陳章健，韓 碩，鄭 湃，賈 光

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191)

二氧化鈦(titanium dioxide，TiO2)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用主要是作為食品添加劑[1-2]，這已經(jīng)得到了國際食品衛(wèi)生及食品添加劑主管組織聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)、國際食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission，CAC)、美國食品與藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)、歐盟食品安全管理局(Euro-pean Food Safety Authority，EFSA)等的批準(zhǔn)，其中美國FDA在2002年認(rèn)可TiO2為安全物質(zhì)，對人體并無傷害。中國國家衛(wèi)生和健康委員會(huì)也已正式公布TiO2可用于食品著色劑(GB25577-2010、GB2760-2007)，并詳細(xì)規(guī)定了TiO2的適用范圍和最大使用量。

隨著納米技術(shù)在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)領(lǐng)域的不斷開發(fā)與應(yīng)用，納米材料在食品中的應(yīng)用也越來越廣泛[3]。相對于常規(guī)尺度的TiO2，納米TiO2因其粒徑小，具有更多的應(yīng)用優(yōu)勢，如口感細(xì)滑，折光率高、遮蓋率強(qiáng)、白色度好等，在食品中的應(yīng)用急速增加[4]。但是，納米材料的特殊理化性質(zhì)使其能在生物體內(nèi)表現(xiàn)出特殊的生物學(xué)作用，甚至可能導(dǎo)致一系列的病理生理改變[5-6]，這必然會(huì)導(dǎo)致人們對納米材料在食品中應(yīng)用的安全性產(chǎn)生質(zhì)疑。經(jīng)口攝入納米TiO2的安全性研究較少，且多著重于研究其急性或亞急性經(jīng)口毒性[7-9]。

本課題組前期的研究工作指出，經(jīng)口暴露納米TiO230 d能使Sprague-Dawley(SD)大鼠血漿中還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(glutathione/gluta-thione oxidized，GSH/GSSG)的比例明顯升高，提示機(jī)體產(chǎn)生了還原應(yīng)激[8]。本研究通過90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，進(jìn)一步探討納米TiO2對SD大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響，以期揭示經(jīng)口攝入納米TiO2對血液系統(tǒng)的亞慢性毒性作用，為納米TiO2在食品領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 納米材料與表征

納米TiO2購自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司，純度為99.9%，晶體結(jié)構(gòu)為銳鈦礦，近球形顆粒，平均粒徑為(24±5)nm。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌雄各20只清潔級SD大鼠(3周齡，雌性體質(zhì)量64～98 g，雄性體質(zhì)量85～109 g)，購買并飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0012、SYXK(京)2011-0039]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，雌雄各5只。

1.3 大鼠灌胃染毒

采用兒童每日攝入TiO2量(2 mg/kg)作為暴露低劑量[4]，部分參考世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)關(guān)于嚙齒動(dòng)物重復(fù)90 d口服毒性的相關(guān)研究指南(Test No.408)進(jìn)行本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將納米TiO2懸浮于蒸餾水中，使用前超聲波分散10 min并渦旋混勻。低、中、高劑量組大鼠分別給予2、10、50 mg/kg納米TiO2懸液灌胃(前30 d灌胃體積為1 mL/只，后60 d為2 mL/只)，對照組給予同體積蒸餾水，每天上午染毒1次，持續(xù)90 d，每天更換新鮮配制的納米TiO2染毒液。每天觀察記錄動(dòng)物的一般情況，每周稱重一次。染毒期間未觀察到動(dòng)物異常表現(xiàn)，各組動(dòng)物體質(zhì)量無明顯差異。動(dòng)物處死前禁食12 h，不禁水。

