陸曉華 金桂芳 余河漢 楊紅

中圖分類號(hào) R322.81;R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）22-2748-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.11

摘 要 目的：探討細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（TEN）對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠腦組織線粒體自噬的影響。方法：將50只雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、TEN中劑量+3-甲基腺嘌呤（3-MA）組[TEN 40 mg/（kg·d）+自噬抑制劑3-MA 30 mg/（kg·d）]和TEN低、中、高劑量組[20、40、80 mg/（kg·d）]，每組10只;另將10只同系野生型小鼠作為正常對(duì)照組。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，正常對(duì)照組和模型組小鼠灌胃0.3%羧甲基纖維素鈉溶液，每天給藥1次，給藥體積為0.01 mL/g，連續(xù)給藥3個(gè)月。末次給藥后，檢測神經(jīng)元內(nèi)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的陽性表達(dá)水平[以積分光密度（IOD）計(jì)]，腦組織線粒體中LC3、泛素結(jié)合蛋白p62、Cathepsin D、Rab7、人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導(dǎo)的假定激酶1（PINK1）、E3泛素連接酶（Parkin） mRNA的表達(dá)量和LC3、p62、PINK1、Parkin蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3的IOD值和腦組織線粒體中LC3、p62、PINK1、Parkin mRNA及其蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），Cathepsin D、Rab7 mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，TEN低、中、高劑量組小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3的IOD值（除TEN低、中劑量組外）和腦組織線粒體中LC3、Cathepsin D、Rab7、PINK1（除TEN低劑量組外）、Parkin（除TEN低劑量組外） mRNA的表達(dá)量以及LC3（除TEN中劑量組外）、PINK1（除TEN高劑量組顯著降低外）、Parkin（除TEN低劑量組顯著降低外）蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），p62 mRNA（除TEN低劑量組外）及其蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與TEN中劑量組比較，TEN中劑量+3-MA組小鼠上述指標(biāo)的變化均被顯著抑制（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：TEN可通過激活PINK1/Parkin信號(hào)通路來誘導(dǎo)AD模型小鼠腦組織線粒體自噬，增強(qiáng)溶酶體功能。

關(guān)鍵詞 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷;阿爾茨海默病;PINK1/Parkin信號(hào)通路;線粒體自噬;APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠

Study on the Effects of Tenuifolin on Brain Mitochondrial Autophagy in AD Model Mice Based on PINK1/Parkin Signaling Pathway

LU Xiaohua1，JIN Guifang2，YU Hehan1，YANG Hong1（1. School of Life Sciences and Biopharmaceutics， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 2. School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of tenuifolin （TEN） on brain mitochondrial autophagy in Aizheimers disease （AD） model mice. METHODS： Totally 50 male APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into model group， TEN medium-dose+3-MA group [TEN 40 mg/（kg·d）+autophagy inhibitor 3-MA 30 mg/（kg·d）] and TEN low-dose， medium-dose and high-dose groups [20， 40， 80 mg/（kg·d）]， with 10 mice in each group. In addition， 10 wild-type homologous mice were included in normal control group. Administration groups were intragastrically given corresponding drug solution; normal control group and model group were intragastrically given 0.3% sodium carboxymethyl cellulose solution， once a day， 0.01 mL/g， for consecutive 3 months. After last administration， positive expression [measured by integrated optical density （IOD）] of microtubule associated protein 1 light chain 3 （LC3） in neuron was detected; mRNA expressions of LC3， ubiquitin-binding protein p62， Cathepsin D， Rab7， phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene-induced putative kinase 1 （PINK1） and E3 ligase （Parkin） as well as protein expressions of LC3， p62， PINK1 and Parkin were detected in brain mitochondria. RESULTS： Compared with normal control group， IOD value of LC3 in neuron as well as mRNA and protein expressions of LC3， p62， PINK1 and Parkin in brain mitochondria were all increased significantly in model group （P<0.05 or P<0.01）， while mRNA expressions of Cathepsin D and Rab7 were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， IOD values of LC3 （except for TEN low-dose and medium-dose groups） in neuron， mRNA expressions of LC3， Cathepsin D， Rab7， PINK1 （except for TEN low-dose group） and Parkin （except for TEN low-dose group） in brain mitochondria as well as protein expressions of LC3 （except for TEN medium-dose group）， PINK1 （except for TEN high-dose group decreased significantly） and Parkin （except for TEN low-dose group decreased significantly） were increased significantly in TEN low-dose， medium-dose and high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）; mRNA （except for TEN low-dose group） and protein expressions of p62 were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with TEN medium-dose group， the changes of above indexes were inhibited significantly in TEN medium-dose+3-MA group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TEN can induce mitophagy in brain tissue of AD model mice by activating PINK1/Parkin signaling pathway and improve lysosome function.

