劉 明，唐佳文，沙 爽，孟劍俠，程麗，李沖偉

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

α-亞麻酸(α-Linolenic acid，ALA)是人體神經(jīng)細(xì)胞[1-2]和大腦發(fā)育不可缺少的重要組成成分——二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的前體物質(zhì)[3]，具有保護(hù)心肌損傷、控制膽固醇水平，減輕非酒精脂肪肝癥狀等許多重要生理作用[4]，特別是DHA，俗稱“腦黃金”，是大腦和視神經(jīng)細(xì)胞的主要組成成分，能顯著提高嬰幼兒心理發(fā)育水平，對嬰幼兒神經(jīng)功能發(fā)育也有調(diào)節(jié)作用[5-6]。近幾年，隨著世界各國學(xué)者對α-亞麻酸研究的不斷深入，對α-亞麻酸純度和安全性提出了更高的要求，因此，獲取綠色天然高純度α-亞麻酸成為該研究領(lǐng)域的必然需求。

要獲得高純度α-亞麻酸，首先要把α-亞麻酸從植物中提取出來。目前，常用的提取方法有索氏抽提法[7-8]、冷榨法[9-10]、熱榨法[11-12]、超臨界 CO2萃取法[13-14]和水酶法[15-16]。這些提取方法各有利弊，通常根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的提取方法。尋找高效的α-亞麻酸純化方法一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)問題。Lee等[17]利用低溫尿素包合法從紫蘇油中純化α-亞麻酸，其最佳條件下α-亞麻酸純度為81.75%，但該法存在有機(jī)試劑殘留問題；Wang等[18]探究了尿素包合與β-環(huán)糊精的4種不同組合方法對蠶蛹油中α-亞麻酸的富集效果，結(jié)果表明尿素與β-環(huán)糊精的組合效果最佳，純度為67.4%；雍梁敏等[19]運(yùn)用冷凍結(jié)晶法從橡膠籽油中提取純化α-亞麻酸，含量為45.41%，純化效率較低；陳新新等[20]通過銀離子絡(luò)合萃取和尿素包合相耦合的方式從紫蘇油中提取純化α-亞麻酸，純度能達(dá)到99.08%，但偶合法對操作技術(shù)要求高，且生產(chǎn)成本消耗大。分子蒸餾技術(shù)是近十幾年發(fā)展起來的非均相系分離方法，可提取純化維生素E[21]、不飽和脂肪酸[22]、香精和香料[23]等易揮發(fā)或熱敏性物質(zhì)，脫除食品中的有害物質(zhì)，如：苯并芘、塑化劑以及不良風(fēng)味物質(zhì)[24-25]。至今尚未發(fā)現(xiàn)使用分子蒸餾技術(shù)純化紫蘇油α-亞麻酸的相關(guān)報道。本文通過油脂評價指標(biāo)篩選了紫蘇油α-亞麻酸的提取方法，考察蒸餾溫度、蒸餾壓力、刮板轉(zhuǎn)速和進(jìn)料速度4個因素對分子蒸餾技術(shù)純化α-亞麻酸效果的影響，從而探討分子蒸餾技術(shù)純化α-亞麻酸的可行性，為高純度α-亞麻酸的生產(chǎn)提供新的理論方法和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

紫蘇籽，購自黑龍江樺南農(nóng)盛園食品有限公司；α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京百奧萊博科技有限公司，純度≥98%，20 mg/支。試驗(yàn)在黑龍江大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)工程中心，于2019年4—6月份進(jìn)行。

1.2 主要儀器與設(shè)備

VKL70-5S標(biāo)準(zhǔn)型分子蒸餾裝置，德國瑞達(dá)有限公司生產(chǎn)；7890A氣相色譜儀器，美國Agilent公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇籽油提取方法的篩選 以獲取高質(zhì)量α-亞麻酸為目的，分別利用索氏抽提法、冷榨法、熱榨法和超臨界CO2萃取法提取紫蘇油，選擇提取率、碘價、酸值、皂化值和折光率5項(xiàng)指標(biāo)，對油脂的不飽和水平、游離脂肪酸或酸敗水平以及油脂的純度進(jìn)行評估，確定紫蘇油提取的最佳方法。

（1）提取率的測定方法

按公式(1)計算提取率，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

式中：m1——紫蘇油質(zhì)量，g：m2——紫蘇籽質(zhì)量，g。

（2）碘價的測定方法

稱取0.10～0.50 g紫蘇油樣品，加20 mL乙酸和環(huán)乙烷等比例混合溶液和25 mL乙酸溶液（含一氯化碘），在黑暗不透光處放置2 h。同時，空白對照不加入紫蘇油樣品。避光反應(yīng)結(jié)束后，向錐形瓶中加入KI溶液，以Na2S2O3作為標(biāo)準(zhǔn)滴定液，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

