婁 雪，廖 莉，李興珺，王 楠，劉 爽，崔若玫，徐 健

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，昆明 650032)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常累及多個外周關節(jié)的慢性自身免疫性疾病，特征為炎癥細胞浸潤關節(jié)，滑膜細胞及破骨細胞增殖，導致滑膜腫脹、骨及軟骨破壞、關節(jié)功能損傷及畸形[1-2]，其患病率可達0.3%～1.0%，多發(fā)于40～60歲女性[3]。RA主要表現(xiàn)為T細胞、B細胞及巨噬細胞的大量增殖與浸潤，這些細胞可直接作用于機體或分泌細胞因子等炎性介質參與疾病的發(fā)生[1]。臨床特征可表現(xiàn)為類風濕因子抗體及抗瓜氨酸蛋白抗體等自身抗體陽性，但并非所有患者都表現(xiàn)為抗體陽性。RA的發(fā)病機制尚不十分明確，可能與遺傳學、自身免疫和環(huán)境等因素密切相關，其中遺傳學參與可達50%～60%[4]。

腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導劑(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK，又稱TNFSF12或APP3L)是腫瘤壞死因子超家族中的一員，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，由腫瘤壞死因子超家族基因編碼，具有刺激細胞增殖、凋亡，促進血管生成及誘導促炎細胞因子和趨化因子的表達等生物活性[5]。TWEAK與其受體成纖維細胞生長因子誘導早期反應蛋白14(fibroblast growth factor-inducible immediate-early response protein 14，F(xiàn)n14)結合可發(fā)揮多種生物學功能，參與細胞增殖、分化、凋亡、新生血管形成及炎癥反應。有研究表明，TWEAK與RA的發(fā)病機制有關，TWEAK可以增加成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)中的炎性細胞因子的產(chǎn)生，如前列腺素E2、基質金屬蛋白酶1等[6]。

遺傳學在自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，表觀遺傳學是細胞表型的可遺傳變化，是在不改變DNA序列的情況下影響基因調(diào)控的化學修飾，表觀遺傳學的改變(如DNA甲基化、非編碼RNA及組蛋白修飾)被認為與RA的發(fā)病機制有關[7]。DNA甲基化是一種DNA化學修飾，是指在DNA甲基轉移酶的催化作用下，于基因組CpG位點的5′碳位共價鍵上結合一個甲基，使5′-胞嘧啶轉化為5′-甲基胞嘧啶，DNA甲基化在RA中的作用日漸成為研究熱點[8-9]。DNA甲基化通過甲基化調(diào)控區(qū)的胞嘧啶來抑制編碼基因mRNA的轉錄，可在不改變DNA序列的情況下，調(diào)節(jié)基因的表達和關閉，通過控制基因的表達來改變遺傳表觀，與機體生理和病理過程密切相關，參與癌癥等多種疾病的發(fā)病機制[10]。DNA甲基化參與炎癥反應和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，其可通過調(diào)節(jié)T細胞和B細胞的活性介導自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，DNA甲基化通過調(diào)控基因的表達參與機體的生理及病理反應，進而改變個體的表觀遺傳。

基因的DNA甲基化水平通過控制mRNA的表達，影響蛋白質的產(chǎn)生，該途徑為基因參與機體多種功能的途徑之一。與遺傳突變相反，表觀遺傳是可逆的，可通過改變基因的甲基化進而影響疾病的發(fā)生與進展。本研究對TWEAK基因甲基化水平、mRNA表達水平及蛋白濃度進行了研究，希望能進一步探討該基因參與RA發(fā)病機制的途徑和方法，為RA的早期診斷提供新的潛在生物標志物，并為治療提供新思路和方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2019年10月至2021年1月在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科住院的RA患者。納入標準：(1)年齡≥16歲且<80歲；(2)符合2009年美國風濕病協(xié)會的RA診斷標準[11]。排除標準：(1)合并嚴重的臟器損傷；(2)合并其他自身免疫性疾??；(3)懷孕及哺乳期女性；(4)合并腫瘤。根據(jù)納入和排除標準連續(xù)取樣，按照成組設計原則，另選取年齡和性別相匹配的同期體檢健康志愿者作為健康對照組。本研究獲得昆明醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準，患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