1.4 血常規(guī)指標(biāo)檢測

染毒90 d后處死動(dòng)物，取腹主動(dòng)脈血1 mL以乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝，采用MEK-6318K全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本光電工業(yè)株式會(huì)社)及相關(guān)試劑測定血白細(xì)胞(white blood cells，WBC)計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞(lymphocytes，LYM)計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞(monocytes，MOD)計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞(neutrophil，GRN)計(jì)數(shù)、LYM%、MOD%、GRN%、紅細(xì)胞(red blood cells，RBC)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、紅細(xì)胞壓積(hematocrit，HCT)、平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume，MCV)、紅細(xì)胞體積分布寬度(red blood cell volume distribution width，RDW)、血小板(platelet，PLT)計(jì)數(shù)、血小板壓積(platelet crit，PCT)、平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)、血小板體積分布寬度(platelet volume distribution width，PDW)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件分析，各劑量組的生物學(xué)指標(biāo)先經(jīng)單樣本K-S檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各測定指標(biāo)的多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，方差齊時(shí)組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)組間兩兩比較采用Dunnet’s T3檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況和體質(zhì)量

如圖1所示，納米TiO2經(jīng)口暴露90 d期間，大鼠體質(zhì)量隨時(shí)間不斷增加，表明大鼠處于生長發(fā)育階段，相同染毒時(shí)間、不同染毒組雌性和雄性SD大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明納米TiO2經(jīng)口暴露對大鼠體質(zhì)量無明顯影響。未觀察到染毒期間SD大鼠一般情況出現(xiàn)異常，無死亡病例發(fā)生。

A,female rats;B,male rats.圖1 納米二氧化鈦經(jīng)口暴露90 d對SD大鼠體質(zhì)量的影響Figure 1 Effect of titanium dioxide nanoparticles on body weight of SD rats after 90 days of oral exposure n=5)

2.2 白細(xì)胞相關(guān)血常規(guī)指標(biāo)

納米TiO2可導(dǎo)致SD大鼠WBC及其分類計(jì)數(shù)的改變(表1)。與對照組相比，雌性大鼠高劑量納米TiO2染毒組的WBC、LYM、GRN計(jì)數(shù)均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雄性大鼠中劑量染毒組的WBC、LYM計(jì)數(shù)均低于對照組，高劑量染毒組的MOD%明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各劑量組均為LYM%>GRN%>MOD%，且LYM%和GRN%之和大于95%，但LYM%、GRN%、MOD%在各染毒組大鼠間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納米TiO2對SD大鼠WBC及其分類計(jì)數(shù)的影響具有明顯的性別差異。

表1 納米二氧化鈦經(jīng)口暴露90 d對SD大鼠白細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響Table 1 Effect of titanium dioxide nanoparticles on white blood cell related indicators of SD rats after 90 days of oral exposure n=5)

2.3 紅細(xì)胞相關(guān)血常規(guī)指標(biāo)

納米TiO2可導(dǎo)致SD大鼠RBC計(jì)數(shù)及其相關(guān)指標(biāo)的改變(表2)。與對照組相比，雌性大鼠高劑量納米TiO2染毒組的HGB含量、HCT、RDW均高于對照組；中劑量染毒組RDW明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雄性大鼠中劑量染毒組HGB含量、HCT、MCV均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各染毒組大鼠與對照組相比，MCH、MCHC未見明顯差異。

表2 納米二氧化鈦經(jīng)口暴露90 d對SD大鼠紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of titanium dioxide nanoparticles on red blood cell related indicators of SD rats after 90 days of oral exposure n=5)

2.4 血小板相關(guān)血常規(guī)指標(biāo)

納米TiO2對血小板計(jì)數(shù)及其相關(guān)指標(biāo)未見明顯影響(表3)。

表3 納米二氧化鈦經(jīng)口暴露90 d對SD大鼠血小板相關(guān)指標(biāo)的影響Table 3 Effect of titanium dioxide nanoparticles on platelet related indicators of SD rats after 90 days of oral exposure n=5)

