●宿 放 信吉閣 董 俊 楊云慶 葉玲玲 羅倩敏 李瑤瑤 董仙蘭 王修庚 韓佃剛，※※ 艾 軍※※

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南 昆明 650201；2.昆明海關(guān)技術(shù)中心 云南 昆明 650200；3.梁山縣扶貧開(kāi)發(fā)辦公室 山東 濟(jì)寧 272600）

口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要感染豬、牛、羊、駱駝等偶蹄動(dòng)物[1]。口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，可通過(guò)呼吸道、消化道、生殖道和傷口感染易感動(dòng)物，通常以直接和間接接觸傳播，也可通過(guò)人、蜱、蠅、鳥(niǎo)等動(dòng)物傳播，在有風(fēng)的情況下還能遠(yuǎn)距離傳播。感染動(dòng)物的唾液、淚液、尿液、糞便、乳汁、精液、肉產(chǎn)品及副產(chǎn)品等均可攜帶病毒[2]。動(dòng)物感染口蹄疫病毒后幾乎100%發(fā)病[3]，表現(xiàn)為口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰性疹，潰爛后可引起部位病變，同時(shí)伴隨發(fā)熱、厭食、寒戰(zhàn)、磨牙、流口水、跛行、跺腳或踢腳、泌乳量減少等癥狀，死后剖檢可見(jiàn)“虎斑心”。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，我國(guó)也將其歸為一類(lèi)動(dòng)物疫病[4]。

目前已知口蹄疫在世界范圍內(nèi)有7個(gè)主要的血清型：O、A、AsiaⅠ、C、SAT-1、SAT-2和SAT-3型[5]，且各血清型之間無(wú)交叉免疫保護(hù)反應(yīng)，這就意味著在進(jìn)行免疫防控時(shí)相當(dāng)于面對(duì)7種不同的疫病[6]。由于口蹄疫傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響[7]。我國(guó)近年來(lái)暴發(fā)的口蹄疫主要由O型、A型和AsiaⅠ型病毒引起，嚴(yán)重威脅全國(guó)各地區(qū)家畜安全和畜產(chǎn)品貿(mào)易[8]。

因此，選擇合適的口蹄疫檢測(cè)方法對(duì)深入開(kāi)展我國(guó)口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查與防控研究均具有重要意義。本文結(jié)合OIE手冊(cè)和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18935-2018）對(duì)目前主要的13種口蹄疫檢測(cè)方法進(jìn)行歸納，以期為實(shí)際檢測(cè)篩選出最適檢測(cè)方法提供參考。

1 檢測(cè)抗原

1.1 病毒分離鑒定

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒分離鑒定病毒分離鑒定是口蹄疫病毒診斷最可靠的辦法，通常使用豚鼠腎、倉(cāng)鼠腎、豬腎、牛腎、牛舌上皮等原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞，使病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，根據(jù)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）來(lái)進(jìn)行分離鑒定。

1.1.2 病毒VP1基因序列分析FMDV蛋白在蛋白酶水解后，裂解為4種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4）和多種非結(jié)構(gòu)蛋白。VP1蛋白是主要的保護(hù)性抗原，由于VP1基因變異最頻繁，因此其抗原性差異是進(jìn)行FMDV血清型的劃分依據(jù)。獲得的病毒VP1序列后與已公布的序列進(jìn)行比對(duì)分析，便可確定病毒的血清型及其亞型。

李琪等[11]對(duì)廣東地區(qū)2015～2016年收集的豬病料提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后利用O、A和AsiaⅠ型的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆測(cè)序后將測(cè)序結(jié)果利用分析軟件進(jìn)行比對(duì)，分析確認(rèn)了其中有11株O型FMDV屬于耿馬譜系且發(fā)生了變異。石慶偉等[12]同樣利用對(duì)VP1基因序列分析的方法，確定了從廣東采集5份疑似FMDV感染病料中的2份為O型FMDV感染，3份為A型FMDV感染。整個(gè)過(guò)程比較繁瑣，結(jié)果可靠性較病毒分離試驗(yàn)差，但只要確?？寺『骎P1序列的完整性，也可得到一個(gè)較可靠的結(jié)果。

1.2 病毒核酸檢測(cè)

