王 宇, 韓 毅

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

干旱是地球上最嚴(yán)重的非生物脅迫之一,嚴(yán)重影響作物生長及產(chǎn)量,導(dǎo)致農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)巨大的損失[1]。植物的根系是最先感受到干旱的,而干旱會(huì)對(duì)植物根系造成無法挽回的損傷[2]。植物的根系會(huì)避開土壤中缺水干旱的地方,自發(fā)地向水勢(shì)高的區(qū)域生長,這是植物根系的向水性(hydrotropism)生長[3-5]。但是植物的向水性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前還不清楚,因此尋找該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵信號(hào)分子能夠大大豐富植物抗旱的機(jī)制。

活性氧通常在植物細(xì)胞體內(nèi)作為細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)分子,參與植物的生長發(fā)育和向性生長等活動(dòng)過程的調(diào)節(jié)[6]。而過氧化氫(H2O2)作為細(xì)胞產(chǎn)生的一種活性氧,是動(dòng)植物細(xì)胞響應(yīng)各種應(yīng)激反應(yīng)的重要信號(hào)分子,也是植物在受到各種生物和非生物脅迫下的重要信號(hào)分子。H2O2對(duì)于感知逆境信號(hào),激活植物下游防御系統(tǒng)來應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫起著至關(guān)重要的作用,而且還能夠傳導(dǎo)調(diào)控一系列脅迫應(yīng)答[7]。H2O2是否參與植物根部向水性的調(diào)控尚不清楚。

為了探究H2O2信號(hào)和植物根部向水性之間的關(guān)系,本研究采用代謝H2O2的2個(gè)關(guān)鍵酶的擬南芥突變體,分別為過氧化氫酶(catalase)突變體cat2和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase)突變體apx1。通過放大H2O2的信號(hào),研究脅迫環(huán)境下H2O2信號(hào)和向水性之間的相關(guān)性。為了模擬干旱脅迫,本研究采用山梨醇(sorbitol)配置滲透脅迫培養(yǎng)基，模擬干旱脅迫下水勢(shì)的差別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所使用的擬南芥種子均購自美國擬南芥種子中心,擬南芥(Arabidopsisthliana)哥倫比亞野生型(Col-0),過氧化氫酶2(cat2)缺失突變體和抗壞血酸過氧化物酶(apx1)突變體。轉(zhuǎn)基因植株為DR5::N7-VENUS和cat2DR5::N7-VENUS[8]。

1.1.2 儀器與試劑

主要試劑有MURASHIGE&SKOOG MEDIUM、MES、蔗糖、山梨醇、Agar、無菌水、高樂士(主要成分次氯酸鈉)。

主要儀器有高溫高壓滅菌鍋、恒溫光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、分析天平、激光共聚焦顯微鏡、掃描儀、方形培養(yǎng)板等。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥種子的滅菌

整個(gè)過程在超凈工作臺(tái)中工作,先將適量的擬南芥種子裝入1.5 mL離心管中,用70%的乙醇清洗3 min,隨后用無菌槍頭將乙醇吸出,再用25%的高樂士清洗10 min;然后用無菌水清洗5次,每次5 min;最后用無菌的槍頭將種子點(diǎn)在配好的1/2MS培養(yǎng)基上。

1.2.2 擬南芥的種植過程

將種子點(diǎn)在1/2MS培養(yǎng)基后,放置于4 ℃冰箱春化3 d后,拿出放在人工氣候培養(yǎng)間培養(yǎng),培養(yǎng)板垂直放置。待種子生長至5 d后,用無菌鑷子將萌發(fā)的幼苗移到相應(yīng)的脅迫培養(yǎng)板上。

擬南芥光照周期為長周期(16 h光照,8 h黑暗);溫度為白天22 ℃,夜晚18 ℃;濕度為65%。

1.2.3 滲透脅迫培養(yǎng)基的配置

待1/2MS培養(yǎng)基冷卻后,用滅菌的刀片將白線以下的1/2MS培養(yǎng)基切除,然后將配置好的滲透脅迫培養(yǎng)基倒入,靜置20 min等培養(yǎng)基自然冷卻凝固。

1.2.4 雜交轉(zhuǎn)基因突變體

利用cat2和DR5::N7-VENUS分別為母本和父本進(jìn)行雜交,將DR5::N7-VENUS的花粉涂抹在cat2的柱頭上雜交獲得F1代,將F1代種下,經(jīng)過擬南芥本身的自交產(chǎn)生F2代。通過鑒定獲得純合的cat2DR5::N7-VENUS。

1.2.5 生長素?zé)晒庑盘?hào)的測(cè)定

通過激光共聚焦顯微鏡觀察DR5::N7-VENUS和cat2DR5::N7-VENUS的根尖生長素?zé)晒庑盘?hào)。激發(fā)波長為488 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 脅迫培養(yǎng)模式

擬南芥在滲透脅迫培養(yǎng)基中生長的模式如圖1所示。采用垂直板培養(yǎng)。圖1中,白線以下為配置的脅迫培養(yǎng)基,將生長5 d的擬南芥幼苗用無菌鑷子移至白線處,根尖緊挨著白線處界限。

