王子靖，李在玲

(北京大學(xué)第三醫(yī)院兒科，北京 100191)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染目前已成為世界范圍內(nèi)亟待解決的健康問題之一，有研究指出，大多數(shù)H.pylori感染主要發(fā)生在兒童時期，所以兒童H.pylori感染問題正日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。現(xiàn)代流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，兒童獲得H.pylori感染的一個重要方式是家庭內(nèi)傳播，與H.pylori感染陽性的家庭成員共同生活的兒童發(fā)生H.pylori感染的概率將大大增加[2-3]。然而，結(jié)合臨床觀察我們發(fā)現(xiàn)，有些家庭成員中有明確H.pylori感染病史的兒童實(shí)際卻并未發(fā)生感染，其原因可能是菌株、生活環(huán)境、個體基因、免疫狀態(tài)等多種因素共同參與相互作用的結(jié)果[4-5]。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人體正常菌群對維護(hù)人類健康作用的相關(guān)研究也越來越深入，研究發(fā)現(xiàn)菌群紊亂對某些疾病的發(fā)生發(fā)展會產(chǎn)生重要作用。同樣，胃部菌群作為胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，其在胃腸道各種疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用也逐漸被人們認(rèn)識[6]。但是，關(guān)于有H.pylori感染家族史的兒童胃部菌群有何特點(diǎn)，目前還鮮有研究，解決這些問題有助于更深刻地認(rèn)識H.pylori感染家族史對兒童H.pylori感染的影響。

本研究通過對兒童胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行菌群16S核糖體DNA(ribosomal DNA，rDNA)測序分析，比較有H.pylori家族史的發(fā)生和未發(fā)生H.pylori感染的患兒胃部菌群構(gòu)成特點(diǎn)及差異，對差異菌群的功能進(jìn)行預(yù)測分析，旨在為探究兒童H.pylori感染的致病機(jī)制及兒童H.pylori相關(guān)疾病的微生態(tài)治療及預(yù)防提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019年3—7月就診于北京大學(xué)第三醫(yī)院兒科消化門診的兒童，所有患兒均來自北京地區(qū)，家庭經(jīng)濟(jì)收入水平相近。入組標(biāo)準(zhǔn)：1～16歲，因胃腸疾病就診于兒科消化門診，按正常計劃需要進(jìn)行胃鏡檢查，同時合并H.pylori感染家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)4周內(nèi)服用過質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、抑酸劑、抗生素、黏膜保護(hù)劑或益生菌等藥物；(2)最終診斷為嗜酸性粒細(xì)胞胃腸炎或炎癥性腸病等其他疾??；(3)無法耐受內(nèi)鏡檢查。

最終共納入42例患者，其中合并H.pylori感染者18例，年齡(11.0±1.6)歲；H.pylori非感染者24例，年齡(10.9±2.5)歲；兩組患兒年齡構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)過北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)(M2019066)。

1.2 標(biāo)本采集

患兒均簽署知情同意書，除正常胃鏡取材送組織病理檢查外，每位患兒在胃體和胃竇分別再取1份標(biāo)本，保存于-80 ℃并盡快進(jìn)行16S rDNA測序分析。H.pylori感染的診斷由下列任何一項(xiàng)檢查的陽性結(jié)果確認(rèn)：(1)細(xì)菌培養(yǎng)陽性，(2)組織病理學(xué)檢查陽性。與患兒平日共餐的任何親屬有胃部癥狀并行胃鏡檢查確診合并H.pylori感染則判定為H.pylori感染家族史陽性。

