張亞昆，高 俊，韓秋影，潘 欣，李愛玲，李 騰

（國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850）

9號(hào)染色體開放閱讀框72基因（open reading frame 72 gene on chromosome 9，C9orf72）內(nèi)六核苷酸GGGGCC的異常重復(fù)是肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和額顳葉癡呆（frontotemporal dementia，F(xiàn)TD）最常見的遺傳病因[1-2]，該突變?cè)诩易逍訟LS和FTD病例中分別占16%和20%，在ALS散發(fā)病例中亦有6%～8%[3]。在突變體中，六核苷酸序列GGGGCC異常重復(fù)25～1000次，而在正常個(gè)體中該序列僅重復(fù)2～23次[3]，這種突變?cè)贏LS和FTD病因中的作用目前尚不清楚。有學(xué)者提出了一些機(jī)制解釋該突變的致病性，其一是六核苷酸重復(fù)序列非常規(guī)翻譯產(chǎn)物二肽重復(fù)蛋白（dipeptide repeat protein，DRP）自正義轉(zhuǎn)錄本的聚-甘氨酸-丙氨酸（poly-GA）、聚-甘氨酸-脯氨酸（poly-GP）和聚-甘氨酸-精氨酸（poly-GR），以及來自反義轉(zhuǎn)錄本的聚-脯氨酸-丙氨酸（poly-PA）、聚-脯氨酸-精氨酸（poly-PR）和poly-GP，共5種DRP，這些DRP具有毒性并在ALS和FTD患者的大腦中形成聚集體，被認(rèn)為是神經(jīng)元損傷的重要因素[4-7]。雖然形成5種DRP形成，但富含精氨酸的poly-GR和-PR在果蠅的神經(jīng)發(fā)育模型及體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中劇毒[8-9]，而類似表達(dá)水平的poly-PA，poly-GA和poly-PG則無明顯毒性[10]。

線粒體作為細(xì)胞能量供給和物質(zhì)代謝的重要場所，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，如ATP合成、細(xì)胞凋亡和自由基生成等。人的大腦是高耗能器官，其重量約占人體重的2%，卻消耗線粒體產(chǎn)生能量的20%[11]。神經(jīng)元具有多種復(fù)雜的胞體延伸結(jié)構(gòu)，如樹突和軸突，需要線粒體輸運(yùn)到合適的部位。此外，線粒體參與的鈣離子穩(wěn)態(tài)是突觸傳導(dǎo)等神經(jīng)元活動(dòng)順利進(jìn)行的基礎(chǔ)[12-13]。隨著研究的深入，越來越多的研究表明，線粒體功能障礙在ALS和FTD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。但這是由于ALS和FTD相關(guān)蛋白在線粒體功能、轉(zhuǎn)運(yùn)或動(dòng)力學(xué)中的直接作用，還是由于神經(jīng)元變性、炎癥或壓力反應(yīng)所致尚不清楚[14]。

為此，本研究以HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探索富含精氨酸的劇毒poly-PR和poly-GR以及相對(duì)可耐受的與ALS和FTD發(fā)病無關(guān)的poly-GA對(duì)線粒體形態(tài)、數(shù)量、膜電位、氧化應(yīng)激和ATP水平的影響，以期為闡明ALS和FTD的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體p-EGFP-C1和慢病毒載體pCDH-MCS-T2A-puromycin-MSCV及pEGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50由本實(shí)驗(yàn)室保存；重復(fù)4次的人細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅷ線粒體定位序列（4mt）由擎科公司合成；Taq Mix、T4 DNA連接酶、NheⅠ、AgeⅠ、EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DL2000 DNA和DL15000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（北京GenStar公司）；BM無縫克隆試劑盒、硫酸卡那霉素、氨芐青霉素和E.coliDH5α感受態(tài)大腸桿菌（北京博邁德生物公司）；質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒（美國Promega公司）；鈣轉(zhuǎn)染試劑（中科邁晨公司）；增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒（碧云天公司）；DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和胎牛血清（美國Gibco公司）；山羊抗兔綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）多克隆抗體（美國Abcam公司）；四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine，TMRM）和線粒體超氧化物指示劑MitoSOX（美國Thermo Fisher Scientific公司）；上、下游引物合成及測序由擎科公司完成。5424R和5810R離心機(jī)（美國Eppendorf公司）；細(xì)菌超凈臺(tái)和細(xì)胞超凈臺(tái)（蘇州Airtech公司）；核酸凝膠成像系統(tǒng)、細(xì)菌培養(yǎng)箱、PCR儀器和二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；DeltaVision Ultra高分辨率活細(xì)胞顯微成像系統(tǒng)（美國Cytiva公司）。