按照RA疾病活動度評分(disease activity score 28，DAS28)標準[12]，根據(jù)壓痛關節(jié)數(shù)量、腫脹關節(jié)數(shù)量、紅細胞沉降率及視覺模擬評分，使用公式計算DAS28評分，對RA患者進行疾病活動度評估，并將RA患者分為中低疾病活動度組(評分2.6～5.1)和高疾病活動度組(評分>5.1)。

1.2 DNA甲基化水平檢測

1.2.1DNA提取 分別從RA組和健康對照組中隨機抽取45例，使用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒(TIANGEN，中國)按照操作說明進行DNA提取，得到的DNA溶液用于之后的DNA甲基化檢測。MassARRAY甲基化的DNA質量要求：電泳條帶完整，主帶明顯，無嚴重降解；DNA濃度>50 mg/L，單個樣品總量>1 μg；2.2>A260/A280>1.5；A260/A230>0.6。剔除質量不合格樣品。

1.2.2引物設計 選取基因轉錄起始位點-5 000 bp至+1 000 bp序列，并預測候選基因啟動子區(qū)域、轉錄因子、CpG島等信息，采用美國Agena公司的EpiDesigner軟件進行引物設計，合成對應片段的PCR引物序列：5′端引物序列，aggaaga gagAGGTATTTAAGGGTATTTTTGGTGG；3′端引物序列，cagtaatacgactcactatagggagaaggctCCTATAATCCCAA CATTTTAAAAAACC。

1.2.3DNA甲基化 (1)亞硫酸氫鹽轉化：待檢測DNA樣品使用甲基化DNA亞硝酸鹽處理試劑盒(Zymo，美國)進行轉化處理，使非甲基化的胞嘧啶(C)發(fā)生脫氨基反應從而轉變成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶不能發(fā)生脫氨基反應，仍保留為胞嘧啶。向樣品中加入ddH2O 9 mL，M-稀釋緩沖液3 mL，M-溶液緩沖液500 μL，混勻后上機，轉化反應條件如下：98 ℃，10 min；64 ℃，30 min(5個循環(huán))；4 ℃，2 min。轉化后的DNA樣品放置于M-洗脫緩沖液中進行洗脫，之后移到純化盒中純化。(2)PCR擴增反應：DNA樣品低速離心10 s，取DNA模板1 μL，在冰上加入ddH2O 6.4 μL，10×PCR緩沖液 1 μL，dNTPs 1 μL，PCR酶 0.2 μL，正反引物各 0.2 μL，進行擴增反應，反應條件如下：94 ℃，4 min；94 ℃，20 s；56 ℃，20 s；72 ℃，1 min(共45個循環(huán))；72 ℃，3 min；4 ℃，2 min。(3)蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)消化反應：配置SAP酶反應體系，取PCR擴增產(chǎn)物5 μL，加入不含核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)的ddH2O 1.7 μL、SAP酶 0.3 μL，向反應板的每個孔中加入7 μL SAP反應液，離心后進行SAP反應，條件如下：37 ℃，2 min；85 ℃，5 min；4 ℃，2 min。去除得到的PCR擴增產(chǎn)物中的dNTPs。(4)轉錄酶切反應：①配置轉錄酶切反應體系：不含RNase的ddH2O 3.21 μL，5×T7聚合酶緩沖液0.89 μL，T 剪切轉錄混合物0.22 μL，100 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)試劑0.22 μL，T7 RNA&DNA聚合酶0.4 μL，RNase A 0.06 μL，PCR/SAP混合劑2 μL；②轉錄酶切反應條件如下：37 ℃，3 h；4 ℃，2 min。(5)樹脂純化：向MG Dimple板內(nèi)加入樹脂進行純化。(6)芯片點樣：采用Nanodispenser點樣儀(美國Agena公司，型號：RS1000)，將樹脂純化后的產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP?芯片上，進行點樣處理，將點樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析。檢測結果使用EpiTYPERTM軟件提供的DNA甲基化定量分析手段進行分析，將實驗數(shù)據(jù)與DNA序列相吻合，得到最終結果。