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過(guò)將FMDV各血清型全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，可針對(duì)不同血清型差異較大的結(jié)構(gòu)蛋白基因設(shè)計(jì)不同的引物，再根據(jù)熒光素的發(fā)光原理，利用TaqMan等技術(shù)，通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行血清型鑒別診斷。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種常用的檢測(cè)病毒樣本的方法，結(jié)果可直接通過(guò)熒光PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。李世芳等[13]用口蹄疫病毒MYA/98株對(duì)3～4日齡的乳鼠進(jìn)行攻毒，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)攻毒后0、5、10、15 h腸道組織中IFN-ε相對(duì)表達(dá)量的變化，為Ⅰ型干擾素的不同亞型在抗口蹄疫病毒感染過(guò)程中的作用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。蔡順萍等[14]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法用3種口蹄疫試劑盒檢測(cè)了O型抗原并進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的比對(duì)，為實(shí)驗(yàn)室選擇試劑盒提供依據(jù)。

1.2.2 多重?zé)晒舛縋CR多重?zé)晒舛縋CR在熒光定量PCR的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)多個(gè)探針和引物，可在一次PCR反應(yīng)中同時(shí)對(duì)多個(gè)模板進(jìn)行定量檢測(cè)。

吳紹強(qiáng)等[15]利用多重?zé)晒舛縋CR法研發(fā)出的口蹄疫病毒試劑盒，可同時(shí)檢測(cè)O、A和AsiaⅠ型的口蹄疫病毒。多重PCR檢測(cè)方法可同時(shí)檢測(cè)同種病毒的不同血清型，也可以用于不同病毒的同時(shí)檢測(cè)。宋爽等[16]根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒的5′ UTR基因、牛傳染性支氣管炎病毒的gB基因和口蹄疫病毒的3D基因建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高的多重?zé)晒舛縋CR的方法，可同時(shí)快速鑒別檢測(cè)這3種病毒。

1.2.3 定型RT-PCR定型RT-PCR同其他PCR方法一樣，避免了病毒分離培養(yǎng)的危險(xiǎn)性和基因序列分析的繁瑣性。與多重PCR方法類(lèi)似，能同時(shí)檢測(cè)幾種不同的血清型，李金海等[17]根據(jù)我國(guó)主要流行的3種血清型及其主要亞型設(shè)計(jì)了2對(duì)引物（FW1/FW2、FN1/FN2），建立了能夠同時(shí)特異性檢測(cè)O型、A型及AsiaⅠ型FMDV VP1全基因的RT-nPCR方法，并結(jié)合測(cè)序技術(shù)，能對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定型，且靈敏度高，特異性強(qiáng)。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）作為一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，可在65℃恒溫條件下完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要熱變性、電泳和紫外觀(guān)察等過(guò)程，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度或通過(guò)沉淀反應(yīng)濁度儀檢測(cè)焦磷酸鎂的沉淀濁度來(lái)進(jìn)行定量分析，也可通過(guò)肉眼觀(guān)察顏色變化進(jìn)行定性分析，在實(shí)驗(yàn)室可用該方法替代PCR方法做初步檢測(cè)。

袁彩虹[18]根據(jù)O、A和AsiaⅠ型3種血清型FMDV全基因組序列建立了一種FMDV通用型RT-LAMP快速檢測(cè)方法。李健等[19]以FMDV多聚蛋白基因建立了FMDV的RT-LAMP。與PCR方法相比該方法更快速，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程大約在1 h內(nèi)完成，可直接用肉眼觀(guān)察結(jié)果。該檢測(cè)體系具有極高的特異性，與其他類(lèi)似病毒如豬細(xì)小病毒、豬水泡病病毒、豬瘟病毒等無(wú)交叉反應(yīng)，比普通PCR和熒光PCR的靈敏性高。謝佳芮等[20]根據(jù)口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型的3D基因序列，設(shè)計(jì)17套環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，建立了免開(kāi)蓋可視化判定檢測(cè)結(jié)果的FMDV群特異性RT-LAMP技術(shù)。免開(kāi)蓋是指避免空氣中氣溶膠的污染影響肉眼觀(guān)察到的結(jié)果。