1.2 線粒體定位序列4mt的鑒定和回收

線粒體定位序列4mt由擎科公司合成在載體pEGFP-N1上，上游酶切位點(diǎn)是NheⅠ，下游酶切位點(diǎn)是PstⅠ，PstⅠ之后是AgeⅠ酶切位點(diǎn)?？寺?gòu)建用酶切位點(diǎn)是NheⅠ和AgeⅠ。該線粒體定位序列屬于前導(dǎo)肽，在引導(dǎo)蛋白穿膜后會(huì)被剪切掉。將合成的4mt-EGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ和AgeⅠ雙酶切，將雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定4mt相對(duì)分子質(zhì)量是否正確，隨后切下目的條帶，進(jìn)行膠回收。

1.3 重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50的構(gòu)建

對(duì)空載體pEGFP-C1及pEGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50進(jìn)行雙酶切，酶切位點(diǎn)為NheⅠ和AgeⅠ，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶進(jìn)行膠回收。用T4 DNA連接酶將膠回收的線性化載體與1.2回收的線粒體定位序列4mt在16℃條件下連接過夜。第2天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coliDH5α，涂布于卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)16 h，形成肉眼可見的單個(gè)菌落，而后進(jìn)行菌落PCR鑒定，引物序列見表1。挑選陽性菌落送測序公司測序。測序正確的菌落接種于卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)14 h，收集菌體，提取質(zhì)粒并將質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，鑒定重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50構(gòu)建成功。

Tab.1 Primers of 4mt-pEGFP-C1 used for colony PCR

1.4 Western印跡法檢測4mt-EGFP-PR50，-GR50和-GA50重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50及空載體pEGFPC1用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后裂解細(xì)胞收集蛋白質(zhì)，經(jīng)Bradford法蛋白質(zhì)定量后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含5%牛血清白蛋白的TBST溶液25℃孵育封閉1 h。用山羊抗兔GFP抗體（1∶1000）將PVDF膜4℃孵育過夜，而后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶5000）25℃孵育1 h后，加入Western發(fā)光檢測液進(jìn)行檢測。據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量判斷4mt-EGFP-PR50，-GR50和-GA50是否正確表達(dá)。

1.5 用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞

HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在含鏈霉素和青霉素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。后續(xù)傳代時(shí)，胰酶消化后計(jì)數(shù)，以每孔4×104～6×104將HeLa細(xì)胞接種在8孔腔室蓋玻片中（Nunc），置37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（無抗生素）。50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基與0.3 μL Lipofectamine 2000混勻（A液），室溫靜置5 min。將重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50 0.15 μg分別與50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混勻（B液），室溫靜置5 min。將B液緩慢加到A液中輕柔混勻，室溫靜置15 min，逐滴加入HeLa細(xì)胞（8孔腔室蓋玻片中）并混勻。重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1為對(duì)照組，4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50為實(shí)驗(yàn)組。37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，6 h后換含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.6 線粒體染色

HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將含有染料TMRM 100 nmol·L-1和 MitoSOX 2 μmol·L-1的完全培養(yǎng)基分別加入對(duì)應(yīng)的8孔腔室蓋玻片中。37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，用PBS洗3次后加入低背景緩沖溶液，即改良的Krebs-Ringer緩沖液（KRB）（mmol·L-1：NaCl 125，KCl 5，Na3PO41，MgSO41，葡萄糖5.5，HEPES 20，pH 7.4），隨后用DeltaVision Ultra寬場熒光顯微成像。

1.7 DeltaVision Ultra寬場熒光顯微成像

利用488，561和405 nm激發(fā)光對(duì)TMRM和MitoSOX染色的HeLa細(xì)胞進(jìn)行成像采集。每視野以0.5 μm間隔共采集8 μm厚度覆蓋整個(gè)細(xì)胞，將不同層的圖片進(jìn)行Z軸疊加（max intensity）獲得最終圖像，觀察線粒體形態(tài)，計(jì)數(shù)線粒體數(shù)目，并定量分析線粒體功能。

1.8 HeLa細(xì)胞中線粒體形態(tài)和數(shù)目檢測

將成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞，應(yīng)用Volocity 3D圖像分析軟件（Perkin Elmer），圈選不同視野的表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞作為感興趣區(qū)域（region of interest，ROI區(qū)域），所選擇的細(xì)胞空間上與其他細(xì)胞分開，且細(xì)胞內(nèi)線粒體空間不疊加。通過軟件自動(dòng)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞ROI區(qū)域內(nèi)的線粒體數(shù)目，每組計(jì)算3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)共＞150個(gè)細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目，取均值。