1.3 外周血mRNA表達水平檢測

對所有受試者外周血mRNA表達水平進行檢測。(1)RNA提取和反轉錄PCR反應：取400 μL受試者外周血，使用RNAprep Pure Hi-Blood Kit試劑盒(TIANGEN，中國)，按照操作說明要求提取受試者RNA，之后使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(日本TAKARA)按照操作說明書進行反轉錄PCR反應。(2)實時熒光定量PCR反應：根據(jù)引物設計原則預測候選基因啟動子區(qū)域、轉錄因子、CpG島等信息，進行引物設計選擇和合成，正向引物：5′-AAGACCCCACTTCAGGCACTAA-3′，反向引物：5′-TCTTGTTTCTCGCCCCTCAC-3′。使用TB Green? Premix EX TaqTMⅡ試劑盒(日本TAKARA)按照操作說明進行實時熒光定量PCR反應。(3)數(shù)據(jù)計算：目的基因的mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示，采用公式ΔΔCt=(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)實驗組-(目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)對照組進行計算，用目的基因相對表達量來表示mRNA表達水平。

1.4 血清TWEAK蛋白濃度檢測

從RA組和健康對照組中隨機各抽取40例，使用人TWEAK酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(Invitrogen，美國)按照操作說明檢測血清TWEAK蛋白濃度。用分光光度計讀取微孔板上各孔的光密度(使用450 nm作為主波長)，根據(jù)各孔的光密度值，計算各孔的樣品濃度值，剔除誤差值較大的樣品。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 研究對象基本信息

研究最終納入RA患者112例，平均年齡(53.27±12.90)歲，包括女性83例，男性29例；其中，高疾病活動度組63例，平均年齡(54.73±10.48)歲，包括女性43例，男性20例；中低疾病活動度組49例，平均年齡(51.39±15.37)歲，包括女性40例，男性9例。健康對照組86例，平均年齡(50.79±9.57)歲，包括女性59例，男性27例。RA組和健康對照組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 外周血TWEAK基因各位點甲基化水平

剔除掉質量不合格的樣品后，本研究共對40例RA組患者(高疾病活動度組24例，中低疾病活動度組16例)和45例健康志愿者進行了TWEAK基因甲基化水平檢測。RA組TWEAK基因總體甲基化表達水平高于健康對照組(t=3.160，P=0.002)。共檢測到RA組TWEAK基因的19個位點發(fā)生甲基化，其中CpG_11(Z=-2.582，P=0.01)、CpG_17.18.19.20(Z=-2.73，P=0.006)、CpG_40.41.42(Z=-3.131，P=0.002)位點處的甲基化水平明顯高于健康對照組(圖1)。

除高疾病活動度組CpG_55.56甲基化水平明顯高于中低疾病活動度組(t=-2.112，P=0.041)外，TWEAK基因總體甲基化水平在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.579，P=0.566，表1)，其他位點甲基化水平在兩組間也未見差異化表達。

RA,rheumatoid arthritis.圖1 RA組和健康對照組各位點DNA甲基化水平比較Figure 1 Comparison of DNA methylation levels at various points in the RA group and the healthy control group

表1 高疾病活動度組與中低疾病活動度組的甲基化水平比較Table 1 Comparison of methylation levels between high,medium and low disease activity

2.3 外周血mRNA表達水平

RA組TWEAK基因mRNA表達水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(0.94±0.32vs.1.05±0.36，t=-2.295，P=0.023)。高疾病活動度組的TWEAK基因mRNA表達水平低于中低疾病活動度組，差異有統(tǒng)計學意義(0.88±0.32vs.1.01±0.31，t=2.129，P=0.035)。

