王 雪，王盛昊，于 冰

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

自然界中，植物通常會(huì)遭受各種逆境脅迫，對(duì)其生長及發(fā)育造成非常不利的影響，甚至?xí)鹬参锼劳觥Ｖ参锏哪婢趁{迫主要包括生物脅迫和非生物脅迫兩大類，前者主要是由細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲等引起的病蟲災(zāi)害，后者則主要包括干旱、高鹽、低溫、重金屬和機(jī)械損傷等[1]。在長期進(jìn)化過程中，植物形成了一系列防御機(jī)制，如ROS清除系統(tǒng)、SOS途徑等；不同途徑中各基因有著不同的調(diào)控能力，而基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控在植物應(yīng)答逆境脅迫的防御途徑中起重要調(diào)節(jié)作用[2-3]。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)通過與各種生物及非生物脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件相互作用，調(diào)控下游逆境脅迫應(yīng)答靶基因的表達(dá)參與防御反應(yīng)，促使植物在分子、生理生化等水平做出調(diào)節(jié)以適應(yīng)各種逆境[4]。因此開展轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因啟動(dòng)子應(yīng)答逆境脅迫的研究對(duì)揭示植物應(yīng)答逆境脅迫分子機(jī)制十分必要。

近年來，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的研究技術(shù)在植物逆境基因表達(dá)調(diào)控方面的應(yīng)用研究備受關(guān)注。通過酵母單雜交技術(shù)(Yeast one-hybrid system，Y1H)和ChIP(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)鑒定到怪柳中ThHSFA1啟動(dòng)子通過直接調(diào)節(jié)ThWRKY4來調(diào)節(jié)活性氧清除，從而賦予植物鹽脅迫耐受性[5]。通過凝膠阻滯分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)鑒定到蘋果中MdMYB108L通過與MdCBF3啟動(dòng)子結(jié)合從而增強(qiáng)蘋果的耐冷性[6]。隨著對(duì)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用研究愈加深入，其分析技術(shù)也不斷地改良，但對(duì)于各分析技術(shù)的針對(duì)性以及分析技術(shù)結(jié)合使用的互補(bǔ)性還沒有具體論述。本文介紹了4種轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作分析技術(shù)，包括染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)、DNase I足跡法(DNase I footprinting)、凝膠阻滯分析和酵母單雜交技術(shù)，重點(diǎn)介紹了轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作分析技術(shù)在植物應(yīng)答逆境脅迫中的研究進(jìn)展、各分析技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)、偏好性以及聯(lián)合使用的互補(bǔ)性等特點(diǎn)，為全面、深入開展植物逆境脅迫條件下轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控分子機(jī)理研究奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 參與逆境脅迫的主要轉(zhuǎn)錄因子家族

近年來，轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、植物體內(nèi)次生物質(zhì)的代謝以及逆境脅迫調(diào)控等多種生理過程中扮演的角色不斷被揭開[7]，轉(zhuǎn)錄因子的研究成為植物應(yīng)答逆境脅迫分子機(jī)制中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。NAC、WRKY、bHLH(basic helix-loop-helix protein)、AP2/ERF以及MYB等轉(zhuǎn)錄因子作為植物中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長發(fā)育及逆境脅迫調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的特異性轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其名字是根據(jù)矮牽牛(Petunia hybrid)中NAM基因、擬南芥(Arabidopsis thaliana)中ATAF1/2和CUC基因的首字母命名[8-9]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，如參與分生組織的細(xì)胞分裂、側(cè)根生長、開花、衰老等過程；在植物響應(yīng)低溫、干旱及鹽堿等非生物脅迫的過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用[8,10-11]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族具有十分顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，各成員均含有1～2個(gè)由60個(gè)高度保守的氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域[12]，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族名稱也是由此得來。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛地參與植物的生物、非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，在植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起調(diào)控作用，在糖類合成、種子休眠、植物衰老等一系列生理活動(dòng)中也參與調(diào)控[13-14]。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物中存在最廣泛的一大類轉(zhuǎn)錄因子，因含有bHLH結(jié)構(gòu)域而得名[15-16]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物中的信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫應(yīng)答、種子萌發(fā)、細(xì)胞分化等過程發(fā)揮重要作用[17-19]。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中普遍存在的一類轉(zhuǎn)錄因子超家族[20]；作為一類廣泛參與植物生命活動(dòng)過程的轉(zhuǎn)錄因子，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子不僅與種子萌發(fā)有關(guān)，還參與了植物的初生代謝以及次生代謝；AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子作為連接植物激素信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，可以反饋調(diào)節(jié)激素的生物合成，如乙烯、細(xì)胞分裂素、赤霉素和脫落酸，同時(shí)也能響應(yīng)生長素、茉莉酸甲酯等激素信號(hào)；一些AP2/ERF基因異源表達(dá)可以提高植物體應(yīng)對(duì)脅迫的能力，包括抵抗高鹽、干旱、缺氧及低溫脅迫等[21-24]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是存在于所有真核生物中的一類十分保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，由位于N端的MYB結(jié)構(gòu)域得名[25-26]。植物中MYB轉(zhuǎn)錄因子幾乎參與了多個(gè)發(fā)育過程，如根毛發(fā)育、花粉形成、種子萌發(fā)等方面；在植物遭受冷脅迫、糖脅迫、金屬脅迫等非生物脅迫時(shí)，MYB轉(zhuǎn)錄因子參與其中并進(jìn)行調(diào)節(jié)；MYB轉(zhuǎn)錄因子在泛素化、糖基化、磷酸化等蛋白翻譯后修飾調(diào)控方面，也起著至關(guān)重要的作用[26-28]。

