陳學軍，崔雅嵐，王 陳，石 童，張瑞華，徐建富，李麗琴

（國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205）

三鄰甲苯磷酸酯（tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）具有化學和熱穩(wěn)定性，可用作增塑劑、阻燃劑、軟化劑使用，在工業(yè)上和日常生活中被廣泛應用。TOCP作為有機磷酸酯類化合物的代表，具有嚴重的神經毒性，包括抑制膽堿酯酶產生急性神經毒性，一次或多次接觸后的神經退行性綜合征及遲發(fā)性神經毒性[1]。TOCP還是有機磷誘導的遲發(fā)性神經?。╫rganophosphorus ester-induced delayed neuropathy，OPIDN）最常用的造模劑。研究表明，OPIDN大鼠大腦的多個部位氧化應激產物增加，抗氧化酶活性降低[2]。體外研究發(fā)現，TOCP可導致人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y和大鼠星形膠質細胞C6氧化應激產物增加，抗氧化能力減弱[3-4]。目前對TOCP的神經毒性研究大多基于動物實驗或體外單一細胞培養(yǎng)，相對于人體復雜的神經系統(tǒng)，存在跨種屬差異、生理相關度低等問題。因此，開發(fā)人源化、生理相關度高的模型進行TOCP的神經毒性研究，對于評估其人體神經毒性及機制具有重要意義。

類器官是利用干細胞的誘導分化和聚集特性在體外培養(yǎng)的三維“迷你”器官，與對應的器官擁有類似的空間組織構成并能重現器官的部分功能，從而提供一個高度生理相關系統(tǒng)。類器官技術的出現及應用表明，中樞神經系統(tǒng)細胞多樣性的可再生發(fā)育不需要胚胎環(huán)境，體外培養(yǎng)構建的人腦類器官具有與人大腦皮質類似的結構和細胞組成。單細胞測序分析表明，人腦類器官中表達有多種類型的神經元和膠質細胞，細胞發(fā)生順序與體內腦發(fā)育過程類似[5-6]。神經類器官還可表現出相關的生理功能，形成功能性的神經環(huán)路，培養(yǎng)260 d的人腦類器官，可產生與早產兒腦電波信號相似的電信號[7]。Pellegrini等[8]構建的中樞脈絡叢類器官，可分泌腦脊液。此外，相較于實驗動物，人腦類器官由人源干細胞通過誘導分化而來，更能體現人體神經組織微環(huán)境與功能，可有效解決跨種屬毒性效應差異及實驗動物倫理學限制等問題。因此，人腦類器官相較于單獨的神經元或膠質細胞更適用于化合物的神經毒性評估。人腦類器官已用于乙醇、納米材料、新型冠狀病毒等的神經毒性研究[9-13]。本研究擬應用人腦類器官進行TOCP的神經毒性評估，為闡明其人體神經毒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 人腦類器官、試劑和主要儀器

人腦類器官（培養(yǎng)60 d左右）和人腦類器官維持培養(yǎng)基，浙江霍德生物工程有限公司。慢病毒包被的GCaMP6載體，武漢樞密腦科學技術有限公司；TOCP（純度99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CellTiter-Glo?3D Reagent（CTG試劑），美國Promega公司；二甲基亞砜（純度99%），美國Sigma-Aldrich公司。4%多聚甲醛，索萊寶生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；人丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒，上海信裕生物科技有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

6孔超低黏附細胞培養(yǎng)板和96孔超低黏附細胞培養(yǎng)板，美國Corning公司；細胞培養(yǎng)箱（3111），美國Thermo公司；倒置熒光顯微鏡（Ti2-U），日本Nikon公司；多功能酶標儀（Spark），瑞士Tecan公司；超聲細胞破碎儀（VCX760），美國Sonics公司；臺式高速冷凍離心機（5424R），德國Eppendorf公司。

1.2 人腦類器官培養(yǎng)和分組處理

人腦類器官培養(yǎng)于96孔超低黏附細胞培養(yǎng)板中，每孔1個，置于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱內的搖床上培養(yǎng)，轉速70 r·min-1，每日換液。經1 d適應性培養(yǎng)后，分組給藥，每組3個重復樣本，分別為正常對照組、TOCP 1，5和10 mmol·L-1（終濃度）染毒組，染毒時間24 h。

1.3 CTG法檢測人腦類器官細胞活力

取1.2分組處理的人腦類器官，吸去培養(yǎng)基，加入PBS清洗3次，加入100 μL培養(yǎng)基，室溫平衡30 min，然后加入100 μL的CTG試劑，渦旋振蕩使細胞完全裂解，室溫繼續(xù)孵育30 min。應用酶標儀進行化學發(fā)光檢測，通過對ATP的定量來測定人腦類器官的細胞存活率，設定積分時間為每孔1 s，讀取各孔發(fā)光值，計算各組細胞存活率。細胞存活率（%）=TOCP組發(fā)光值/正常對照組發(fā)光值×100%。