2.4 血清TWEAK蛋白濃度

剔除掉誤差值較大的樣品后，共對39例RA組患者和40例健康志愿者進行了血清TWEAK蛋白濃度檢測。RA組血清TWEAK蛋白濃度與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義[316.8(212.7，406.6)ng/Lvs.301.3(213.7，536.1)ng/L，Z=-0.662，P=0.508]。將血清TWEAK蛋白濃度與mRNA表達水平進行相關分析，血清TWEAK蛋白濃度與mRNA表達水平呈正相關(r=0.482，P<0.001，圖2)。

圖2 血清TWEAK蛋白濃度與mRNA表達水平的相關性Figure 2 Correlation between serum TWEAK protein concentration and mRNA expression level

3 討論

RA是一種累及全身多關節(jié)的慢性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為多個外周關節(jié)的炎癥和破壞，其發(fā)病機制復雜多樣，遺傳因素、環(huán)境因素及其相互作用參與其中。細胞因子是由免疫細胞以及其他組織中的某些細胞產(chǎn)生的小分子量蛋白質或糖蛋白，多種細胞因子已被證實與RA的發(fā)病機制密切相關[2]。腫瘤壞死因子超家族的各成員與RA發(fā)病機制的關系也越來越被人們所關注，相關研究表明，TWEAK與RA的發(fā)病可能相關，但是其參與RA發(fā)病的途徑尚不清楚，對于其作用機制的進一步研究或可為RA的臨床診斷與治療提供新的思路及治療靶點。

TWEAK作為腫瘤壞死因子超家族中的一員，具有多向性功能，可誘導內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，參與新生血管的生成和炎癥反應。TWEAK具有促炎細胞因子的作用，抑制TWEAK可減輕關節(jié)炎癥、滑膜血管新生以及軟骨和骨的破壞。人類的TWEAK基因位于17號染色體上，F(xiàn)n14是人TWEAK的唯一受體，參與介導TWEAK誘導內(nèi)皮細胞增殖等反應，兩者結合可發(fā)揮多種生物學功能[13]。TWEAK-Fn14相互作用可誘導趨化因子和炎癥因子的產(chǎn)生，參與炎癥反應調(diào)節(jié)，與多種自身免疫性疾病的發(fā)病相關，如RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及多發(fā)性硬化癥[14-15]。RA患者中，TWEAK-Fn14可通過誘導細胞增殖和新生血管的生成，導致關節(jié)組織發(fā)生持續(xù)性炎癥和進行性破壞[16]。Park等[17]發(fā)現(xiàn)，RA患者血清TWEAK蛋白水平比正常對照人群和強直性脊柱炎患者顯著升高。van Kuijk等[16]發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜組織中TWEAK的表達水平明顯高于銀屑病關節(jié)炎患者。Dharmapatni等[18]發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜組織中TWEAK的表達明顯高于骨關節(jié)炎患者。值得注意的是，Maecker等[19]發(fā)現(xiàn)，與TNF-α的作用機制相反，TWEAK能抑制轉錄激活因子1的刺激，誘導p65核因子-κB與組蛋白去乙?；?的結合，抑制促炎細胞因子基因的轉錄和細胞因子的產(chǎn)生。將小鼠的TWEAK基因敲除后，發(fā)現(xiàn)TWEAK能抑制干擾素-γ和白細胞介素-12的產(chǎn)生，控制先天性炎癥反應以及其向TH1型適應性免疫反應的轉變。這提示TWEAK的功能可能已經(jīng)進化，其可阻止過度炎癥和自身免疫反應的發(fā)展，TWEAK的抑制作用可能有助于增強抗感染和抗癌免疫，TWEAK受體激活可能有助于控制自身免疫性疾病。