1.3 DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增測序

使用QIAamp?PowerFecal DNA試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取黏膜標(biāo)本中的細(xì)菌總DNA，提取步驟按照說明書進(jìn)行。利用特異性引物對細(xì)菌16S核糖體RNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物序列為(5′-3′)：CCTACGGGRSGCAGCAG(341F)，反向引物序列為(5′-3′)：GGACTACVVGGGTATCTAATC(806R)。將基因組DNA稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增預(yù)混液使用KAPA library HiFi Hotstart ReadyMix，確保PCR反應(yīng)進(jìn)行的準(zhǔn)確性和高效性。擴(kuò)增子經(jīng)2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測，并由AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,U.S.)回收。用Nano-Drop 2000分光光度計(Thermo Scientific,MA,USA)檢測總DNA品質(zhì)，用Qubit?2.0(Invitrogen,U.S.)檢測DNA總質(zhì)量。建庫后，擴(kuò)增子在Illumina MiSeq平臺(Illumina,CA,USA)上采用雙末端(paired-end)測序法進(jìn)行測序，并剔除低質(zhì)量和錯誤的引物序列。利用Usearch軟件去除嵌合體并進(jìn)行聚類分析，即將所有序列按照豐度從高到低排序，然后以97%的相似性聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)，記錄每個樣本匹配的OTU序列數(shù)量。為了減少不同樣本測序數(shù)據(jù)大小所引起的偏倚，將OTU序列數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，選取出現(xiàn)頻率最高的OTU作為代表序列，根據(jù)RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/)進(jìn)行物種注釋分析。

1.4 LEfSe分析和PICRUSt功能預(yù)測

LEfSe分析是采用線性判別分析(linear discri-minant analysis，LDA)來估算不同組間菌群豐度對差異影響的大小，PICRUSt軟件(http://picrust.github.io/picrust)可以根據(jù)16S rDNA數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)庫對微生物群落進(jìn)行宏基因組功能預(yù)測。首先將16S rDNA原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，然后將數(shù)據(jù)映射到構(gòu)建好的已測序基因組的功能基因構(gòu)成表，從而得到功能預(yù)測結(jié)果,最后，將LEfSe分析得到的差異菌群與預(yù)測的代謝途徑進(jìn)行關(guān)聯(lián)，找出其對物種代謝通路的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

微生物的α多樣性可以用來反映物種的豐富程度，可用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)描述。用柱狀圖表現(xiàn)各樣本在不同分類情況下菌群的分布情況。采用t檢驗(yàn)和Pearson’s卡方檢驗(yàn)對定量和分類變量進(jìn)行統(tǒng)計比較，使用SPSS(21.0,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)統(tǒng)計軟件，其中α多樣性指數(shù)采用秩和檢驗(yàn)計算(用R軟件包中的wilcox.test函數(shù)進(jìn)行兩組之間的比較，kruskal.test函數(shù)進(jìn)行兩組以上的比較)。β多樣性指數(shù)(Anosim)采用R軟件包中R vegan軟件(https://www.r-project.org)計算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α多樣性和β多樣性分析

對所有胃黏膜樣本的微生物16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行測序，經(jīng)過DNA提取、拼接、去除嵌合體后，共收集到3 885 201條有效序列，平均每個樣本為35 002條(28 787～38 753條)，有效序列的平均讀長為416 bp(404～424 bp)。首先對兩組標(biāo)本的α多樣性和β多樣性進(jìn)行比較(圖1)，其中反映微生物α多樣性的Shannon指數(shù)(圖1A)在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 71)，Simpson指數(shù)(圖1B)在兩組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 33)，提示在有H.pylori感染家族史的兒童中，非感染組胃部菌群的α多樣性顯著高于感染組，即非感染組胃部菌群的多樣性和菌群的均一度要高于H.pylori感染組。進(jìn)一步對兩組標(biāo)本間的β多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，通過基于加權(quán)UniFrac的Anosim分析比較樣本之間微生物群落構(gòu)成的相似性(圖1C)，發(fā)現(xiàn)兩組之間β多樣性差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)，提示兩組之間胃部菌群的構(gòu)成也有所不同。以上結(jié)果表明，有H.pylori感染家族史的兒童中，H.pylori非感染組和H.pylori感染組患兒胃部菌群的豐度和構(gòu)成存在顯著差異。