KEYWORDS? ?Tenuifolin; Alzheimers disease; PINK1/Parkin signaling pathway; Mitochondrial autophagy; APP/PS1 double transgenic mice

阿爾茨海默病（AD）是一種主發(fā)于老年人的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征包括：神經(jīng)元外以β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積為核心而形成的老年斑，細(xì)胞內(nèi)以超磷酸化的Tau為核心而形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失等[1-3]。已有研究表明，神經(jīng)元內(nèi)自噬途徑受損會(huì)阻礙受損線粒體的清除，受損線粒體累積會(huì)導(dǎo)致Tau蛋白聚集，而聚集的Tau蛋白又會(huì)進(jìn)一步加重線粒體自噬障礙，導(dǎo)致腺苷三磷酸生成受阻，最終引起腦內(nèi)神經(jīng)元的死亡[4]。此外，Aβ聚集多發(fā)生在神經(jīng)元外部，亦可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并能在線粒體內(nèi)沉積，從而損傷線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，反之線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能異常也可進(jìn)一步加劇Aβ聚集[5]。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可通過抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）而誘導(dǎo)和促進(jìn)線粒體自噬，減少Aβ和Tau蛋白聚集，保護(hù)神經(jīng)元[6]。由此可見，AD的發(fā)生和發(fā)展可能與線粒體自噬障礙密切相關(guān)。

線粒體自噬是指以線粒體為靶細(xì)胞器的自噬過程，是通過自噬體與自噬啟動(dòng)蛋白等相關(guān)因子共同作用來清除受損線粒體以維持生物體內(nèi)線粒體的穩(wěn)態(tài)，在維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)中起著重要的作用，被認(rèn)為是保護(hù)神經(jīng)元的關(guān)鍵要素[7-9]。在哺乳動(dòng)物中，參與線粒體自噬的主要信號(hào)通路有人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導(dǎo)的假定激酶1（PINK1）/E3泛素連接酶（Parkin）蛋白信號(hào)通路、FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1（FUNDC1）信號(hào)通路、B細(xì)胞淋巴瘤2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BNIP3）/NIP3樣蛋白X（NIX）信號(hào)通路等，其中神經(jīng)系統(tǒng)線粒體自噬主要受PINK1/Parkin信號(hào)通路的影響，應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體自噬被觸發(fā)后會(huì)通過PINK1/Parkin信號(hào)通路介導(dǎo)的相關(guān)途徑來消除受損的線粒體，從而維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)[10]。Lutz等[11]的研究結(jié)果表明，在Parkin或PINK1缺失的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中，線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1的表達(dá)量增加，代表線粒體分裂增加，而Parkin和PINK1可能有調(diào)節(jié)線粒體分裂的作用。