表觀遺傳機制可能是基因型、環(huán)境和表型之間的動態(tài)聯(lián)系。表觀遺傳學參與RA的發(fā)病機制，DNA甲基化是最重要的表觀遺傳修飾之一，其在不改變DNA序列的情況下，調(diào)控機體的生長發(fā)育及基因的表達模式和穩(wěn)定性，且DNA甲基化在發(fā)育和細胞增殖的過程中是可以穩(wěn)定傳遞的。DNA甲基化多發(fā)生于啟動子區(qū)域，控制靶基因的轉錄和表達，與靶基因的mRNA表達水平具有相關性。Guo等[20]發(fā)現(xiàn)，RA患者與健康人群相比共有383個高甲基化和785個低甲基化基因位點存在差異。Zhu等[21]證實了低甲基化可以引起對應靶基因的過度表達，而高甲基化則會引起對應靶基因的沉默表達。本研究發(fā)現(xiàn)，TWEAK基因總體甲基化水平和CpG_11、CpG_17.18.19.20、CpG_40.41.42位點甲基化水平均高于健康對照組，TWEAK基因mRNA表達水平低于健康對照組，該結果證實了基因啟動子區(qū)的高甲基化水平可調(diào)控該基因mRNA表達水平的下調(diào)，TWEAK基因啟動子區(qū)甲基化水平可能是mRNA表達的調(diào)控機制之一。RA患者血清TWEAK蛋白濃度與健康對照組差異沒有統(tǒng)計學意義，但其與該基因mRNA表達水平呈正相關，且隨著mRNA表達水平升高，血清蛋白濃度也升高，這與基因mRNA表達對蛋白翻譯的調(diào)控相一致。本研究結果表明，TWEAK與RA的發(fā)病機制相關，TWEAK基因的高甲基化水平、低mRNA表達可能參與了RA的發(fā)病過程，DNA甲基化可通過調(diào)控基因表達，參與機體的生理及病理反應，進而改變個體的表觀遺傳。既往有文獻報道RA患者TWEAK的表達水平升高，該結果與本研究相反，可能因為甲基化是一個可改變的表觀修飾，當機體發(fā)生炎癥反應及免疫失調(diào)時，增多的TWEAK可通過機體的負反饋機制進一步上調(diào)基因的甲基化水平，使得TWEAK基因的mRNA表達下調(diào)，而血清蛋白濃度的調(diào)控所需時間較長，所以尚未完全表現(xiàn)出差異。同時有研究表明，機體在體內(nèi)對TWEAK基因的表達有調(diào)節(jié)性，TWEAK基因mRNA水平可能不是TWEAK基因蛋白豐度的可靠指標[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與中低疾病活動度組相比，高疾病活動度RA患者mRNA表達水平降低、CpG_55.56位點甲基化水平升高，該結果與本研究一致，TWEAK與RA的疾病活動度有關，其外周血mRNA表達水平及CpG_55.56位點甲基化水平對RA的疾病活動度具有臨床提示價值。

本研究屬于小樣本量研究，結果可能存在偏倚，此外，本研究只檢測了外周血，缺乏其他組織器官的表達研究，后續(xù)需擴大樣本量，進一步探究TWEAK基因與RA的發(fā)病機制和病情進展的關聯(lián)性。

綜上所述，本研究對RA患者外周血TWEAK基因DNA甲基化水平、mRNA表達水平及血清蛋白濃度進行了研究，初步探討了TWEAK基因甲基化水平及表達與RA發(fā)病機制的關聯(lián)，結果發(fā)現(xiàn)TWEAK基因與RA的發(fā)病和病情進展密切相關，TWEAK基因的高甲基化狀態(tài)可能是調(diào)控mRNA低表達的表觀遺傳學機制之一，TWEAK基因通過該機制參與了RA的發(fā)生與進展，可作為臨床監(jiān)測和評價RA病情的重要指標之一，為RA的臨床診斷及治療提供了新的思路和手段。