2.2 優(yōu)勢物種豐度比較

根據(jù)測序結(jié)果，選取每個樣本在微生物門水平(圖2A)和屬水平(圖2B)排名前20的物種，生成物種相對豐度的累加圖(圖2)，結(jié)果如表1所示。

A,phylum level;B,genus level.圖2 家族史陽性的H. pylori感染組和非感染組物種相對豐度比較Figure 2 Profiling histogram of H. pylori positive and negative group with family history at different classification levels

表1 家族史陽性的H. pylori感染組和非感染組菌群豐度情況Table 1 Microbiota abundance of H. pylori positive and negative group with family history

2.3 組間物種差異分析

兩組間菌群的構(gòu)成有所差異，進(jìn)一步對差異菌群進(jìn)行分析。采用LEfSe分析法找出各組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的生物標(biāo)識，首先繪制進(jìn)化分支圖(圖3A)，從圖中可以觀察到不同組別中起重要作用的菌群，然后將LDA值設(shè)置為2.0，繪制LDA值柱狀圖(圖3B)，在家族史陽性的H.pylori感染組中，H.pylori、空腸彎曲菌(Campylobacter)等物種相對豐度升高，而在H.pylori非感染組中，門水平的厚壁菌門(Firmicutes)，綱和目水平的梭狀芽孢桿菌(Clostridiales)和屬水平的擬桿菌(Bacteroidetes)等的相對豐度顯著升高。

A,cladogram for bacterial abundance.Nodes of different colors represent the microbiome that plays an important role in the group.Yellow nodes represent the non-important microbiome.B,histogram of the linear discriminant analysis(LDA)scores computed for differentially abundant bacterial taxa until class level.N-FH,H. pylori negative with family history;P-FH,H. pylori positive with family history.圖3 家族史陽性的H. pylori感染組和非感染組的差異菌群分析Figure 3 Differential microbiota analysis of H. pylori positive and negative group with family history

2.4 菌群功能預(yù)測

利用基于16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)的PICRUSt方法對兩組間胃黏膜微生物群的功能進(jìn)行預(yù)測，H.pylori非感染組的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物代謝等功能基因更為明顯(圖4A)，此外，通過關(guān)聯(lián)差異菌群和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路的影響，可見擬桿菌(Bacteroides)與一些氨基酸和維生素代謝、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路、安沙霉素(ansamycin)的合成相關(guān)的通路均呈顯著正相關(guān)(圖4B)。

A,histogram of the linear discriminant analysis(LDA)scores for divergent gene functions between H. pylori positive and negative patients.B,correlations among metabolic pathways and various microbial taxa.The labels along the top of the figure outline the predicted metabolic pathways.Labels on the left show the different species.The bar on the right shows correlations,with red indicating a positive correlation and blue indicating a negative correlation.N-FH,H. pylori negative with family history;P-FH,H. pylori positive with family history.MAPK,mitogen-activated protein kinase;mTOR,mammalian target of rapamycin.圖4 家族史陽性的H. pylori感染組和非感染組的菌群功能分析Figure 4 Function analysis of H. pylori positive and negative group with family history

3 討論

H.pylori感染與兒童慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病的發(fā)生有著十分密切的關(guān)系[7]。盡管關(guān)于H.pylori感染的傳播方式目前尚無定論，但流行病學(xué)研究顯示，兒童H.pylori感染呈現(xiàn)明顯的家庭內(nèi)聚集現(xiàn)象，說明H.pylori家庭內(nèi)傳播是兒童感染H.pylori的一個重要方式。然而在臨床實(shí)踐中，我們發(fā)現(xiàn)并非每一位有明確H.pylori家族史的兒童都發(fā)生H.pylori感染，本研究基于細(xì)菌16S rDNA測序，從兒童胃部菌群方面對有H.pylori家族史的感染情況不同的兒童進(jìn)行了比較。