遠(yuǎn)志Polygalae Radix為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志（又名細(xì)葉遠(yuǎn)志）Polygala tenuifolia Willd.或卵葉遠(yuǎn)志（又名寬葉遠(yuǎn)志）Polygala sibirica L.的干燥根，主要藥用成分為遠(yuǎn)志皂苷，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[12-14]。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷（tenuifolin，TEN）是遠(yuǎn)志總皂苷經(jīng)堿水解減毒后的主要次級(jí)皂苷成分，相較于遠(yuǎn)志皂苷元，TEN的性質(zhì)更穩(wěn)定，且溶血等毒副作用大大降低[15]。有研究表明，遠(yuǎn)志的皂苷類化合物可增加正常小鼠腦神經(jīng)元自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的表達(dá)，減少自噬選擇性底物泛素結(jié)合蛋白p62的表達(dá)，提高小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力[16]。遠(yuǎn)志可通過激活腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）/mTOR信號(hào)通路來誘導(dǎo)線粒體自噬，從而減少SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ蛋白的分泌，進(jìn)而發(fā)揮抗AD的作用[17-18]。本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，基于PINK1/Parkin信號(hào)通路研究TEN對(duì)AD模型小鼠腦組織線粒體自噬的影響，旨在為深入研究TEN的抗AD機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括CFX Connect型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司），Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司），H1650-W型臺(tái)式微量高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），GeneGnome XRQ型凝膠成像儀（英國Syngene公司），NanoDrop Lite型超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

TEN對(duì)照品（貨號(hào)A1023AS，純度>98%）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）對(duì)照品（貨號(hào)S2767，純度99.97%）購自美國Selleck Chemicals公司;組織線粒體分離試劑盒（批號(hào)C3606）、苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液（批號(hào)ST505）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析試劑盒（批號(hào)P0010S）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（批號(hào)P0012A）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑購自寶生物工程（大連）有限公司;通用型顯色試劑盒（小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng)）（批號(hào)PV-6000）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑（批號(hào)ZLI-9019）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（供免疫組化用，批號(hào)PV-9000）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（批號(hào)YJ0023）、內(nèi)源性過氧化氫酶阻滯劑3%雙氧水（批號(hào)YJ0036）、免疫組化封閉液（批號(hào)YJ0054）、蘇木精染色劑（批號(hào)YJ0058）均購自廣州永津生物科技有限公司;ECL顯色液（批號(hào)CW0049S）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect? ?Real Time）預(yù)混液（批號(hào)RR047A）、SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（批號(hào)RR820A）均購自日本Takara公司;兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號(hào)bs-0061R）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（供Western blot用，批號(hào)bs-40295G-HRP）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔源LC3多克隆抗體（批號(hào)ab48394）、兔源p62多克隆抗體（批號(hào)ab109012）、兔源PINK1多克隆抗體（批號(hào)ab23707）、兔源Parkin多克隆抗體（批號(hào)ab15954）均購自英國Abcam公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性B6C3-Tg（APPswePSEN1dE9）/Nju系A(chǔ)PP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠（簡稱“APP/PS1小鼠”）50只和SPF級(jí)雄性同系野生型小鼠10只，3～4月齡，均購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2015-0001。所有小鼠均飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房（溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照/黑暗時(shí)間12 h/12 h）中，自由進(jìn)食、飲水。本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守廣東藥科大學(xué)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)章程》的相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1 分組與給藥

將50只APP/PS1小鼠隨機(jī)分為模型組，TEN低、中、高劑量組[20、40、80 mg/（kg·d），劑量均按本課題組前期研究結(jié)果設(shè)置]，TEN中劑量+3-MA組[TEN 40 mg/（kg·d）+3-MA 30 mg/（kg·d），劑量均按本課題組前期研究結(jié)果設(shè)置]，每組10只。另將10只同系野生型小鼠作為正常對(duì)照組。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)劑量的藥液[溶劑均為0.3%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液]，模型組和正常對(duì)照組小鼠灌胃0.3%CMC-Na溶液，每天給藥1次，給藥體積為0.01 mL/g，連續(xù)給藥3個(gè)月后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 取樣方法