2 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性鑒定

轉(zhuǎn)錄因子一般都具有DNA結(jié)合域(DNA-binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控域(activation domain，AD)兩個(gè)區(qū)域，前者靠近羧基端（C端），決定和DNA順式作用元件結(jié)合的特異性；后者可與RNA聚合酶Ⅱ相互作用，提高RNA聚合酶Ⅱ的活性；BD和AD可以完全獨(dú)立的發(fā)揮作用[29]。轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性一般通過酵母系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，單獨(dú)的BD可以與GAL4的上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結(jié)合；將轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建到含有BD的載體上，若該轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性，其表達(dá)產(chǎn)生的BD就會(huì)與UAS相結(jié)合，引起下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。通常要構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入酵母中，在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上觀察菌落的生長情況，并在X-α-gal染色下觀察菌落是否變藍(lán)確定轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。Liang等[30]將青杄(Picea wilsonii Mast.)PwNAC30轉(zhuǎn)錄因子分為全長、C端和N端進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)，結(jié)果顯示只有PwNAC30轉(zhuǎn)錄因子C端能夠在三缺培養(yǎng)基(SD/-Trp-His-Ade)上生長，并且在 X-α-gal染色下變藍(lán)，表明PwNAC30轉(zhuǎn)錄因子的C端具有轉(zhuǎn)錄激活活性，而PwNAC30轉(zhuǎn)錄因子的全長和N端沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。

在植物應(yīng)答逆境中，具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子，不僅能與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，還能通過調(diào)節(jié)組蛋白修飾水平變化，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。在毛果楊(Populus trichocarpa)干旱脅迫條件下，PtrAREB1-2轉(zhuǎn)錄因子、PtrGCN5-1、PtrADA2b-3兩兩互作的關(guān)系使得三者間可以形成蛋白三聚體，共同實(shí)現(xiàn)對(duì)下游含有ABRE元件的干旱脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這種蛋白三聚體的形成使PtrAREB1-2轉(zhuǎn)錄因子將組蛋白乙酰化酶復(fù)合體招募到下游干旱脅迫響應(yīng)基因的ABRE元件上，從而增加組蛋白H3的第9位賴氨酸K上的乙?；健＿@種乙?；男揎検谷旧|(zhì)處于一個(gè)更加開放松散的狀態(tài)，允許更多的RNA聚合酶II進(jìn)入，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄[31]。

3 轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作分析技術(shù)

轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作分析技術(shù)本質(zhì)上是研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。主要包括染色質(zhì)免疫共沉 淀 技術(shù) (Chromatin immunoprecipitation，ChIP)、DNase I足跡法(DNase I footprinting)、凝膠阻滯分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)和酵母單雜交技術(shù)。這幾種方法都有自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和不足，每種技術(shù)研究的側(cè)重點(diǎn)也不同，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選擇更為合適的分析技術(shù)才能有效的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子相互作用研究。

