孫明利，漆 璐，羅向東，劉慧娟，王 瑜，張 薇，王興河

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，藥物Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究室，北京 100038；2.廣東賽康藥業(yè)有限公司研發(fā)部，廣東 廣州 510070）

二甲雙胍是一種雙胍類(lèi)降糖藥，主要用于＞10歲的2型糖尿病患者的血糖控制[1-2]，是糖尿病治療指南推薦的一線治療藥物[3-4]。二甲雙胍普通片有血藥濃度波動(dòng)大、服藥次數(shù)多和用藥依從性差等缺點(diǎn)，緩釋片則可克服以上缺點(diǎn)[5]。2型糖尿病發(fā)病率高[6-8]，二甲雙胍緩釋片市場(chǎng)需求大，目前我國(guó)上市的鹽酸二甲雙胍緩釋片仿制藥有22種，由不同廠商研制。元唐（每片500 mg）是廣東賽康制藥公司為滿足市場(chǎng)需求研發(fā)的仿制新藥。本研究旨在比較元唐與英國(guó)Merck Serono Limited生產(chǎn)的原研藥格華止緩釋片在健康受試者中空腹單次口服給藥條件下的生物等效性和安全性。

1 受試者、材料與方法

1.1 受試者

本研究由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥物Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究室完成，獲得北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)2017Y123）。受試者均自愿簽署知情同意書(shū)。

入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞18歲的中國(guó)健康受試者，男性體重＞50 kg，女性體重＞45 kg，身體質(zhì)量指數(shù)在19.0～28.0 kg·m-2。排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重疾病史、有煙酒嗜好和藥物濫用史、有二甲雙胍及其輔料成分過(guò)敏史，生命體征、心電圖、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果異常有臨床意義，傳染性疾病血清學(xué)檢查結(jié)果陽(yáng)性。

按照入選和排除標(biāo)準(zhǔn)，入組36例健康受試者，男性23例（63.9%，23/36），年齡（29.0±9.2）歲，漢族31例（86.1%，31/36），體重（65.3±9.3）kg，身高（166.3±7.9）cm，身體質(zhì)量指數(shù)（23.6±2.4）kg·m-2。

試驗(yàn)中有1例受試者因個(gè)人原因在服用試驗(yàn)藥物前退出試驗(yàn)，不納入安全分析集和藥動(dòng)學(xué)分析集；1例受試者在第一周期服用參比制劑后因發(fā)生不良事件退出試驗(yàn)，納入安全分析集，而不納入藥動(dòng)學(xué)分析集。故安全性分析集共35例受試者，藥動(dòng)學(xué)分析集34例。

1.2 藥物和儀器

受試制劑為廣東賽康制藥廠有限公司生產(chǎn)的元唐，為仿制鹽酸二甲雙胍緩釋片，規(guī)格每片500 mg，批號(hào)1171115010，二甲雙胍純度96.5%；參比制劑為英國(guó)Merck Serono Limited生產(chǎn)的鹽酸二甲雙胍緩釋片（格華止緩釋片Glucophage XR），規(guī)格每片500 mg，批號(hào)Y02494，二甲雙胍純度98.9%。

高效液相色譜儀，包括液相泵（LC-20ADXR）、柱溫箱（CTO-20AC）、控制器（CBM-20Alite）、脫氣機(jī)（DGU-20A5R）和自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-30AC），日本島津公司；質(zhì)譜檢測(cè)器（API 4000）和電噴霧離子化離子源，美國(guó)Applied Biosystems/Sciex公司；色譜柱Poroshell 120 EC-CN（2.1 mm×50 mm，2.7 μm），美國(guó)Agilent公司；預(yù)柱Security Guard Cartridges C18（4.0 mm×2.0 mm），美國(guó)Phenomenex公司；離心機(jī)（Heraeus Muitifuge X1R），美國(guó)ThermoFisher公司；天平（CPA225D和MSA6.6S-OCE-DM），德國(guó)Sartorius公司；振蕩器（QB-9001），美國(guó)QILINBEIER公司；振蕩器（LPD 2500），萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；振蕩器（MIX-1500），杭州米歐儀器有限公司（MIULAB公司）；純水儀（Milli-Q），美國(guó)Merck公司；數(shù)據(jù)采集軟件（Analyst 1.6.2和Analyst 1.6.3），美國(guó)Applied Biosystems/Sciex公司；數(shù)據(jù)處理軟件（Microsoft Office 2007和2013），美國(guó)微軟公司。