1.4 TUNEL法檢測人腦類器官細胞凋亡

人腦類器官分為正常對照組和TOCP 5 mmol·L-1組，每組3個，正常對照組加入含0.1% DMSO置于細胞培養(yǎng)箱內搖床孵育24 h，收集人腦類器官，4%多聚甲醛固定，經抗凍保護、包埋、速凍、冷凍切片、TUNEL染色，進行熒光成像，觀察人腦類器官細胞凋亡，以NIS-Elements AR軟件分析各組TUNEL和DAPI熒光強度，兩者比值表示細胞凋亡率。

1.5 倒置熒光顯微鏡檢測人腦類器官鈣震蕩

rLV-EF1a-GCaMP6s-WPRE以培養(yǎng)液稀釋至0.1 kU·L-1，與人腦類器官在培養(yǎng)箱中共孵育，8 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。將轉染了GCaMP6的人腦類器官轉移至6孔超低黏附細胞培養(yǎng)板中，調節(jié)熒光倒置顯微鏡至4×物鏡、FITC模式，觀察人腦類器官鈣成像效果。應用NIS-Elements AR軟件，設置ND Acquisition模式記錄熒光-時間變化，時長1 min，間隔無延遲，并通過時間測量功能分析1 min內鈣熒光強度變化，選取鈣震蕩節(jié)律為3～9s的人腦類器官模型進行TOCP染毒分析。TOCP染毒時，設置記錄時長為3 min，記錄正常鈣信號約40 s，加入TOCP（終濃度5 mmol·L-1）或者0.1% DMSO溶液，測試完成后，通過時間測量功能導出各時間點熒光值（Ft），設起始熒光值F0為1，計算各時間點相對熒光值（Ft/F0）并作圖，根據相對熒光值變化曲線判斷細胞內鈣濃度變化。

1.6 比色法檢測人腦類器官H2O2，MDA，NO，T-AOC和GSH含量以及SOD和GSH-PX活性

取1.2分組處理的人腦類器官，以預冷PBS輕輕沖洗3次，每孔加入200 μL PBS重懸，用寬口移液吸頭轉移至無菌離心管內，冰浴下超聲破碎20 s，使細胞完全裂解。4℃下13 000×g離心15 min，取上清液，參照試劑盒說明書檢測氧化應激產物H2O2，MDA和NO含量，T-AOC，GSH含量，以及抗氧化酶SOD和GSH-PX活性，各指標含量均以各自樣本的總蛋白含量進行校正。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗結果數據用±s表示，采用SPSS19.0軟件進行數據分析，多組間比較采用單因素方差分析析（One-way ANOVA）結合 Dunnettt檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TOCP對人腦類器官細胞存活率的影響

圖1結果顯示，與正常對照組相比，TOCP 1 mmol·L-1組人腦類器官細胞存活率無顯著差異，5和10 mmol·L-1組分別為正常對照組的（83±6）%和（79±10）%，均顯著下降（P＜0.05），表明TOCP 5和10 mmol·L-1對人腦類器官具有毒性作用。

Fig.1 Effect of tri-ortho-cresyl phosphate（TOCP）on cell viability of human brain organoids.Brain organoids were treated with TOCP for 24 h and cell viability was determined with CellTiter-Glo? 3D Reagent.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control(0 mmol·L-1)group.

2.2 TOCP對人腦類器官細胞凋亡的影響

TUNEL染色顯示（圖2），正常對照組人腦類器官內部細胞凋亡較少，TOCP 5 mmol·L-1組人腦類器官內部出現大量細胞凋亡（綠色熒光），熒光強度顯著高于正常對照組（P＜0.01）表明TOCP可誘導人腦類器官細胞凋亡，具有顯著的神經毒性。

Fig.2 Effect of TOCP on cell apoptosis of human brain organoids by TUNEL staining.See Fig.1 for the treatment.Green fluorescence indicates apoptotic cells.B was the quantitative result of A.Apoptosis rate（%）=TUNEL intensity/DAPI intensity×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 TOCP對人腦類器官細胞鈣震蕩的影響

倒置熒光顯微鏡下可見，正常對照組人腦類器官鈣震蕩出現擾動，但很快恢復，且熒光強度和節(jié)律未受明顯影響（圖3A）；TOCP 5 mmol·L-1組人腦類器官鈣震蕩信號紊亂（圖3B），表現為鈣震蕩幅度和熒光強度的持續(xù)增強，表明TOCP可使細胞內鈣離子濃度升高，導致鈣穩(wěn)態(tài)失衡。

Fig.3 Effect of TOCP on calcium oscillations of human brain organoids.See Fig.1 for the treatment.Ft：real time fluorescence intensity；F0：initial fluorescence intensity.