碘值的計算見公式(2)。

式中：C——Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度，mol/L：V0——空白試驗(yàn)組消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V1——樣品消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；m——油品質(zhì)量，g。

（3）酸值的測定

稱取5.0 g紫蘇油樣品于100 mL錐形瓶，加入30 mL 95%乙醇，震蕩提取1 h。提取液轉(zhuǎn)移至50 mL康寧管中，2000 r/min離心5 min，從上清液中取20 mL于錐形瓶中，加入3～4滴酚酞溶液，以0.01 mol/L的氫氧化鉀-乙醇滴定液滴定至微紅色，且保持30 s不褪色，記下氫氧化鉀-乙醇滴定液的消耗量。以95%乙醇作空白對照，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

樣品酸值(S)的計算見公式(3)。

式中：S——樣品酸值，mg/100g；V0——空白試樣消耗的氫氧化鉀-乙醇滴定液體積，mL；V1——樣品消耗氫氧化鉀-乙醇滴定液體積，mL；C——?dú)溲趸?乙醇滴定液濃度，mol/L；m——油品質(zhì)量，g；ω——每百克原料中水分含量，g。

（4）皂化值的測定

在錐形瓶放入2 g油品，加入5粒沸石和25.0 mL氫氧化鉀-乙醇溶液，連接好裝置后煮沸，持續(xù)沸騰1 h后向其中添入3～4滴酚酞，以HCL作為標(biāo)準(zhǔn)滴定液，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

皂化值的計算見公式(4)。

式中：V0——空白試樣消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V1——樣品消耗的HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；C——HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度，mol/L；m——油品質(zhì)量，g。

（5）折光率的測定

首先用二級水校正折光儀，在棱鏡上滴兩滴樣品，之后將棱鏡合上并旋緊，調(diào)節(jié)反光鏡、補(bǔ)償棱鏡旋鈕，再調(diào)節(jié)棱鏡組旋鈕，最后得到折光率值，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2α-亞麻酸測定方法 稱取0.5 g紫蘇油于25 mL容量瓶中，加5 mL正己烷進(jìn)行溶解，溶解后定容，手動搖勻。取2.0 mL上述溶液至10 mL指形瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液2.0 mL，混合振蕩5 min，靜置5 min，加入6 mL超純水定容，上下顛倒混勻30 s，靜置，保留下層溶液，用超純水少量、多次進(jìn)行洗滌，直至中性，保留正己烷層，過濾后上機(jī)。

氣相色譜條件：色譜柱：HP-INNOWAX，柱溫180℃，檢測器溫度230℃，程序升溫：初始溫度100℃，保持13 min，100～180℃，10℃/min，保持 20 min，180～200℃，1℃/min，保持20 min，200～230℃，4℃/min，保持10.5 min；進(jìn)樣量1.0 μL。采用面積歸一法確定α-亞麻酸相對百分含量。

1.3.3 基于分子蒸餾技術(shù)α-亞麻酸純化條件優(yōu)化

（1）進(jìn)料速度對α-亞麻酸純度的影響

在蒸餾溫度200℃、蒸餾壓力0.05 mbar、刮板轉(zhuǎn)速375 r/min條件下，考察0.5、1.0、1.5、2、2.5 d/min不同進(jìn)料速度對α-亞麻酸純度的影響，每個樣品重復(fù)3次[26]。

（2）蒸餾溫度對α-亞麻酸純度的影響

在進(jìn)料速度1.0 d/min、蒸餾壓力0.05 mbar、刮板轉(zhuǎn)速375 r/min條件下，考察180、190、200、210、220℃不同蒸餾溫度對α-亞麻酸純度的影響，每個樣品重復(fù)3次。

（3）蒸餾壓力對α-亞麻酸純度的影響

在蒸餾溫度200℃、進(jìn)料速度1.0 d/min、刮板轉(zhuǎn)速375 r/min條件下，考察0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mbar不同蒸餾壓力對α-亞麻酸純度的影響，每個樣品重復(fù)3次。

（4）刮板轉(zhuǎn)速對α-亞麻酸純度的影響

在蒸餾溫度200℃、蒸餾壓力0.05 mbar、進(jìn)料速度1.0 d/min條件下，考察325、350、375、400、425 r/min不同刮板轉(zhuǎn)速對α-亞麻酸純度的影響，每個樣品重復(fù)3次。