1.9 線粒體功能定量分析

首先利用Image J（NIH）軟件自由選擇（freehand selections）功能圈選每組中表達(dá)綠色熒光的HeLa細(xì)胞作為ROI區(qū)域，所選擇的細(xì)胞需要空間上與其他細(xì)胞分開，且形態(tài)正常。而后在每個(gè)視野中選擇與單細(xì)胞大小相似的區(qū)域作為背景區(qū)域。通過軟件自動(dòng)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞ROI區(qū)域內(nèi)的綠色熒光平均熒光強(qiáng)度并減去背景區(qū)域平均熒光強(qiáng)度后，獲得實(shí)際每個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，最后計(jì)算3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中TMRM（共60個(gè)細(xì)胞）和MitoSOX染色（共150個(gè)細(xì)胞）的平均熒光強(qiáng)度，分別反映線粒體膜電位和氧化應(yīng)激水平。

1.10 慢病毒包裝轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)4mt-EGFP及4mt-EGFP-PR50，-GA50和-GR50 HeLa細(xì)胞系構(gòu)建及細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測

設(shè)計(jì)含有pCDH-MCS-T2A-puromycin-MSCV載體同源臂的引物，引物序列forward：GAGCTAGAGCTAGCGAATTCAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGC（5′-3′），reverse：TCCTCTGCCCTCAGCGGCCGCTCTAGATCCGGTGGATCC（5′-3′），用于擴(kuò)增 4mt-EGFP 及 4mt-EGFP-PR50，-GA50和-GR50片段及后續(xù)菌落PCR鑒定，載體克隆構(gòu)建的酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ和NotⅠ。將上述擴(kuò)增的4mt-EGFP及4mt-EGFP-PR50，-GA50和-GR50片段與線性化pCDH-MCS-T2A-puromycin-MSCV載體通過BM無縫克隆試劑盒進(jìn)行重組連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)菌落PCR和DNA測序最終獲得表達(dá)4mt-EGFP及4mt-EGFP-PR50，-GA50和-GR50的重組質(zhì)粒。

將上述重組質(zhì)粒通過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，用病毒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選最終獲得穩(wěn)定表達(dá)4mt-EGFP及4mt-EGFP-PR50，-GR50和-GA50的HeLa細(xì)胞系。

將穩(wěn)定表達(dá)4mt-EGFP及4mt-EGFP-PR50，-GR50和-GA50的HeLa細(xì)胞每組3復(fù)孔，通過增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，使用GraphPad Prism 8.0.2軟件，多組間比較采用單因素方差分析，各組與對(duì)照組比較采用Dunnettt檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體定位序列4mt鑒定

將合成的4mt-EGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ和AgeⅠ雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約500 bp處有一條帶（圖1），與預(yù)期的線粒體定位序列4mt（430 bp）大小符合。

Fig.1 4mt-EGFP-N1 plasmid identified by NheⅠand AgeⅠ enzyme digestion.M：DNA marker；lane 1：4mt-EGFPN1 plasmid enzyme digestion product；lane 2：pEGFP-N1 vector enzyme digestion product；lane 3：4mt-EGFP-N1 plasmid；lane 4：pEGFP-N1 vector.

2.2 重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50鑒定

經(jīng)菌落PCR鑒定（圖2）初步篩選出陽性克隆，隨后將測序正確的重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50進(jìn)行雙酶切鑒定（圖3），可見在約500 bp處有特異性條帶，表明重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50構(gòu)建成功。

Fig.2 Colony PCR identification of recombinant plasmids 4mt-EGFP-C1 and 4mt-EGFP-C1-PR50,-GR50 and-GA50.PR50：50 repeats of proline-arginine；GR50：50 repeats of glycine-alanine；GA50：50 repeats of glycine-arginine.Lanes 1-6 in A：PCR results of the 1-6 clones of 4mt-EGFP-C1-PR50；lanes 9-14 in A：PCR results of the 1-6 clones of 4mt-EGFP-C1-GA50；lanes 1-6 in B：PCR results of the 1-6 clones of 4mt-EGFP-C1-GR50 in B；lanes 9-14 in B：PCR results of the 1-6 clones of 4mt-EGFP-C1；lanes 7 and 15：negative control（using DH5α as template）；lanes 8 and 16：positive control（using 4mt-EGFP-N1 as template）；M：DL2000 DNA marker.