1.3 給藥和血漿樣品采集

試驗(yàn)為單中心、開(kāi)放、隨機(jī)、單劑量、兩周期、兩序列、雙交叉設(shè)計(jì)，在空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行生物等效性試驗(yàn)。36例入選受試者隨機(jī)分成2組，每組分別給藥前隔夜空腹至少10 h，給藥日早晨空腹?fàn)顟B(tài)下，用240 mL溫水分別送服500 mg受試制劑或參比制劑，7 d清洗期后，進(jìn)行第2周期交叉給藥。每周期給藥0 h（給藥前30 min內(nèi)）和給藥后第1，2，3，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，9，10，12，15，24 和36 h靜脈采血4 mL至含K2-EDTA抗凝劑的真空采血管中，離心后血漿樣品分為待測(cè)樣品和備份樣品。分裝結(jié)束后1.0 h內(nèi)將血漿樣品置于-20℃冰箱中暫存，72 h內(nèi)移至-70℃冰箱中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

1.4 血藥濃度測(cè)定和血漿樣品處理

二甲雙胍血藥濃度由南京科利泰醫(yī)藥科技有限公司采用已建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)[9-10]。色譜條件：色譜柱Poroshell 120 EC-CN（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：A 為含 0.1% 甲酸的5.0 mmol·L-1醋酸銨的水溶液，B為乙腈；流速：0.4 mL·min-1；梯度洗脫程序（0.0～1.9 min，10%A；1.9～2.0 min，10%A→50%A；2.0～3.0 min，50%A；3.0～3.1 min，50%A→10%A；3.1～5.0 min，10%A）；進(jìn)樣體積6.0 μL；柱溫40℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度8℃；運(yùn)行時(shí)間：5.00 min。

質(zhì)譜條件：離子噴霧電壓1700 V；氣簾氣310 kPa；霧化氣 379 kPa；輔助氣 379 kPa；源溫650℃；碰撞氣10 Unit，碰撞激發(fā)裂解；電噴霧離子化，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；二甲雙胍和內(nèi)標(biāo)二甲雙胍-d6碰撞電壓分別為29和20 V，定量離子對(duì)（m/z）分別為 130.1/71.1和136.1/60.1。

血漿樣品處理：向96孔板中加入待測(cè)樣品50.0 μL和內(nèi)標(biāo)工作溶液30.0 μL（終濃度80.0 μg·L-1），充分振搖3 min后加入乙腈450 μL，再劇烈振搖10 min后，25℃，4000×g離心10 min，取上清液30.0 μL至干凈96孔板中，用90%乙腈水溶液570 μL稀釋?zhuān)瑢?6孔板密封，充分振搖10 min后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.5 藥物安全性評(píng)價(jià)

藥物安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)包括不良事件、嚴(yán)重不良事件、伴隨用藥、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查、生命體征測(cè)定、心電圖和體格檢查等結(jié)果異常且有臨床意義。通過(guò)比較2種藥物的安全性指標(biāo)是否有差異，判斷受試制劑的安全性。

1.6 藥動(dòng)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

由北京大學(xué)臨床研究所進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。設(shè)定最大血藥濃度（Cmax）、藥時(shí)曲線下面積（AUC0→t和AUC0→∞）為主要檢測(cè)參數(shù)，采用Phoenix WinNonlin 7.0（Certara，US）軟件中非房室模型計(jì)算各受試者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線，將主要指標(biāo)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析；其他統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SAS 9.4軟件（SAS INSTITUTE INC，US）進(jìn)行。計(jì)量資料：非正態(tài)分布的數(shù)值用中位數(shù)（最小值，最大值）表示，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；正態(tài)分布的數(shù)值用±s表示，差異分析采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料：以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)（n，%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，如期望值＜5，則采用Fisher精確檢驗(yàn)。藥動(dòng)學(xué)主要參數(shù)指標(biāo)的幾何均值受試制劑/參比制劑90%置信區(qū)間在等效區(qū)間（80.0%～125.0%）之內(nèi)，則判定2種制劑生物等效。