小鼠末次給藥后禁食12 h，脫頸椎處死，快速于冰上分離腦組織并置于-80 ℃冰箱中保存，備用。每組隨意選取3只小鼠的腦組織適量，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，對(duì)腦組織進(jìn)行脫水處理、經(jīng)石蠟包埋后切片（厚度約4 μm），用于免疫組化染色。按照組織線粒體分離試劑盒說明書方法操作，分離提取每組剩余7只小鼠腦組織的線粒體并置于-80 ℃冰箱中保存，用于相關(guān)mRNA和蛋白檢測。

2.3 小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3陽性分布的檢測

采用免疫組化染色法進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下各組小鼠腦組織切片，用二甲苯脫蠟，對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)、封閉后，加入LC3一抗（稀釋比例為1 ∶ 100），于4 ℃下孵育過夜;用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）洗滌5 min×5次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，于37 ℃下孵育20 min;用PBS洗滌5 min×5次，以DAB顯色劑顯色，用PBS終止反應(yīng)，并以蘇木精復(fù)染，經(jīng)乙醇梯度洗脫、二甲苯透明后，用中性樹膠封片。使用成像系統(tǒng)成像，并于正置光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3的陽性分布（陽性顯棕黃色），使用Image J v1.8.0軟件計(jì)算其積分光密度（IOD）。

2.4 小鼠腦組織線粒體中LC3、p62、Cathepsin D、Rab7、PINK1、Parkin mRNA表達(dá)的檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下凍存的各組小鼠腦組織線粒體（Cathepsin D、Rab7 mRNA的檢測不考慮TEN中劑量+3-MA組），經(jīng)PMSF裂解后，用Trizol試劑提取總RNA，取樣品2 μL測定RNA濃度，按照PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）預(yù)混液說明書方法進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，取cDNA按照SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書方法進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系（10 μL）如下：2×Ultra SYBR Mixture 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3.6 μL。擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法以GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)基因的表達(dá)量，并以正常對(duì)照組為參照進(jìn)行歸一化處理。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列和產(chǎn)物片段長度見表1。

2.5 小鼠腦組織線粒體中LC3、p62、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下凍存的各組小鼠腦組織線粒體，經(jīng)PMSF裂解后提取總蛋白，用BCA法測定濃度后，于100 ℃下加熱10 min使變性。取變性蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉于室溫下封閉，加入LC3、p62、PINK1、Parkin、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于4℃下孵育過夜;用TBST緩沖液洗滌10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000），于室溫下孵育1.5 h，用TBST緩沖液洗滌10 min×3次，用ECL顯色液曝光并置于凝膠成像儀上成像。使用Image J v1.8.0軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 TEN對(duì)APP/PS1小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3陽性表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3陽性表達(dá)的IOD值顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，TEN低、中劑量組小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3陽性表達(dá)的IOD值雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），僅TEN高劑量組小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3陽性表達(dá)的IOD值顯著升高（P<0.05）。與TEN中劑量組比較，TEN中劑量+3-MA組小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3陽性表達(dá)的IOD值顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖1、表2。

3.2 TEN對(duì)APP/PS1小鼠腦組織線粒體中LC3、p62、Cathepsin D、Rab7、PINK1、Parkin mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織線粒體中LC3、p62、PINK1、Parkin mRNA的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），Cathepsin D、Rab7 mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，TEN低、中、高劑量組小鼠腦組織線粒體中LC3、Cathepsin D、Rab7、PINK1（除TEN低劑量組外）、Parkin（除TEN低劑量組外）mRNA的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），p62（除TEN低劑量組外）mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與TEN中劑量組比較，TEN中劑量+3-MA組小鼠腦組織線粒體中LC3、PINK1、Parkin mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），p62 mRNA的表達(dá)量顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表3。