3.1 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)

ChIP技術(shù)由Orlando等[32]于1997年開始應(yīng)用，是利用甲醛使活細(xì)胞內(nèi)的染色體和蛋白質(zhì)通過希弗(Scihff)鍵交聯(lián)在一起，通過超聲波將細(xì)胞進(jìn)行破碎，然后利用目的蛋白的特異性抗體將交聯(lián)后的復(fù)合物進(jìn)行富集，最后將在低PH的條件下得到單一的DNA片段[33]，如圖1所示。ChIP技術(shù)除了可以在體內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的相互作用，真實(shí)地反映兩者結(jié)合的狀況[34-35]。

圖1 ChIP技術(shù)原理圖

ChIP-seq技術(shù)是在ChIP技術(shù)的基礎(chǔ)上，與第二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合發(fā)展起來的技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與轉(zhuǎn)錄因子互作的DNA區(qū)段[37]。一個(gè)ChIP-seq可以輸出上千個(gè)峰值，每一個(gè)峰值的位置都反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子同DNA片段所結(jié)合的位置。ChIP-seq技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)全基因序列的分析，所需要的樣品量小，其數(shù)據(jù)分析后得到的DNA序列能夠精確到10～30 bp，具有較高的敏感性[38]。但目前ChIP-seq技術(shù)還不能同時(shí)獲得多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)同一啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)的信息。

ChIP-qPCR技術(shù)是利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ChIP樣品的常用手段。ChIP-qPCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在候選靶基因啟動(dòng)子上找到與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的直接證據(jù)，是細(xì)胞內(nèi)真實(shí)、原位的結(jié)果[39-40]。

ChIP技術(shù)是在體內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子相互作用的技術(shù)，通常在已知特定轉(zhuǎn)錄因子蛋白的情況下，鑒定與已知轉(zhuǎn)錄因子互作的靶基因啟動(dòng)子。能在基因組水平上大規(guī)模檢測(cè)已知轉(zhuǎn)錄因子和靶基因啟動(dòng)子的動(dòng)態(tài)結(jié)合，與體外實(shí)驗(yàn)相比更具有說服力，但不能準(zhǔn)確地的定位到轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)。

3.2 DNase I足跡法(DNase I footprinting)

DNase I足跡法于1978年應(yīng)用于科研領(lǐng)域[41]，通過使用DNase I切割單鏈末端有放射性標(biāo)記的待測(cè)雙鏈DNA，在進(jìn)行電泳時(shí)，DNA與蛋白結(jié)合位點(diǎn)受到蛋白的保護(hù)，不發(fā)生斷裂，形成空白區(qū)域，即代表目標(biāo)蛋白與DNA結(jié)合的區(qū)域[42-43]。DNase I足跡法可以精確地判斷蛋白質(zhì)與DNA片段的結(jié)合位點(diǎn)，精確到單堿基水平。但在實(shí)驗(yàn)過程中涉及到的操作方法較為復(fù)雜，因此在其基礎(chǔ)上發(fā)展了固相DNase I足跡法。固相DNase I足跡法省略了原有方法中蛋白純化等步驟，并采用生物素進(jìn)行標(biāo)記，避免放射性元素的使用，減少危害[44]。目前還出現(xiàn)了自由羥基足跡實(shí)驗(yàn)、菲咯啉銅足跡實(shí)驗(yàn)及硫酸二甲酯(DMS)足跡實(shí)驗(yàn)等改良版實(shí)驗(yàn)，其中DMS足跡實(shí)驗(yàn)切割鳥嘌呤(G)殘基，可以鑒定到轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的特異堿基[45]。

DNase I足跡法是在體外研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子相互作用的技術(shù)，用于進(jìn)行啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子一對(duì)一互作驗(yàn)證。DNase I足跡法與ChIP相比可以更為精確的鑒定轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子序列的結(jié)合位點(diǎn)，能夠精確到單堿基水平。

3.3 凝膠阻滯分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)