圖1 脅迫處理擬南芥模式

將生長5 d大小的擬南芥幼苗按照模式圖移至脅迫培養(yǎng)基上,6 h后發(fā)現(xiàn)擬南芥幼苗的根尖發(fā)生向水性彎曲,其表型如圖2所示,從圖2可看出,在正常1/2MS培養(yǎng)基上生長的野生型擬南芥(Col-0)根尖表現(xiàn)出繼續(xù)往下生長,而在0.4 mol/L山梨醇培養(yǎng)基上的Col-0根尖避開了加山梨醇的培養(yǎng)基,根尖彎曲朝著水勢(shì)較高的正常1/2MS培養(yǎng)基生長。

圖2 脅迫處理下根尖的表型

本文將重力方向定義為0°,統(tǒng)計(jì)根尖與重力方向的夾角,取10°為一個(gè)范圍，朝右彎曲定義為正值,根尖向水彎曲角度如圖3所示。圖3中圓圈的數(shù)字代表統(tǒng)計(jì)苗的個(gè)數(shù),細(xì)長矩形代表該彎曲角度占統(tǒng)計(jì)擬南芥總數(shù)的比例。由圖3可知，在統(tǒng)計(jì)的對(duì)照組中-5°～5°范圍內(nèi)有21棵,5°～15°有2棵,-15°～-5°有1棵,-25°～-35°有2棵,-45°～-55°有2棵;在0.4 mol/L 山梨醇培養(yǎng)基上的擬南芥幼苗在5°～15°有7棵,15°～25°有6棵,25°～35°有8棵,35°～45°有10棵,45°～55°有4棵。后續(xù)均用該模式統(tǒng)計(jì)。

圖3 脅迫處理下根尖向水彎曲角度

2.2 山梨醇處理Col-0、cat2、apx1的研究

植物在受到脅迫時(shí),體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的H2O2,因此,用濃度為0.4 mol/L 山梨醇的滲透脅迫培養(yǎng)基按照?qǐng)D1的模式配置脅迫培養(yǎng)板。將Col-0、cat2和apx1按照?qǐng)D1模式移苗,其表型如圖4所示。

圖4 山梨醇處理Col-0、cat2和apx1后根尖的表型

由圖4可知，經(jīng)過24 h后,發(fā)現(xiàn)cat2突變體和apx1突變體的根尖都保持了向水性的彎曲,但是Col-0根尖已經(jīng)生長進(jìn)入了山梨醇培養(yǎng)基,并沒有保持向水性。結(jié)果顯示,與Col-0相比,cat2和apx1明顯能保持向水性現(xiàn)象更加持久。本文統(tǒng)計(jì)了24 h后Col-0、cat2和apx1株系根尖彎曲角度,如圖5所示。

由圖5可知,野生型根尖已經(jīng)朝著重力方向生長,而cat2和apx1的根尖仍然保持向水性的彎曲生長。

圖5 山梨醇處理Col-0、cat2和apx1后根尖向水彎曲角度

2.3 根尖生長素信號(hào)的檢測(cè)

研究發(fā)現(xiàn),生長素能夠調(diào)控根部的向地性[9]。為了進(jìn)一步探究H2O2在擬南芥根部對(duì)向水性的調(diào)節(jié)作用,本文使用生長素合成誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因DR5::N7-VENUS來檢測(cè)根部生長素信號(hào)的強(qiáng)弱,利用激光共聚焦顯微鏡觀察DR5::N7-VENUS和cat2DR5::N7-VENUS的根尖生長素?zé)晒庑盘?hào)，如圖6所示。

圖6 cat2、Col-0根尖生長素?zé)晒庑盘?hào)

經(jīng)過計(jì)算，統(tǒng)計(jì)2個(gè)株系根尖的熒光強(qiáng)度值如圖7所示。

由圖7可知，與野生型背景的DR5::N7-VENUS相比,cat2DR5::N7-VENUS的根部生長素?zé)晒鈴?qiáng)度要弱得多。

圖7 cat2、Col-0根尖生長素?zé)晒鈴?qiáng)度

3 討 論

研究表明植物的根部在受到滲透脅迫時(shí),根部會(huì)遠(yuǎn)離滲透脅迫區(qū)域,朝著正常水勢(shì)的方向生長,即根部會(huì)自發(fā)地進(jìn)行向水性彎曲。H2O2是一種重要的植物內(nèi)源信號(hào)分子,參與調(diào)控多種非生物脅迫和生物脅迫。然而,H2O2信號(hào)是否調(diào)控植物根部向水性目前還不清楚。過氧化氫酶是代謝植物體內(nèi)H2O2的關(guān)鍵酶[10-11]，因此過氧化氫酶缺失突變體是研究H2O2與向水性的重要遺傳材料。本研究發(fā)現(xiàn),與Col-0相比,cat2和apx1能夠保持向水性更久;結(jié)果表明H2O2可能參與了向水性的過程。之后觀察cat2根尖的生長素信號(hào),發(fā)現(xiàn)cat2的根尖生長素信號(hào)明顯比Col-0的根尖生長素信號(hào)低。

以上結(jié)果表明,H2O2可能是連接滲透脅迫引起向水性現(xiàn)象的中間信號(hào)分子,并且根部的彎曲生長可能與生長素的調(diào)控有關(guān)[12]。向水性現(xiàn)象的出現(xiàn)是因?yàn)槊{迫環(huán)境下根尖的向地性被減弱了,而H2O2是重力信號(hào)的傳遞分子,所以 H2O2信號(hào)分子是通過影響根部向地性去發(fā)生向水性現(xiàn)象還是通過其他途徑有待進(jìn)一步研究。