發(fā)揮地緣優(yōu)勢(shì)，大力發(fā)展旅游產(chǎn)業(yè)。農(nóng)場(chǎng)有限公司將重點(diǎn)打造“濕地+果蔬采摘+草原旅游”模式，將原生態(tài)濕地打造成“觀(guān)景+野生動(dòng)植物科教”旅游基地；將濕地邊緣的草原打造成“達(dá)斡爾族+蒙古族”民俗風(fēng)情旅游基地；將蔬菜產(chǎn)業(yè)園區(qū)打造成輻射齊市、內(nèi)蒙古阿榮旗的瓜、果、菜生產(chǎn)銷(xiāo)售基地以及休閑采摘度假于一體的旅游基地。農(nóng)場(chǎng)有限公司將逐步完善旅游基地的道路、供電、供水、停車(chē)場(chǎng)、觀(guān)景臺(tái)、游客接待中心等配套設(shè)施。力爭(zhēng)打造成為以休閑、度假旅游為特色的旅游小城鎮(zhèn)，推動(dòng)哈拉海旅游業(yè)從無(wú)到有、從接待型向產(chǎn)業(yè)經(jīng)營(yíng)型轉(zhuǎn)變，讓旅游業(yè)盡快成為新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。

1.2.5 基因芯片技術(shù)基因芯片又稱(chēng)DNA微陣列，結(jié)合了基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)芯片上的雜交信號(hào)強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析，具有高通量、高集成、微型化和自動(dòng)化的特點(diǎn)。

作為較新的檢測(cè)技術(shù)，近年來(lái)基因芯片被廣泛應(yīng)用與優(yōu)化，更高效、更穩(wěn)定。魏春霞等[21]根據(jù)已知的7種牛易感病原核酸序列，利用多重PCR方法，通過(guò)肉眼觀(guān)察芯片顯色程度后，對(duì)芯片技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)的基因芯片檢測(cè)方法。該方法可在3 h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)牛7種病原（Bru、MTB、Anthrax、FMDV、BVDV、BPIV3和IBRV）間無(wú)交叉反應(yīng)，所有芯片可重復(fù)使用，且芯片在2～8℃條件下能保存半年以上，可滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)室的樣品檢測(cè)及流行病學(xué)監(jiān)查，同時(shí)重復(fù)使用也可降低成本。劉志鵬等[22]建立了可鑒定和區(qū)分口蹄疫病毒 O、A和AsiaⅠ型3種血清型的分型芯片，靈敏度比常規(guī)PCR高10～100倍，特異性也較高，芯片可重復(fù)使用，保存3個(gè)月以上。

2 檢測(cè)抗體

2.1 間接ELISA

間接ELISA是實(shí)驗(yàn)室最常用的抗體檢測(cè)方法之一，間接ELISA應(yīng)用于各種病毒的檢測(cè)，其原理是通過(guò)利用酶標(biāo)二抗去辨識(shí)一抗來(lái)測(cè)定抗原量。各類(lèi)ELISA方法均避免了病毒分離試驗(yàn)的危險(xiǎn)性，也避免如PCR試驗(yàn)等無(wú)菌環(huán)境的限約。

前期研究中有對(duì)口蹄疫病毒的檢測(cè)和疫苗的研制的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。宋妮[23]利用原核表達(dá)后純化的SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3及VP3蛋白建立了間接ELISA方法，為O型口蹄疫診斷試劑及基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。王云龍等[24]將O型口蹄疫病毒VP1基因在表達(dá)載體pET-41b中表達(dá)，最終建立了O型口蹄疫病毒的檢測(cè)方法。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA

競(jìng)爭(zhēng)ELISA也是常用的抗體檢測(cè)方法之一，其原理是將抗體固定于載體表面，一組加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原混合液，另一組只加酶標(biāo)抗原，通過(guò)兩組底物降解量之差來(lái)測(cè)定待測(cè)抗原的含量。

楊志元等[25-26]以經(jīng)原核表達(dá)、純化及組裝制備的O型FMDV病毒樣顆粒為診斷抗原，HRPIgG為競(jìng)爭(zhēng)性酶標(biāo)抗體成功建立用于O型FMDV抗體檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，可實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速檢測(cè)。同時(shí)驗(yàn)證了優(yōu)化后的檢測(cè)方法，改良了傳統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，因洗滌次數(shù)過(guò)多，影響樣品的檢出速率的缺點(diǎn)[27]。