2.4 TOCP對人腦類器官H2O2，MDA，NO，T-AOC，GSH含量及SOD和GSH-PX活性的影響

如表1所示，與正常對照組比較，TOCP各組人腦類器官H2O2水平均顯著增加（P＜0.01），其含量分別為正常對照組的1.30，2.55和2.37倍；其中TOCP 10 mmol·L-1組 MDA 含量升高（P＜0.01）。提示TOCP可引起脂質過氧化產物增加（P＜0.01）。各組NO水平與正常對照組比較無明顯變化。與正常對照比較，TOCP 5和10 mmol·L-1組T-AOC顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TOCP 1，5和10 mmol·L-1顯著GSH含量（P＜0.05，P＜0.01）。與正常對照比較，TOCP 5和10 mmol·L-1組人腦類器官SOD活性顯著降低（P＜0.01）；TOCP 1，5和 10 mmol·L-1組GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示TOCP可破壞人腦類器官的抗氧化能力，導致氧化應激損傷。

Tab.1 Effect of TOCP on levels of hydrogen peroxide（H2O2）,malondialdehyde（MDA）,nitric oxide（NO）,total antioxidant capacity（T-AOC）,glutathione（GSH），and activity of superoxide dismutase（SOD）,glutathione peroxidase（GSH-Px）in human brain organoids

3 討論

本研究結果表明，TOCP可誘導人腦類器官細胞凋亡，降低細胞存活率，具有顯著的神經毒性。TOCP的神經毒性機制可能與其誘導人腦類器官的鈣震蕩節(jié)律紊亂相關。本研究結果表明，TOCP可引起人腦類器官鈣離子震蕩幅度增大、強度持續(xù)增強，表明細胞內的鈣離子濃度提升，鈣穩(wěn)態(tài)失衡。鈣穩(wěn)態(tài)失衡參與有機磷類化合物誘導的神經組織損傷[14]。Fernandes等[15-16]研究報道，神經元L型鈣離子通道和T型鈣離子通道參與了丙胺氟磷誘導的OPIDN過程。Ding等[16]報道，TRPV1通道阻斷劑HC030031能夠改善馬拉硫磷或TOCP導致的神經損傷和共濟失調等OPIDN表現。敵敵畏長期暴露可導致大鼠腦突觸內鈣離子濃度升高，主要鈣外排酶（如Ca2+-ATP酶）活性降低，去極化引起電壓依賴的鈣離子通道開放，鈣攝取增加、輔酶活性增強，表明細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡介導了敵敵畏的慢性神經毒性，導致神經功能損傷[17]。

胞漿內鈣離子的持續(xù)高濃度增加，尤其是線粒體中的鈣離子增加會導致自由基和氧化應激產物的增加[18]。有機磷化合物暴露會導致氧化應激反應[19]。如引起腦中內源性抗氧化酶和非酶抗氧化劑活性改變、線粒體功能損傷以及自由基介導的損傷（如脂質過氧化）增加[20-21]。Zhang等[22]報道，母雞單次灌胃給予750 mg·kg-1TOCP使雞大腦、脊髓和坐骨神經等組織MDA含量升高，SOD和GSH-PX等抗氧化酶的活性降低，GSH含量下降。龍鼎新等[4]研究發(fā)現，TOCP孵育的SH-SY5Y細胞，MDA水平增加且H2O2酶含量降低，提示TOCP導致神經細胞抗氧化能力減弱，脂質氧化物水平增加。劉曉暉等[3]報道，TOCP處理的大鼠C6星形膠質細胞，LDH釋放增加，細胞存活率減弱，抗氧化物GSH含量降低，GSH-PX活性下降，表明TOCP引起星形膠質細胞的氧化應激損傷。因此，TOCP的神經毒性效應是神經元和膠質細胞等共同作用的結果。本研究結果表明，TOCP處理的人腦類器官，抗氧化物質GSH含量降低，抗氧化酶SOD和GSH-PX活性減弱，T-AOC下降，氧化應激產物MDA和H2O2增加。本研究結果表明，TOCP誘導人腦類器官的氧化應激反應，而氧化應激是細胞凋亡的保守信號。因此，鈣穩(wěn)態(tài)失衡可能通過氧化應激反應介導了細胞的凋亡。

綜上所述，本研究結果表明，TOCP對人腦類器官具有顯著毒性，其機制可能是通過破壞人腦類器官的鈣穩(wěn)態(tài)失衡，增加細胞內鈣離子濃度，引起氧化應激紊亂，從而介導了細胞凋亡等發(fā)生。但人腦類器官中的神經元和膠質細胞等各類型細胞在TOCP所誘導損傷中的程度、作用及機制等還有待深入研究。