎病重病基地進行這些種質(zhì)農(nóng)藝性狀和大田抗性的進一步評估。

高接種量可用于鑒定高抗性種質(zhì)資源[10]。一般當接種濃度達到103個孢子/mL，感病種質(zhì)即可發(fā)病。試驗中，接種TR4(15-1)高濃度1×108個孢子/mL時，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang仍然表現(xiàn)為抗病，接種20 d的病情指數(shù)范圍是21.87～39.06，接近抗病種質(zhì)Pahang的病情指數(shù)31.25，抗病等級為抗病R。因此，對于云南菌株TR4(15-1)，這6個種質(zhì)是抗病種質(zhì)。

香蕉種質(zhì)資源對枯萎病的抗性主要取決于寄主本身的遺傳特性[9，14]，雖然受到病原菌接種劑量的影響，但大多數(shù)香蕉種質(zhì)資源抗病等級一般不會變化?？共∠憬斗N質(zhì)接種高濃度的云南菌株TR4(15-1)后病情指數(shù)大于常規(guī)濃度接種，這主要由于接種劑量影響感染速度[8]。在植物組織中檢測到孢子數(shù)量與一些物種的抗性水平顯著相關，如苜蓿，鷹嘴豆等[22-23]，除GCTCV-119和Gros Michel外，本研究未發(fā)現(xiàn)同一種質(zhì)在不同濃度間的抗性存在顯著性差異。

各香蕉產(chǎn)區(qū)枯萎病菌的遺傳背景不同，表現(xiàn)抗病的種質(zhì)資源很可能在另一地就表現(xiàn)為感病[24]。本研究收集了11份香蕉種質(zhì)對廣東菌株TR4(VCG01213/16)侵染的影響，在云南菌株1×106個孢子/mL接種濃度下，除Banksii和Ibwi兩份種質(zhì)由抗病變?yōu)楦胁?，其余種質(zhì)抗病情況基本一致，占比達81.82%。因此，香蕉種質(zhì)資源對TR4的抗病性受TR4菌株來源、菌株濃度的影響，但具有決定性的因素仍然是香蕉種質(zhì)資源本身的遺傳特性。

GCTCV-119在苗期接種廣東菌株TR4(VCG 01213/16)表現(xiàn)為抗病[18]，對海南菌株TR4(FOC 35)表現(xiàn)為中抗[14]，云南菌株TR4(15-1)常規(guī)濃度侵染下表現(xiàn)為中抗，高濃度下表現(xiàn)為感病。GCTCV-119是目前認可的抗病種質(zhì)資源，而不同研究中其抗病性不一致。一方面可能由于接種菌株及接種量的差異[11，22-23]，我們選擇的TR4菌株為強致病力菌株15-1[10]，且接種量極高。Banksii和Ibwi兩份種質(zhì)對TR4(VCG 01213/16)和TR4(15-1)的抗性由抗病變?yōu)楦胁?，也表明我們使用的菌株具有較強致病性。另一方面可能與植物的生長發(fā)育時期相關，植物對多種病害的抗性可能受其生長時期的影響[25-26]。成熟植株的抗性明顯強于幼苗[27]，成熟植株的免疫反應和細胞保護結(jié)構(gòu)均增強(如細胞壁加厚)，有助于其抵抗病原菌侵害。香蕉種質(zhì)資源的組成型抗性和誘導抗性是其對病原菌抗性的共同原因[28]。研究顯示GCTCV-119雖然在苗期表現(xiàn)為感病，但是在田間表現(xiàn)為抗病[11]，我們在西雙版納枯萎病重病基地的田間初步調(diào)查結(jié)果也支持GCTCV-119為抗病種質(zhì)資源。

植物對病原菌侵染的響應取決于植物、病原菌和環(huán)境等因素，研究結(jié)果表明香蕉種質(zhì)資源對枯萎病菌的抗性主要決定于寄主本身的遺傳特性。因此，篩選云南菌株TR4(15-1)抗性香蕉種質(zhì)資源，應用抗病種質(zhì)資源和抗病基因科學防控云南香蕉枯萎病至關重要。我們評估了11份香蕉種質(zhì)資源對云南菌株TR4(15-1)及其不同濃度的抗病性，篩選了6份高抗病種質(zhì)資源，且這些資源對不同來源TR4菌株均表現(xiàn)為抗病，對TR4的抗性具廣譜性；而Banksii、Ibwi、GCTCV-119、Gros Michel這4份種質(zhì)資源對不同來源菌株和不同菌株濃度的響應變化較大。本試驗結(jié)果為云南香蕉種質(zhì)資源的多樣性利用，抗枯萎病種質(zhì)資源的應用奠定了基礎。