Fig.3 4mt-EGFP-C1,and 4mt-EGFP-C1-PR50,-GR50 and-GA50 recombinant plasmids identified by NheⅠand AgeⅠ enzyme digestion.Lane 1：4mt-EGFP-C1-PR50；lane 2：pEGFP-C1-PR50；lane 3：4mt-EGFP-C1-GA50；lane 4：pEGFP-C1-GA50；lane 5：4mt-EGFP-C1-GR50；lane 6：pEGFP-C1-GR50；lane 7：4mt-EGFP-C1；lane 8：pEGFP-C1；lane 9：4mt-EGFP-N1（positive control）；lane 10：pEGFP-N1；M：DL15000 DNA marker.

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞4mt-EGFP-PR50，-GR50和-GA50蛋白表達(dá)鑒定

用Western印跡法檢測重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50及空載體pEGFP-C1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50蛋白表達(dá)。結(jié)果（圖4）顯示，所有重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中表達(dá)正確。

Fig.4 ldentification of 4mt-EGFP-PR50,-GR50 and-GA50 protein expressions in 293T cells by Western blotting.Lane 1：293T cells；lane 2：pEGFP-C1 expressed 293T cells；lane 3：4mt-EGFP-C1 expressed 293T cells；lane 4：4mt-EGFPC1-PR50 expressed 293T cells；lane 5：4mt-EGFP-C1-GA50 expressed 293T cells；lane 6：4mt-EGFP-C1-GR50 expressed 293T cells.

2.4 PR50，GA50和GR50對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體數(shù)目和形態(tài)的影響

4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48 h后，寬場熒光顯微鏡成像結(jié)果（圖5）顯示，上述DRP定位于線粒體，表明構(gòu)建的線粒體定位序列4mt在HeLa細(xì)胞中功能表達(dá)正常。與4mt-EGFP-C1組相比，4mt-EGFP-PR50和4mt-EGFP-GR50組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變成點(diǎn)狀分布，線粒體數(shù)目顯著增加（P＜0.05）；4mt-EGFP-GA50組線粒體形態(tài)無改變。推測PR50和GR50可破壞線粒體內(nèi)某些蛋白質(zhì)功能，從而導(dǎo)致線粒體分裂（fission）增加。

Fig.5 Effect of PR50,GR50 and GA50 on mitochondrial morphology and number in HeLa cells.48 h after transfection of plasmids 4mt-EGFP-C1，and 4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50 and-GA50，the cells were observed under DeltaVision Ultra wide-field fluorescence microscopy.The cells were transfected with 4mt-EGFP-C1 as the control group.A：images of transfected cells；B：the average number of mitochondria per cell from a total of 150 cells each group.±s，n=150.＊P＜0.05，compared with control group.

2.5 PR50，GR50和GA50對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響

結(jié)果（圖6）顯示，與4mt-EGFP-C1對(duì)照組相比，4mt-EGFP-PR50和4mt-EGFP-GR50組細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；而4mt-EGFP-GA50組線粒體膜電位變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.6 Effect of PR50，GR50 and GA50 on mitochondrial membrane potential in HeLa cells.48 h after transfection of plasmids 4mt-EGFP-C1，and 4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50 and-GA50，the HeLa cells were treated with tetramethylrhodamine methyl ester（TMRM）100 nmol·L-1for 30 min at 37℃.The cells were transfected with 4mt-EGFP-C1 as the control group.A：images of transfected cells performed by deltavision ultra wide-field fluorescence microscopy；B：the average fluorescent relative intensity(FRI)of TMRM staining in a total of 60 cells each group.±s，n=60.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.6 PR50，GA50和GR50對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化應(yīng)激的影響

結(jié)果（圖7）顯示，與4mt-EGFP-C1組相比，4mt-EGFP-PR50和4mt-EGFP-GR50組細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激增強(qiáng)（P＜0.01，P＜0.05），而4mt-EGFPGA50組細(xì)胞氧化應(yīng)激變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.7 Effect of PR50，GR50 and GA50 on mitochondrial oxidative stress in HeLa cells.48 h after transfection of plasmids 4mt-EGFP-C1，and 4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50 and-GA50，the HeLa cells were treated with mitochondrial superoxide red fluorescent probe(MitoSOX)2 μmol·L-1for 30 min at 37℃.The cells were transfected with 4mt-EGFP-C1 as the control group.A：images of transfected cells performed by DeltaVision Ultra wide-field fluorescence microscopy；B：the average FRI of MitoSOX staining in a total of 150 cells each group.±s，n=150.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.7 PR50，GA50和GR50對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響