EMSA又稱電泳遷移率變動(dòng)分析，是根據(jù)不同分子量的物質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移速率不同而來的。根據(jù)基因啟動(dòng)子中的特定順式作用元件設(shè)計(jì)探針與轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合，由于分子量以及電荷發(fā)生變化，會(huì)比轉(zhuǎn)錄因子蛋白單獨(dú)在凝膠中遷移的速率慢上許多，于是便形成滯后的條帶，從而判斷蛋白質(zhì)與啟動(dòng)子特異元件的相互作用關(guān)系[46-47]。還可以通過滯后帶的有無和量的多少，來反映蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合活性，并可以計(jì)算出兩者的結(jié)合常數(shù)或解離常數(shù)[48]。傳統(tǒng)EMSA實(shí)驗(yàn)中探針常用同位素進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求較高，存在放射性污染。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，探針標(biāo)記也尋找到較為安全的替代物，如地高辛和生物素標(biāo)記[49]。同時(shí)在EMSA的基礎(chǔ)上又進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)展出特異性更高的超遷移率變動(dòng)分析以及分辨率更高的毛細(xì)管凝膠阻滯電泳。

EMSA法是在體外研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子相互作用的技術(shù)。一種情況用于啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子一對(duì)一互作驗(yàn)證，另一種情況用于研究某基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游一定范圍內(nèi)是否存在與潛在的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的順式作用元件。將研究目的基因啟動(dòng)子中的20～30 bp大小的順式作用元件設(shè)計(jì)為探針，將提取的細(xì)胞核蛋白與標(biāo)記的啟動(dòng)子探針之間進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，確定是否有特定的轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子中順式作用元件相結(jié)合。在探究轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的實(shí)驗(yàn)中EMSA常常與DNase I足跡法在體外結(jié)合使用，前者可以鑒定與啟動(dòng)子特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，后者可以進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合位置，并得到相應(yīng)的順式作用元件序列。

3.4 酵母單雜交技術(shù)(Yeast one-hybrid system，Y1H)

Y1H由Li J J和Herskowitz I從酵母雙雜交技術(shù)(Yeast two-hybrid system，Y2H)發(fā)展而來[50]，是在酵母體內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子之間相互作用的技術(shù)。Y1H是將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子(minimal promoter，Pmin)上游，并在下游連接報(bào)告基因。進(jìn)行cDNA融合表達(dá)文庫篩選時(shí)，編碼目的轉(zhuǎn)錄因子的cDNA融合表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母細(xì)胞后，其編碼產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄因子）與順式作用元件結(jié)合，就可以提高RNA聚合酶Ⅱ的活性，促使報(bào)告基因表達(dá)[51]，由此篩選出與已知順式作用元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，如圖2所示。Y1H操作簡單快捷，在酵母中表達(dá)的與啟動(dòng)子結(jié)合的真核生物蛋白可正確折疊和翻譯后修飾，具有天然的構(gòu)象，反映真實(shí)的體內(nèi)表達(dá)調(diào)控情況[53]。在實(shí)際操作中常出現(xiàn)假陰性和假陽性現(xiàn)象，因此假陽性較低的酵母單-雙雜交體系也由此衍生而來，該體系將酵母單雜交和雙雜交兩種體系的原理融合，又同時(shí)應(yīng)用DNA-蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的兩種相互作用篩選cDNA文庫[54]，降低試驗(yàn)中的假陽性，提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但必須已知DNA序列以及相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。

圖2 Y1H技術(shù)原理圖

Y1H技術(shù)是在體內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子相互作用的技術(shù)。在已知某基因啟動(dòng)子片段的情況下鑒定與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。用于在酵母體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作驗(yàn)證，可以真實(shí)的體現(xiàn)二者間的表達(dá)情況，既能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作的一對(duì)一鑒定，也可以利用cDNA文庫篩選與啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子，實(shí)現(xiàn)高通量篩選。

4 轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作分析技術(shù)在植物逆境脅迫中的應(yīng)用