本研究結(jié)果顯示，在有家族成員明確H.pylori感染病史的情況下，H.pylori感染組和非感染組兒童的胃部菌群α和β多樣性都存在明顯差異，即兩者的菌群豐度和構(gòu)成都各不相同，這與之前Llorca等[8]和彭賢慧等[9]的研究結(jié)果類似，但上述研究的對象主要集中在成人，且并未進(jìn)一步對有無家族史進(jìn)行分類分析。Bik等[10]對23名成人的胃黏膜菌群進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染組和非感染組的菌群構(gòu)成無明顯差異，這可能與不同研究所用檢測方法不同以及不同地域人群菌群構(gòu)成不同有關(guān)。本研究進(jìn)一步對兩組樣本的差異物種進(jìn)行LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，在H.pylori非感染組中，屬水平的擬桿菌、綱和目水平的梭狀芽孢桿菌等處于明顯優(yōu)勢地位，即這些菌群在有家族史的H.pylori陰性兒童胃部菌群中與H.pylori陽性兒童相比存在差異。

關(guān)于H.pylori感染與胃部菌群紊亂的關(guān)系，目前同樣尚無定論。有研究顯示，H.pylori可能會通過改變周圍環(huán)境的pH值、釋放尿素酶、破壞黏液層等方式對胃部其他菌群造成直接或間接的影響[11]。也有觀點(diǎn)認(rèn)為，胃部的其他菌群也會對H.pylori的感染、定植等產(chǎn)生影響，如Delgado等[12]分離了10株不同的乳酸桿菌(Lactobacillusspp.)，發(fā)現(xiàn)某些種屬的乳酸桿菌具有拮抗和消滅H.pylori的作用；Ascencio等[13]的研究表明，一些藍(lán)桿藻菌屬(Cyanothecespp.)的胞外多糖可以抑制H.pylori對胃上皮細(xì)胞的附著。

結(jié)合本研究結(jié)果我們推測，有些兒童之所以能夠在有H.pylori感染的家庭中自己未發(fā)生感染，胃部菌群可能在其中也發(fā)揮了作用，如差異菌群擬桿菌就可能與H.pylori感染之間存在關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌的莢膜多糖可以通過激活人體CD4+T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-10，從而抑制腸道的炎癥性疾病[14]。

本研究進(jìn)一步對兩組間的差異菌群進(jìn)行了功能預(yù)測分析，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，差異菌群中的擬桿菌屬在許多方面都發(fā)揮了重要作用：(1)擬桿菌可以增加組氨酸、酪氨酸、維生素B1和維生素B6代謝，而組氨酸和維生素是H.pylori生長、繁衍的必須營養(yǎng)物質(zhì)[15]，酪氨酸的磷酸化信號途徑對于H.pylori粘附于胃上皮有重要的作用[16]；(2)擬桿菌在MAPK和mTOR信號通路上有正向作用，這些信號通路可以激活人體產(chǎn)生免疫細(xì)胞因子，抵抗H.pylori的入侵[17-18]；(3)擬桿菌可以促進(jìn)合成安沙霉素，這是一類重要的抗生素，其代表成員利福平(rifampicin)可能更為大家所熟知，而這類合成的化合物可以直接殺傷H.pylori。當(dāng)然，還需要更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來支持上述這些結(jié)論。

本研究也存在一些不足，如研究入組的樣本量尚少，需要更大的樣本量和更多中心的研究來證明研究的結(jié)論；本研究為橫斷面研究，若能夠?qū)颊甙l(fā)病前后多點(diǎn)進(jìn)行采樣研究菌群的變化，結(jié)果會更有說服力；另外，若想進(jìn)一步說明菌群之間的因果關(guān)系，還需進(jìn)行無菌動物和相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來提供更客觀的證據(jù)。

綜上所述，有H.pylori感染家族史的兒童中，發(fā)生H.pylori感染和未發(fā)生H.pylori感染的患兒胃部菌群有明顯差異，一些胃部菌群(如擬桿菌)可能與H.pylori感染存在關(guān)聯(lián)。探究兒童胃部微生態(tài)系統(tǒng)可能為進(jìn)一步了解H.pylori感染的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，也可能為兒童H.pylori感染的微生態(tài)治療及預(yù)防提供新的思路。