結(jié)果（圖8）顯示，與4mt-EGFP-C1組相比，4mt-EGFP-PR50和4mt-EGFP-GR50組HeLa細(xì)胞內(nèi) ATP 顯著降低水平（P＜0.01），4mt-EGFPGA50組細(xì)胞內(nèi)ATP水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.8 Effect of PR50，GR50 and GA50 on ATP levels in HeLa cells.HeLa cells were infected with lentivirus and screened with puromycin to obtain the HeLa cell lines stably expressing dipeptide repeat proteins PR50，GR50 and GA50，then the ATP level in the cells was detected by ATP assay kit.The cells expressing 4mt-EGFP-C1 was the control group.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

3 討論

ALS病理特征為上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的大量丟失，患者通常在發(fā)作1～5年內(nèi)死于呼吸衰竭。FTD的特征是額葉顳葉進(jìn)行性缺陷。C9orf72基因中六核苷酸序列的重復(fù)擴(kuò)增是兩者最常見的遺傳病因。人們提出一些機(jī)制解釋了該突變的致病性，一是該突變導(dǎo)致C9rof72蛋白功能不足[15]；二是六核苷酸正義和反義RNA的毒性，它將RNA結(jié)合蛋白質(zhì)和其他因子隔離到不溶性RNA區(qū)域[16]；三是六核苷酸重復(fù)序列非ATG起始的翻譯，產(chǎn)生有毒的DRP[4-5]。

研究報(bào)道，ALS和FTD患者早期即出現(xiàn)大腦內(nèi)新陳代謝率下降和線粒體功能紊亂等病理特征[17]。另據(jù)報(bào)道，神經(jīng)退行性疾病患者的神經(jīng)元中普遍存在線粒體分裂現(xiàn)象，同時(shí)還伴隨異常的線粒體分布[18]。但對(duì)其原因尚不清楚。鑒于線粒體的分裂融合和線粒體功能的密切相關(guān)性，也提示線粒體功能紊亂在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中扮演著重要的角色。線粒體是高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，線粒體的動(dòng)態(tài)變化包括融合和分裂2個(gè)過程。線粒體的形態(tài)與數(shù)量以及定位與功能是維持神經(jīng)元功能與生存的基礎(chǔ)。作為細(xì)胞內(nèi)的代謝核心，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變直接影響細(xì)胞的結(jié)局[19]。異常的線粒體動(dòng)態(tài)變化可能是造成線粒體功能紊亂及退行性神經(jīng)病變的關(guān)鍵誘因之一。目前并不清楚C9rof72基因產(chǎn)物是否參與調(diào)控細(xì)胞能量代謝與線粒體功能。研究表明，細(xì)胞內(nèi)的確有一部分C9orf72蛋白可被轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體膜間隙中[20]。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過降低線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白含量抑制線粒體分裂的發(fā)生，能緩解線粒體功能紊亂以及防止突觸的丟失[21]，提示線粒體形態(tài)異常對(duì)疾病進(jìn)程產(chǎn)生關(guān)鍵性影響，線粒體動(dòng)態(tài)變化可作為潛在的治療靶點(diǎn)。線粒體是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要來源和作用靶點(diǎn)。當(dāng)ROS過量時(shí)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加及膜電位下降，線粒體功能發(fā)生障礙；MPTP的開放進(jìn)一步釋放大量ROS，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞凋亡[22-25]。ROS的變化及其引起的線粒體損傷和細(xì)胞凋亡是神經(jīng)退行性疾病的重要病因之一[26]。為更直接研究C9orf72基因突變的產(chǎn)物DRP與線粒體功能之間的聯(lián)系，本研究構(gòu)建了帶線粒體定位序列的重組質(zhì)粒4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后分析線粒體的形態(tài)和數(shù)量、膜電位及氧化應(yīng)激反應(yīng)；還構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)4mt-EGFP-C1-PR50，-GR50和-GA50的HeLa細(xì)胞系，分析PR50，GR50和GA50對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響。研究結(jié)果表明，富含精氨酸的GR50和PR50蛋白進(jìn)入線粒體后可導(dǎo)致線粒體分裂數(shù)量增加、膜電位下降以及ATP水平下降，同時(shí)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，線粒體的生物學(xué)功能嚴(yán)重受損。而與ALS和FTD發(fā)病無關(guān)的GA50則未造成線粒體損傷。以上結(jié)果表明，C9orf72基因突變產(chǎn)物PR50和GR50可能通過影響線粒體功能促進(jìn)ALS和FTD的發(fā)生發(fā)展。本研究為闡明ALS和FTD發(fā)病機(jī)制提供了重要數(shù)據(jù)。