（5）α-亞麻酸純化的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)定蒸餾溫度、蒸餾壓力、刮板轉(zhuǎn)速和進(jìn)料速度4個因素，每個因素3個水平，采用L9(34)的正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化α-亞麻酸的純化條件，正交試驗(yàn)設(shè)計如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，利用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析，以P<0.05臨界值表征兩組數(shù)據(jù)間具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

利用索氏抽提法、冷榨法、熱榨法、超臨界CO2萃取法提取紫蘇籽油，測定紫蘇籽油的碘值、酸值、皂化值、折光率，計算提取率和α-亞麻酸純度，結(jié)果如表2所示，索氏抽提法的提取率和酸值均顯著高于其他3種提取方法(P<0.05)，超臨界CO2萃取法提取油脂的碘值、皂化值以及α-亞麻酸純度3項(xiàng)指標(biāo)的檢測結(jié)果均顯著高于其他3種提取方法(P<0.05)，折光率指標(biāo)與冷榨法和索氏抽提法無顯著差異(P>0.05)。綜合比較分析，采用超臨界CO2萃取法提取紫蘇油。

表2 不同提取方法紫蘇籽油各項(xiàng)指標(biāo)

2.1 分子蒸餾技術(shù)純化α-亞麻酸最佳工藝的確定

2.1.1 進(jìn)料速度對α-亞麻酸純度的影響 在蒸餾溫度200℃、蒸餾壓力0.05 mbar、刮板轉(zhuǎn)速375 r/min條件下，考察進(jìn)料速度對α-亞麻酸純度的影響。結(jié)果如圖1所示，在進(jìn)料速度1.0 d/min時，α-亞麻酸純度最高，隨著進(jìn)料速度提高，α-亞麻酸純度開始降低，因此，進(jìn)料速度選擇1.0 d/min。

圖1 進(jìn)料速度對α-亞麻酸純度的影響

2.1.2 蒸餾溫度對α-亞麻酸純度的影響 在進(jìn)料速度1.0 d/min、蒸餾壓力0.05 mbar、刮板轉(zhuǎn)速375 r/min條件下，考察蒸餾溫度對α-亞麻酸純度的影響。結(jié)果如圖2所示，在蒸餾溫度210℃時，α-亞麻酸純度明顯高于其他組，因此，蒸餾溫度選擇210℃。

圖2 蒸餾溫度對α-亞麻酸純度的影響

2.1.3 蒸餾壓力對α-亞麻酸純度的影響 在蒸餾溫度200℃、進(jìn)料速度1.0 d/min、刮板轉(zhuǎn)速375 r/min條件下，考察蒸餾壓力對α-亞麻酸純度的影響。結(jié)果如圖3所示，在蒸餾壓力0.06 mbar，α-亞麻酸純度達(dá)到最大值，因此，蒸餾壓力選擇0.06 mbar。

圖3 蒸餾壓力對α-亞麻酸純度的影響

2.1.4 刮板轉(zhuǎn)速對α-亞麻酸純度的影響 在蒸餾溫度200℃、蒸餾壓力0.05 mbar、進(jìn)料速度1.0 d/min條件下，考察刮板轉(zhuǎn)速對α-亞麻酸純度的影響。結(jié)果如圖4所示，在刮板轉(zhuǎn)速400 r/min時，α-亞麻酸純度達(dá)到最大值。因此，刮板轉(zhuǎn)速選擇400 r/min。

圖4 刮板轉(zhuǎn)速對α-亞麻酸純度的影響

2.1.5α-亞麻酸純化正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平正交試驗(yàn)，對各參數(shù)條件進(jìn)行整體優(yōu)化，結(jié)果如表3所示。

由表3和4可知，α-亞麻酸提取純化過程中，4個單因素對α-亞麻酸純度影響的大小為A蒸餾溫度>B蒸餾壓力>D進(jìn)料速度>C刮板轉(zhuǎn)速，其中A和B效果極顯著(P<0.01)，D效果顯著(P<0.05)。通過比較k值，確定最優(yōu)組合A3B3C1D2，即蒸餾溫度220℃，蒸餾壓力0.07 mbar，刮板轉(zhuǎn)速 375 r/min，進(jìn)料速度 1.0 d/min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α-亞麻酸純度為97.42%。因此，A3B3C1D2為高純度α-亞麻酸的最佳純化條件。