2.3 病毒中和試驗(yàn)（VNT）

VNT是檢測(cè)FMD的黃金標(biāo)準(zhǔn)，是最權(quán)威、最經(jīng)典的方法，常作為其他方法的參照。VNT是利用血清中和抗體與病毒的特異性中和作用為原理建立的。

廖德芳等[28]利用VNT來(lái)評(píng)價(jià)建立的口蹄疫固相競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（SPC-ELISA）方法與液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（LPB-ELISA）之間的差別，對(duì)采集的不同物種共94份血清樣品分別進(jìn)行O型口蹄疫病毒SPC-ELISA、LPB-ELISA和VNT檢測(cè)，并分別比較了3種方法的符合率和陽(yáng)性檢出率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPC-ELISA比LPBELISA更符合VNT的結(jié)果。

2.4 液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（LPB-ELISA）

由于其精確性、穩(wěn)定性高于正向間接血凝試驗(yàn)（PHA），且重復(fù)性?xún)?yōu)于VNT，因此液相阻斷ELISA技術(shù)成為國(guó)際較為認(rèn)可的一種標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)，我國(guó)目前也將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查和免疫[29-30]。王世杰等[31]對(duì)該方法進(jìn)行了改良，利用單一的血清稀釋倍數(shù)來(lái)替代繁復(fù)的倍比稀釋?zhuān)筁PB-ELISA的檢測(cè)通量提高了5倍左右。

2.5 固相競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（SPC-ELISA）

該方法的基本原理是被檢血清中的FMD抗體與定量的FMD豚鼠抗體血清競(jìng)爭(zhēng)，勝者與固相載體表面的抗原結(jié)合。被檢血清中FMD抗體量越多，結(jié)合在固相載體表面的豚鼠抗體越少，顯色后顏色就越淺。

在常規(guī)檢測(cè)中，SPC-ELISA可用來(lái)替代VNT，通過(guò)對(duì)該方法不斷地優(yōu)化，使其檢測(cè)結(jié)果更接近于VNT的檢測(cè)結(jié)果。謝慶閣[32]詳細(xì)介紹了SPC-ELISA的操作步驟；李敏杰等[33]以單抗3D9為捕獲抗體，以HRP標(biāo)記的單抗9A9作為檢測(cè)抗體，建立了基于單抗的A型口蹄疫抗體SPC-ELISA檢測(cè)方法；許智強(qiáng)等[34]以單抗3D9為捕獲抗體，以HRP標(biāo)記的單抗8E8作為檢測(cè)抗體，建立了優(yōu)化的固相ELISA檢測(cè)方法，此方法有較高敏感性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和特異性。與VNT和LPB-ELISA的相關(guān)性和符合率均較高，批內(nèi)和批間差異性小[35-36]。

2.6 非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（3ABC-ELISA）

FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）與病毒的復(fù)制和裝配相關(guān)。非結(jié)構(gòu)蛋白抗體試驗(yàn)用于區(qū)分人工免疫的動(dòng)物和感染野毒的動(dòng)物。其鑒別診斷的依據(jù)是：滅活疫苗免疫動(dòng)物后，動(dòng)物體內(nèi)不會(huì)有病毒增殖，也就沒(méi)有病毒特異性NSP表達(dá)。而感染野毒的動(dòng)物體內(nèi)則有病毒增殖，病毒刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生了相應(yīng)的NSP抗體。因此，可通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)是否產(chǎn)生NSP抗體來(lái)區(qū)分感染野毒的動(dòng)物與人工接種疫苗的動(dòng)物[37]。該方法在最新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中替代了抗原瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（VIAAGID）。

王玉玲等[38]利用150份牛血清對(duì)國(guó)內(nèi)外3種口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測(cè)方法和1種口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明該方法敏感性達(dá)到100%，特異性也接近100%，說(shuō)明該方法具有很高的敏感性和特異性，可用于口蹄疫病毒感染與疫苗免疫抗體的鑒別診斷。

3 FMDV的檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)

文中列舉的13種檢測(cè)FMDV的方法具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，詳見(jiàn)表1。

表1 13種FMDV檢測(cè)方法比較

綜上，可以根據(jù)具體檢測(cè)條件和檢測(cè)要求來(lái)選擇合適的檢測(cè)方法，得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，方便高效地開(kāi)展口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查和疫病防控。