2 結(jié)果

2.1 藥物分析方法驗(yàn)證

專(zhuān)屬性：二甲雙胍和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間的變異系數(shù)（CV）均≤2.1%，二者峰面積比的CV≤7.8%。6個(gè)不同個(gè)體來(lái)源的血漿基質(zhì)對(duì)二甲雙胍或內(nèi)標(biāo)的測(cè)定不存在干擾，且二甲雙胍和內(nèi)標(biāo)之間也不存在相互干擾（圖1）。

Fig.1 Representative chromatograms of metformin in human plasma.A：blank plasma；B：blank plasma spiked with a lower limit of quantitation of metformin（3.00 μg·L-1）；C：blank plasma spiked with the intern standard metformin-d6（80.00 μg·L-1）；D：a real sample at 7.5 h after oral administration of the test preparation Yuantang.Ion-pairs（m/z）used to test metformin and metformin-d6 were 130.1/71.1 and 136.1/60.1，respectively.

標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限：以待測(cè)物（二甲雙胍）與內(nèi)標(biāo)（二甲雙胍-d6）的色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），以血漿中待測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），用加權(quán)（1/x2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，二甲雙胍回歸方程為y=0.0171x-0.0016（r=0.9991）。結(jié)果表明，二甲雙胍血藥濃度在3.00～1200.00 μg·L-1線性關(guān)系好，定量下限為3.00 μg·L-1。

準(zhǔn)確度、精密度和回收率：制備4個(gè)濃度的二甲雙胍質(zhì)控樣品（3.00，8.00，300.00和900.00 μg·L-1），每濃度6個(gè)平行樣品，評(píng)估批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度；通過(guò)3批質(zhì)控樣品（每批包括以上4個(gè)濃度，每濃度6個(gè)平行樣品）評(píng)估批間準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明，質(zhì)控樣品批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度（RE）和精密度（RSD）均＜15%。通過(guò)比較單個(gè)質(zhì)控樣品中待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值與空白血漿提取后加入待測(cè)物、內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值，評(píng)價(jià)回收率。各濃度樣品回收率的（CV）均＜15.0%（表1）。

Tab.1 Precision and recovery of metformin in plasma

基質(zhì)效應(yīng)：6個(gè)不同來(lái)源的空白基質(zhì)加入待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)，二甲雙胍8.00，300.00和900.00 μg·L-1濃度組內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子分別為74.7±3.2，74.5±2.0和78.8±1.4，CV分別為4.3%，2.7%和1.8%，均＜15%，表明基質(zhì)效應(yīng)不影響血漿中二甲雙胍的準(zhǔn)確定量，符合生物樣品分析要求。

穩(wěn)定性：通過(guò)比較儲(chǔ)備液和質(zhì)控樣品經(jīng)過(guò)放置或低溫多次凍融后與新鮮配制的對(duì)照樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值來(lái)考察樣品的穩(wěn)定性（n=6）。與對(duì)照樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值相比，待測(cè)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)＜±10.0%，且每份待測(cè)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的CV≤10.0%，視為穩(wěn)定性良好。結(jié)果表明，二甲雙胍儲(chǔ)備液和待測(cè)溶液的短期（室溫，17.0 h）和長(zhǎng)期（-20℃，34.96 d）穩(wěn)定性、質(zhì)控樣品-20℃和-70℃經(jīng)過(guò)5個(gè)凍融循環(huán)的凍融穩(wěn)定性良好，標(biāo)準(zhǔn)偏差和CV均＜10.0%。

2.2 中國(guó)健康受試者空腹單次口服2種鹽酸二甲雙胍緩釋片藥動(dòng)學(xué)特征

由圖2和表2可見(jiàn)，受試制劑和參比制劑的血藥濃度-時(shí)間曲線重合度好，提示二者的藥動(dòng)學(xué)特征相似度高。受試者空腹單次口服受試制劑和參比制劑后，血漿中二甲雙胍濃度逐漸升高，兩者的血藥濃度達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、Cmax、AUC0→t、AUC0→∞、消除半衰期t1/2和末段消除速率常數(shù)λz均無(wú)顯著差異。

Fig.2 Mean plasma concentration-time curves of test preparation Yuantang and reference preparation Glucophage XR after single oral dose of 500 mg in 34 Chinese healthy subjects under the fasting state.A randomized，open，two-period，two cross-over trial was conducted in healthy subjects under the conditions of fasting and single oral administration（500 mg）.After the first oral administration and the 7 d washout period，the second period of cross administration was conducted.±s，n=34.