表3 α-亞麻酸純化正交試驗(yàn)分析表

表4 α-亞麻酸純化正交試驗(yàn)方差分析

3 討論

本試驗(yàn)比較了索氏抽提法、冷榨法、熱榨法和超臨界CO2萃取法提取紫蘇油的提取率、碘值、酸值和折光率，結(jié)果表明，索氏抽提法的提取率和酸值均顯著高于其他3種提取方法(P<0.05)，酸值高說明紫蘇油中游離脂肪酸的含量高或酸敗程度大，不利于后續(xù)α-亞麻酸的提取。超臨界CO2萃取法提取油脂的碘值、皂化值以及α-亞麻酸純度均顯著高于其他3種提取方法(P<0.05)，折光率（除熱榨法外）無顯著差異(P>0.05)，盡管提取率相對低一些，但其他指標(biāo)更好，且無有機(jī)溶劑殘留。因此，綜合比較，采用超臨界CO2萃取法提取紫蘇油。桂靜芬等[27]利用響應(yīng)面法對冷榨法提取紫蘇油的工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳條件下紫蘇油得率為34.28%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。Jung等[28]實(shí)驗(yàn)表明，紫蘇籽油的提取率，正己烷(41.76%)>超臨界CO2萃取法(39.56%)>機(jī)械壓榨法(31.74%)，超臨界CO2萃取法的提取率高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與有機(jī)溶劑法相當(dāng)。王羚等[29]通過比較超臨界CO2萃取法和有機(jī)試劑法提取的油茶餅中油脂的酸價、過氧化值、皂化值等指標(biāo)，證明超臨界CO2萃取油脂品質(zhì)更好，與本試驗(yàn)結(jié)論一致。與前人結(jié)果對比可知，將紫蘇籽進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理，如：烘烤和超聲波破碎，或許可以提高油脂的提取率，超臨界CO2萃取法提取工藝還有待進(jìn)一步優(yōu)化。

本試驗(yàn)以蒸餾溫度、蒸餾壓力、刮板轉(zhuǎn)速和進(jìn)料速度為考察因素，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化分子蒸餾技術(shù)的純化效果。結(jié)果表明，最佳條件下α-亞麻酸純度達(dá)到97.42%，分子蒸餾技術(shù)提取紫蘇油中α-亞麻酸的效果還是相當(dāng)不錯。陳樂清[30]等利用分子蒸餾技術(shù)純化亞麻籽油中α-亞麻酸，以預(yù)熱溫度、蒸餾溫度、進(jìn)料速度和刮板轉(zhuǎn)速為優(yōu)化因素，最佳條件下α-亞麻酸純度為80.27%。劉金菊[31]等利用分子蒸餾技術(shù)純化亞麻籽油α-亞麻酸，以蒸餾壓力、蒸餾溫度、刮板轉(zhuǎn)速和進(jìn)料速度為優(yōu)化因素，最佳條件下α-亞麻酸純度81.15%。根據(jù)以上結(jié)果推測，α-亞麻酸的原料來源和提取工藝對純化結(jié)果影響也較大。

除了分子蒸餾技術(shù)之外，α-亞麻酸純化方法還可以有很多，例如：劉旭等[32]利用尿素包合法從紫蘇油中純化α-亞麻酸，最佳條件下純度達(dá)到77.23%。徐春明等[33]利用β-環(huán)糊精包和法純化α-亞麻酸，最佳條件下純度達(dá)到77.42%。相比較而言，分子蒸餾技術(shù)得到的α-亞麻酸純度更高。

4 結(jié)論

結(jié)合α-亞麻酸純度和安全性考慮，最終采用超臨界CO2萃取法提取紫蘇油，并以此作為分子蒸餾的原料。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了基于分子蒸餾技術(shù)紫蘇油α-亞麻酸純化的最佳工藝為：蒸餾溫度220℃，蒸餾壓力0.07 mbar，刮板轉(zhuǎn)速375 r/min，進(jìn)料速度1.0 d/min，在此條件下α-亞麻酸純度為97.42%，這表明分子蒸餾技術(shù)在獲取高純度α-亞麻酸方面具有研究意義。未來的研究中，可對紫蘇籽進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，在保證油品質(zhì)量的前提下，進(jìn)一步提升紫蘇油的提取率。

紫蘇籽含有45%～50%紫蘇油，紫蘇油含有60%～65%α-亞麻酸，利用超臨界萃取技術(shù)和分子蒸餾技術(shù)，不僅能夠獲得高純度α-亞麻酸，而且α-亞麻酸質(zhì)量好，安全無污染。隨著人們生活質(zhì)量和健康水平的不斷提高，α-亞麻酸的需求量和質(zhì)量逐步上升。因此，采用分子蒸餾技術(shù)獲取綠色天然高純度α-亞麻酸的方法具有廣闊的市場應(yīng)用前景。