3.3 TEN對(duì)APP/PS1小鼠腦組織線粒體中LC3、p62、PINK1、Parkin蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織線粒體中LC3、p62、PINK1、Parkin蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，TEN低、中、高劑量組小鼠腦組織線粒體中LC3（除TEN中劑量組外）、PINK1（除TEN高劑量組顯著降低外）、Parkin（除TEN低劑量組顯著降低外）蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），p62蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.01）。與TEN中劑量組比較，TEN中劑量+3-MA組小鼠腦組織線粒體中LC3、PINK1、Parkin蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），p62蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見圖2、表4。

4 討論

由于AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致目前還沒有可治愈AD的藥物或方法，因此明確該病的發(fā)病機(jī)制和研發(fā)有效的治療藥物已經(jīng)成為醫(yī)藥界研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)[19]。近年來研究者們發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)病機(jī)制涉及多種病理學(xué)變化，包括線粒體自噬功能障礙等[20]。大量文獻(xiàn)報(bào)道，線粒體異常和突觸功能障礙的存在是Aβ蛋白聚集或Tau磷酸化的起因[21-23]，且線粒體自噬途徑受損可能導(dǎo)致AD的發(fā)生[24-25]。

LC3是自噬體膜上的標(biāo)志蛋白。在自噬體形成過程中，Atg4蛋白酶在新合成LC3的羧基端進(jìn)行剪切，生成LC3-Ⅰ，隨后LC3-Ⅰ通過Atg7和Atg3參與的泛素樣反應(yīng)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成脂質(zhì)化形式的LC3-Ⅱ并附著于自噬體膜表面，LC3-Ⅱ是形成完整自噬體過程中必不可少的關(guān)鍵因子，因此LC3-Ⅱ常作為自噬體的標(biāo)志物，而LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值則被用來衡量自噬體的形成情況[26]。p62能夠同自噬體膜上的LC3結(jié)合形成一個(gè)完整的自噬小體，隨后溶酶體會(huì)與包裹著目標(biāo)線粒體的自噬小體融合，形成自噬-溶酶體，最后被溶酶體內(nèi)的蛋白水解酶降解，p62隨即被一同降解[27]。由此可見，一個(gè)完整的自噬過程包括自噬體的形成和自噬體的清除，自噬的強(qiáng)弱與LC3成正比，與p62成反比。如果LC3和p62表達(dá)同時(shí)增加，只能表明自噬體已形成，但并未被正常降解，即包裹異常線粒體的自噬體沒有被機(jī)體清除。有研究提示，提高APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力可能與調(diào)節(jié)LC3和p62相關(guān)的自噬水平有關(guān)[28-29]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3的陽性分布以及腦組織線粒體中LC3、p62 mRNA及其蛋白的表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組，表明APP/PS1小鼠腦組織線粒體中自噬體有所增加，但自噬體沒有得到較好的降解;經(jīng)高劑量TEN干預(yù)后，APP/PS1小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3的陽性分布以及腦組織線粒體中LC3 mRNA及其蛋白的表達(dá)量均顯著高于模型組，而p62 mRNA及其蛋白的表達(dá)量均顯著低于模型組，表明TEN加快了自噬體的降解，使受損線粒體得以清除;而自噬抑制劑3-MA和TEN的共同干預(yù)結(jié)果表明，在線粒體自噬被抑制的情況下，TEN的上述作用也會(huì)受到抑制。