Tab.2 Comparison of arithmetic mean values of two kinds of metformin hydrochloride sustained-release tablets after single oral administration under fasting conditions in Chinese healthy volunteers

由表3可見(jiàn)，在中國(guó)健康受試者空腹條件下單次口服受試制劑（500 mg）或參比制劑（500 mg）后，Cmax，AUC0→t和 AUC0→∞幾何均值分別為 0.79和0.76 mg·L-1，5.1和5.0 h·mg·L-1，5.2和5.0 h·mg·L-1；二者比值的90%置信區(qū)間分別為96.3%～113.7%，96.2%～110.8%和96.3%～110.4%，均在80.0%～125.0%的生物等效性區(qū)間內(nèi)，表明本研究的受試制劑和參比制劑在空腹給藥條件下具有生物等效性。

Tab.3 Geometric mean values of pharmacokinetic parameters and bioequivalence evaluation of two types of metformin hydrochloride sustained release tablets after single oral administration under fasting conditions in Chinese healthy volunteers

用Phoenix WinNonlin 7.0分別對(duì)受試制劑和參比制劑的給藥序列、給藥周期和不同制劑對(duì)Cmax，AUC0→t和AUC0→∞（取自然對(duì)數(shù)）的影響進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，上述 3 因素對(duì) lnCmax，lnAUC0→t和lnAUC0→∞無(wú)顯著影響（表4）。

Tab.4 Results of ANOVA test on bioequivalence of two types of metformin hydrochloride sustained release tablets after single oral administration under fasting conditions in Chinese healthy volunteers

2.3 安全性分析

試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)非預(yù)期不良事件和嚴(yán)重不良事件發(fā)生。在各自服用周期內(nèi)，受試制劑有8例受試者（22.9%，8/35）發(fā)生10例次不良反應(yīng)，參比制劑有10例（28.6%，10/35）發(fā)生15例次不良反應(yīng)，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.30，P=0.58）；服用受試制劑的受試者中發(fā)生6例次消化道反應(yīng)、4例次實(shí)驗(yàn)室檢查異常有臨床意義，服用參比制劑的受試者中發(fā)生5例次消化道反應(yīng)、9例次實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果異常有臨床意義、1例次上呼吸道感染，不良反應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fisher檢驗(yàn)，P=0.51）（表5）。1例受試者在服用參比制劑后發(fā)生1次Ⅱ級(jí)中度不良反應(yīng)（上呼吸道感染），其余不良反應(yīng)均為Ⅰ級(jí)輕度（表5），2種制劑不良反應(yīng)嚴(yán)重程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fisher檢驗(yàn)，P＞0.99）。1例次不良反應(yīng)轉(zhuǎn)歸為“未知”（受試者失訪），其余均為“痊愈”，2種制劑發(fā)生不良反應(yīng)轉(zhuǎn)歸無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fisher檢驗(yàn)，P＞0.99）。

Tab.5 Comparison of adverse reactions of two kinds of metformin hydrochloride sustained release tablets in Chinese healthy volunteers after single oral administration under fasting conditions

3 討論

Zhou等[12]研究2種鹽酸二甲雙胍緩釋片在健康受試者餐后單次給藥條件下生物等效。本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]測(cè)定健康受試者空腹單次口服給藥條件下二甲雙胍血漿藥物濃度，采用Cmax，AUC0→t和 AUC0→∞作為藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)，評(píng)價(jià)2種制劑的生物等效性。結(jié)果表明，2種制劑在健康受試者空腹單次口服給藥條件下生物等效，進(jìn)一步豐富了國(guó)產(chǎn)仿制藥的生物等效資料，為國(guó)內(nèi)2型糖尿病治療提供更多的選擇和參考。

二甲雙胍在臨床上已有60多年的用藥史，良好的安全性已成共識(shí)[13-14]。本研究結(jié)果亦表明，受試制劑和參比制劑不良反應(yīng)輕，主要為消化道反應(yīng)和實(shí)驗(yàn)室檢查異常，且均可自愈。2種制劑在試驗(yàn)期間均無(wú)非預(yù)期不良事件和嚴(yán)重不良事件發(fā)生，不良反應(yīng)發(fā)生率、類(lèi)型、嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)歸無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且安全性均好，與本課題組前期報(bào)道結(jié)果一致[15]。

綜上，本研究中受試制劑元唐和參比制劑格華止在健康受試者空腹單次口服給藥條件下生物等效，安全性良好。