3 討論

有研究指出，納米材料比微米材料更易跨越生物屏障進(jìn)入血液轉(zhuǎn)運(yùn)，因此納米材料可能會(huì)對血液系統(tǒng)造成一定的毒作用[5]。Wang等[7]進(jìn)行的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)顯示，一次經(jīng)口灌胃5 g/kg納米TiO2可經(jīng)胃腸道吸收入血后隨血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝、腎、脾、肺、腦等器官，表明納米TiO2在血液內(nèi)確實(shí)會(huì)有一定時(shí)間的滯留，因此其很可能會(huì)對血液系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響。本課題組前期的研究顯示，SD大鼠連續(xù)30 d經(jīng)口暴露0、10、50、200 mg/kg的納米TiO2[(75±15)nm]能使血漿中的GSH升高，GSSG降低，GSH/GSSG比值升高，表現(xiàn)出明顯的還原應(yīng)激反應(yīng)[8]。血液系統(tǒng)氧化還原平衡狀態(tài)的破壞能使其各種功能受到明顯影響。Duan等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，將CD-1(ICR)雌性小鼠暴露于5 nm銳鈦礦型TiO2(62.5、125.0、250.0 mg/kg，隔日灌胃染毒30 d)，可在中、高劑量組觀察到MHC、HCT、MCV、PLT、MPV、RDW上升，HGB、MCHC、網(wǎng)織紅細(xì)胞、RBC、WBC、PCT下降，提示TiO2可導(dǎo)致貧血和凝血功能改變。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，納米TiO2可誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血[10]。上述血常規(guī)指標(biāo)的變化提示納米TiO2對血液系統(tǒng)具有一定的損傷作用，而其作用機(jī)制可能與氧化還原損傷有關(guān)。

以往的研究還處于探討納米TiO2高劑量、短時(shí)間暴露對血液系統(tǒng)影響的階段，而納米TiO2經(jīng)食物攝入人體應(yīng)該是一個(gè)低劑量、長期暴露的過程，因此，本研究通過連續(xù)90 d每日灌胃的喂養(yǎng)試驗(yàn)，探討經(jīng)口攝入不同劑量(2、10、50 mg/kg)納米TiO2的亞慢性毒性試驗(yàn)對不同性別的健康SD大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示，納米TiO2可誘導(dǎo)WBC、LYM、GRN和HGB、HCT、RDW、MCV水平明顯改變，但PLT以及其他血小板相關(guān)指標(biāo)均未見明顯改變，表明經(jīng)口攝入納米TiO2對SD大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響主要集中在WBC和RBC系統(tǒng)，這與王云等[11]進(jìn)行的30 d經(jīng)口攝入不同劑量(10、50、200 mg/kg)納米TiO2對胃潰瘍SD大鼠血常規(guī)影響的研究結(jié)論相符。

本研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2對SD大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響具有明顯的性別差異，尤其體現(xiàn)在WBC及其分類計(jì)數(shù)。與對照組相比，高劑量組雌性大鼠的WBC和LYM均升高，而中劑量組雄性大鼠則下降。納米TiO2對SD大鼠血常規(guī)指標(biāo)影響的性別差異不僅體現(xiàn)在WBC及其分類計(jì)數(shù)的變化，還表現(xiàn)出暴露劑量的差別，RBC及其分類計(jì)數(shù)的變化也體現(xiàn)出這一點(diǎn)，HGB、HCT的明顯升高出現(xiàn)于雌性大鼠的高劑量組，而在雄性大鼠中其出現(xiàn)在中劑量組。Wang等[7]的研究結(jié)果也顯示，急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中納米TiO2對CD-1(ICR)小鼠的毒性有性別差異，表現(xiàn)為雌性小鼠在臟器系數(shù)以及血生化等指標(biāo)上比雄性更加敏感。本課題組前期的研究也顯示，納米TiO2經(jīng)口攝入在誘導(dǎo)肝毒性方面存在性別差異，雌性更加敏感[12]。以往的研究出于簡便的目的，納米TiO2的毒理學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)大多使用一種性別的動(dòng)物[8-9,11]，但根據(jù)我們的研究結(jié)論，納米TiO2對機(jī)體的毒性作用在性別上可能會(huì)有明顯差異，因此，如果使用一種性別的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，需要注意結(jié)論推廣時(shí)的局限性。

綜上所述，亞慢性經(jīng)口攝入納米TiO2可引起SD大鼠血常規(guī)指標(biāo)發(fā)生改變，并表現(xiàn)出性別差異，但具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。