已有研究表明，溶酶體功能以及溶酶體與自噬小體的融合是影響線粒體自噬的重要因素[30]。溶酶體內(nèi)主要的蛋白水解酶是Cathepsin D，其表達(dá)水平的高低影響著溶酶體的降解活性[31];Rab7則是調(diào)控溶酶體與自噬小體融合的關(guān)鍵因子[32]。有研究表明，溶酶體內(nèi)蛋白水解酶活性的減弱以及線粒體自噬啟動(dòng)水平的降低都會(huì)使APP/PS1小鼠腦組織線粒體的自噬水平下降，提示當(dāng)溶酶體功能受損后，即使能夠形成自噬-溶酶體，也無法降解自噬體，致使大量包裹著受損線粒體的自噬體聚集在腦部，導(dǎo)致神經(jīng)元異常死亡[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合、增強(qiáng)Cathepsin D的活性，可減輕神經(jīng)功能受損與神經(jīng)元死亡程度[34]。另有研究指出，12月齡的APP/PS1小鼠腦組織中可發(fā)現(xiàn)大量Aβ斑塊，且Rab7活性顯著減弱，提示大量Aβ斑塊可能影響溶酶體功能，從而影響線粒體自噬水平[35]。本研究結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠腦組織線粒體中Cathepsin D、Rab7 mRNA的表達(dá)量均顯著低于正常對(duì)照組，表明APP/PS1小鼠腦組織線粒體中溶酶體內(nèi)蛋白水解酶的活性減弱，溶酶體與自噬體的融合受阻;經(jīng)TEN干預(yù)后，APP/PS1小鼠腦組織線粒體中Cathepsin D、Rab7 mRNA的表達(dá)量均顯著高于模型組，表明TEN能夠增強(qiáng)APP/PS1小鼠腦組織線粒體中溶酶體內(nèi)蛋白水解酶的活性和溶酶體與自噬體的融合作用。這進(jìn)一步證實(shí)了TEN能夠通過線粒體自噬-溶酶體系統(tǒng)促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合，提高線粒體的自噬水平，增強(qiáng)清除受損線粒體的能力。

PINK1/Parkin信號(hào)通路是介導(dǎo)線粒體自噬的重要途徑[36]。PINK1是一種定位于線粒體外膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在正常線粒體中，線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶和線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶會(huì)將PINK1轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)，在基質(zhì)金屬蛋白酶和早老素相關(guān)菱形樣蛋白的作用下，PINK1被降解，使PINK1無法募集位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Parkin[37]。當(dāng)線粒體受損時(shí)，PINK1可發(fā)生自身磷酸化并募集Parkin，二者通過與p62、LC3結(jié)合，使受損線粒體被溶酶體中的蛋白水解酶降解[37]。已有研究報(bào)道，提高Parkin可降低AD模型小鼠腦組織中Aβ的含量，提高其學(xué)習(xí)記憶能力[38]。本研究結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠腦組織線粒體中PINK1、Parkin mRNA及其蛋白的表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組，表明APP/PS1小鼠腦組織中受損線粒體增多，PINK1無法進(jìn)入線粒體內(nèi)被降解清除，致使積聚于受損線粒體外膜上的PINK1通過募集游離于細(xì)胞質(zhì)中的Parkin至線粒體外膜，從而啟動(dòng)APP/PS1小鼠腦組織線粒體的自噬;經(jīng)中劑量TEN干預(yù)后，APP/PS1小鼠腦組織線粒體中PINK1、Parkin mRNA及其蛋白的表達(dá)量均顯著高于模型組，表明TEN能夠增強(qiáng)APP/PS1小鼠腦組織線粒體自噬;而3-MA和TEN的共同干預(yù)結(jié)果表明，3-MA可抑制TEN對(duì)APP/PS1小鼠腦組織線粒體自噬的增強(qiáng)作用。上述結(jié)果證實(shí)，APP/PS1小鼠腦組織中受損線粒體能夠啟動(dòng)線粒體自噬，但僅僅是機(jī)體的代償作用，自噬水平依舊不足以清除受損線粒體，而TEN能夠增強(qiáng)線粒體的自噬水平，加快受損線粒體的清除。

綜上所述，TEN可能通過激活PINK1/Parkin信號(hào)通路來誘導(dǎo)APP/PS1小鼠腦組織線粒體的自噬，增強(qiáng)溶酶體功能，為闡明TEN治療AD的分子機(jī)制提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-07-12 修回日期：2021-10-11）

（編輯：鄒麗娟）