4.1 ChIP技術(shù)在植物逆境脅迫中的應(yīng)用

ChIP技術(shù)在植物逆境脅迫中的應(yīng)用情況見表1。ChIP可以驗(yàn)證已知轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子間的相互作用，Qiu等[55]使用ChIP研究了辣椒(Capsicum annuum L.)感染青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)后的2個(gè)上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)候選轉(zhuǎn)錄因子CaWRKY40通過與CaC3H14基因啟動(dòng)子的相互作用，調(diào)節(jié)SA（水楊酸）和JA/ET（茉莉酸/乙烯）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間拮抗作用，增強(qiáng)了辣椒對(duì)青枯雷爾氏菌的防御反應(yīng)。ChIP與測(cè)序技術(shù)相結(jié)合可以對(duì)全基因組進(jìn)行分析，Li等[56]通過ChIPSeq分析干旱條件下過表達(dá)編碼轉(zhuǎn)錄因子OsSNAC1基因的水稻(Oryza sativaL.)中所有啟動(dòng)子定位的峰序列，推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子OsSNAC1結(jié)合靶基因啟動(dòng)子的NACRS和ABRE元件序列在植物中具有保守性。將ChIP-qPCR和其他分析技術(shù)相結(jié)合可以高效準(zhǔn)確的定位到轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子DNA的結(jié)合位點(diǎn)，Zhao等[57]通過ChIP-qPCR結(jié)合EMSA和Y1H發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY15通過直接與異氰酸酯合酶基因MdICS1啟動(dòng)子的W-box結(jié)合以激活其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)了SA的積累，從而激活了SA誘導(dǎo)的病原體相關(guān)基因，增強(qiáng)了對(duì)葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的抗性。Yang等[58]使用ChIP-qPCR及Y1H分析表明，在高溫條件下核桃(Juglans regiaL.)中JrDof3與JrGRAS2基因具有相似的表達(dá)模式，轉(zhuǎn)錄因子JrGRAS2特異性結(jié)合DOFCOREZM基序，從而調(diào)節(jié)靶基因JrDof3在高溫下的表達(dá)。

表1 CHIP在植物逆境脅迫中的應(yīng)用

4.2 DNase I足跡法在植物逆境脅迫中的應(yīng)用

DNase I足跡法可以在單堿基水平上定位到啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，為了研究小麥(Triticum aestivumL.)致病性真菌穎枯殼針孢(Parastagonospora nodorum)的效應(yīng)基因調(diào)控機(jī)制，Shao等[59]通過DNase I足跡實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)定位了小麥真菌穎枯殼針孢效應(yīng)基因Tox3轉(zhuǎn)錄所必需的啟動(dòng)子中的25 bp區(qū)域，為揭示小麥致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。Grec等[60]研究發(fā)現(xiàn)煙草(Nicotiana tabacumL.)中的NpABC1基因受到煙草葉片表面的抗真菌二萜類物質(zhì)香紫蘇醇的誘導(dǎo)表達(dá)，通過DNase I足跡法和EMSA結(jié)合分析，鑒定出NpABC1基因啟動(dòng)子的3個(gè)順式作用元件（SB1、SB2和SB3）在該基因響應(yīng)香紫蘇醇中發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用。

4.3 EMSA在植物逆境脅迫中的應(yīng)用

EMSA一般用于啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子的一對(duì)一互作驗(yàn)證中，Wang等[61]通過EMSA一對(duì)一驗(yàn)證蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdMYB108L與MdCBF3基因啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)二者的相互作用可從提高蘋果(Malus domestica(Suckow)Borkh.)耐寒性。Zhang等[62]應(yīng)用EMSA一對(duì)一驗(yàn)證了小麥轉(zhuǎn)錄因子TaWRKY40與干旱響應(yīng)基因TaGAPC1啟動(dòng)子的相互作用，表明二者通過ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑正調(diào)控TaGAPC1基因的表達(dá)水平，從而提高植物在干旱下的脅迫耐受性。EMSA還與其他技術(shù)結(jié)合使用定位啟動(dòng)子上與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的順式作用元件，常用于細(xì)胞核蛋白的驗(yàn)證中，Zheng等[63]通過EMSA和DNase I足跡法聯(lián)用，表明?；o酶結(jié)合蛋白編碼基因ACBP3的啟動(dòng)子與光處理的擬南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)的葉核蛋白相互作用并結(jié)合于該基因啟動(dòng)子的GT-1順式作用元件，而暗處理時(shí)葉核蛋白除了與ACBP3基因啟動(dòng)子的GT-1順式作用元件結(jié)合外，還與Dof-box順式作用元件結(jié)合，這表明了Dofbox和GT-1順式作用在介導(dǎo)ACBP3基因參與擬南芥晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)具有重要作用。由葡萄座腔菌引起的蘋果腐爛病是損害蘋果的重要疾病，Zhao等[64-65]通過EMSA及Y1H分析發(fā)現(xiàn)，蘋果在受到葡萄座腔菌侵染后，轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY31與MdHIR4基因啟動(dòng)子中的W-box2基序結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY15與MdICS1啟動(dòng)子相互作用，從而調(diào)節(jié)了蘋果的SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑，增強(qiáng)了果樹對(duì)葡萄座腔菌的抗性。Zhang等[66]使用EMSA及Y1H在小麥中鑒定到轉(zhuǎn)錄因子TaMYB與TaGAPCp2P/3P基因啟動(dòng)子的干旱響應(yīng)元件5'-AACTAAA/C-3'結(jié)合，可提高小麥的耐旱性。

4.4 Y1H在植物逆境脅迫中的應(yīng)用

Y1H技術(shù)在植物逆境脅迫中的應(yīng)用情況見表2。Hu等[67]為了探究miRNA在棉花(Gossypium hirsutumL.)黃萎病中發(fā)揮的功能，通過Y1H一對(duì)一驗(yàn)證了棉花轉(zhuǎn)錄因子GhNAC100與GhPR3基因啟動(dòng)子的相互作用，發(fā)現(xiàn)GhNAC100與GhPR3基因啟動(dòng)子的CGTA-box結(jié)合并抑制其表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控棉花的防御作用。

表2 Y1H在植物逆境脅迫中的應(yīng)用

Dong 等[68]對(duì)大豆(Glycine max(L.)Merr.)轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY31與GmSAGT1基因啟動(dòng)子進(jìn)行了Y1H一對(duì)一驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)二者通過W-box結(jié)合，從而調(diào)節(jié)GmSAGT1基因的表達(dá)參與SA介導(dǎo)的大豆免疫反應(yīng)。Yong等[69]通過Y1H一對(duì)一驗(yàn)證表明虎百合(Lilium lancifoliumL.)轉(zhuǎn)錄因子LlMYB3能夠結(jié)合LlCHS2基因的啟動(dòng)子，通過參與花青素的生物合成途徑，以調(diào)節(jié)虎百合在冷脅迫中的耐受性。Almeida等[70]通過Y1H技術(shù)在水稻cDNA文庫中以O(shè)sNHX1基因啟動(dòng)子為誘餌大規(guī)模篩選，鑒定到5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（3個(gè)家族）——轉(zhuǎn)錄因子OsPCF2（TCP家族），OsCPP5（CPP家族）和OsNIN-like2、OsNIN-like3、OsNIN-like4（NIN-like家族），這些轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)節(jié)水稻耐鹽和耐旱功能。

4 展望

本文介紹的轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作技術(shù)是目前較有代表性研究方法，在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用研究之前，首先通過轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的活性進(jìn)行驗(yàn)證，再進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的功能及下游調(diào)控基因進(jìn)行研究。但目前的幾種轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作技術(shù)還具有局限性：（1）ChIP技術(shù)在研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的相互作用時(shí)，只能通過已知轉(zhuǎn)錄因子的特異性抗體鑒定與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因啟動(dòng)子，不能從已知的啟動(dòng)子獲得與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白；而且轉(zhuǎn)錄因子可能間接地與染色質(zhì)結(jié)合。（2）EMSA不能反映轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子在體內(nèi)結(jié)合的真實(shí)狀況；對(duì)于低親和力結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子和DNA也很難識(shí)別。（3）DNase I活性所需的Mg2+和Ca2+會(huì)破壞轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子特異性的相互作用；DNase I足跡法的不足之處是只能進(jìn)行蛋白質(zhì)和DNA點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的相互結(jié)合研究，在進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作研究中受到限制。（4）Y1H中某些與DNA相互作用的轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)酵母本身有毒性；不能研究與內(nèi)源性酵母激活蛋白相互作用的DNA結(jié)合位點(diǎn)，因此在實(shí)驗(yàn)過程中假陽性比較高。每種技術(shù)都具有相應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)和局限性，具體研究時(shí)應(yīng)采用不同的實(shí)驗(yàn)方法組合進(jìn)行交叉驗(yàn)證，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展以及物理學(xué)、化學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的交叉合作，轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子互作技術(shù)的研究手段將不斷發(fā)展和完善，使植物應(yīng)答逆境脅迫下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究更深入。