王 爽，李海英

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

蛋白質(zhì)作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，需要保證其正常合成以及及時(shí)的降解。蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的保持與泛素蛋白酶體途徑(ubiquitn proteasome system，UPS)密切相關(guān)[1]。在UPS中，由3種泛素化酶介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行修飾。這個(gè)系統(tǒng)從泛素分子開始，首先E1泛素激活酶激活泛素分子并轉(zhuǎn)移至E2泛素藕合酶上，E2負(fù)責(zé)將泛素分子通過E3泛素連接酶轉(zhuǎn)移至靶蛋白上，完成泛素化修飾過程[2]。通常來說，特定的E2與E3的配對(duì)確定泛素化的類型，從而賦予底物不同的命運(yùn)。然而在此過程中E3起到特異性識(shí)別底物的作用，由于其功能的重要性使E3成為研究熱點(diǎn)。

植物中大部分U-box型蛋白(plant U-box protein，PUB)具有E3泛素連接酶活性，在UPS中扮演著重要的角色。據(jù)報(bào)道，在酵母和人類基因組中分別鑒定出2個(gè)和21個(gè)U-box型蛋白，而在擬南芥、水稻及大豆基因組中分別鑒定出64個(gè)、77個(gè)、125個(gè)U-box型蛋白[3-4]。植物中U-box型增加的數(shù)量表明這些蛋白可能在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育過程中發(fā)揮作用。U-box型蛋白具有高度保守的約70個(gè)氨基酸序列，形成β-β-α-β折疊結(jié)構(gòu)，暴露出促進(jìn)E2與泛素分子結(jié)合的芳香族氨基酸殘基和疏水氨基酸殘基[5]。U-box蛋白被認(rèn)為是修飾的RING蛋白，但與RING蛋白不同，U-box蛋白通過鹽橋或氫鍵傳遞泛素分子。除了含有U-box結(jié)構(gòu)域，PUB蛋白往往包含其他結(jié)構(gòu)域，例如ARM基序、激酶結(jié)構(gòu)域、WD40結(jié)構(gòu)域、MIF4G基序等，基于這一點(diǎn)，可以對(duì)PUB蛋白進(jìn)行再次分類[6-7]。

鹽脅迫作為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要的環(huán)境脅迫，可造成細(xì)胞內(nèi)外Na+/K+離子不平衡、光合速率降低、細(xì)胞損傷甚至死亡[8]。研究表明，U-box基因家族作為重要的E3泛素連接酶家族，在植物應(yīng)答非生物脅迫過程扮演著重要角色。擬南芥PUB18和PUB19轉(zhuǎn)錄水平可受鹽脅迫誘導(dǎo)，與野生型植株相比，pub18pub19雙突變株對(duì)鹽脅迫的抗性增加[9]。擬南芥PUB22和PUB23可以泛素化RPN12a，從而在干旱脅迫反應(yīng)中起作用[10]。小麥中TaPUB1可以與甘露糖苷酶蛋白(TAMP)相互作用，在植物響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)過程中起到正向調(diào)控作用[11]。

甜菜作為中國(guó)重要的糖料作物，具有較強(qiáng)的耐鹽能力。目前還沒有關(guān)于甜菜PUB蛋白的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用前期得到的鹽脅迫下甜菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中篩選得到42個(gè)編碼包含U-box結(jié)構(gòu)域蛋白的差異表達(dá)基因。本研究對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為深入研究甜菜PUB基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

二倍體栽培甜菜T710-Mu品系。

1.2 甜菜PUB蛋白的確定

實(shí)驗(yàn)室前期利用280 mmol/L NaCl[12]處理甜菜T710-Mu品系，得到鹽處理?xiàng)l件下的甜菜T710-Mu品系葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[13]，從中篩選差異表達(dá)的PUB基因，得到42個(gè)差異表達(dá)的甜菜PUB基因，根據(jù)蛋白在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的出現(xiàn)順序?qū)⑻鸩薖UB蛋白命名為BvPUB1-BvPUB42，進(jìn)行接下來的生物信息學(xué)分析。

1.3 甜菜PUB蛋白理化性質(zhì)檢測(cè)

該研究通過在PROTPARAM網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)中輸入PUB蛋白質(zhì)的氨基酸序列，選擇計(jì)算參數(shù)，分別對(duì)PUB蛋白質(zhì)的氨基酸大小、分子量及等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析。

1.4 基因在染色體上的分布

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取甜菜PUB基因在染色體上的位置，并使用TBtools繪制染色體定位圖。

1.5 PUB基因及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和TAIR擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)分別獲得甜菜PUB蛋白質(zhì)的氨基酸序列和擬南芥同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列，利用Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)以及MEME在線軟件(https://meme-suite.org/)對(duì)甜菜PUB蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，下載結(jié)果。在NCBI上查找甜菜(Beta vulgaris L.)的GFF3文件，使用MEGA-X軟件并選用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用TBtools本地軟件對(duì)PUB進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，并將基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域可視化。

1.6 甜菜PUB蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作預(yù)測(cè)

利用STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)預(yù)測(cè)甜菜PUB蛋白的互作蛋白，繪制PPI，利用Cytoscape軟件進(jìn)行美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 PUB基因的鑒定與分析

對(duì)在鹽脅迫條件下差異表達(dá)的42個(gè)PUB基因序列進(jìn)行分析（表1）。結(jié)果表明，它們編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度介于245～1034 aa之間，預(yù)測(cè)分子量介于27885.88～96138.82 Da之間，等電點(diǎn)介于5.02～8.59之間。

表1 甜菜PUB基因的詳細(xì)信息

2.2 染色體定位分析

利用基因位置信息以及Tbtools軟件繪制甜菜PUB基因的染色體定位圖（圖2），通過定位圖可以看出，42個(gè)甜菜PUB基因在9條染色體上均有定位，其中和chr1和chr2上包含較多的PUB基因，chr3、chr4和chr8上只包含1個(gè)PUB基因。

圖1 甜菜PUB基因染色體定位示意圖

2.3 PUB基因序列分析及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用甜菜PUB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并結(jié)合甜菜基因組注釋文件對(duì)甜菜PUB基因序列進(jìn)行分析，繪制保守基序示意圖（圖2b）和基因結(jié)構(gòu)示意圖（圖2c）。結(jié)果顯示，PUB基因包含多個(gè)保守的motif，保守的motif構(gòu)成的保守的結(jié)構(gòu)域?qū)τ谫x予PUB蛋白不同的生物學(xué)功能具有重要作用。這些保守的結(jié)構(gòu)域主要包括U-box結(jié)構(gòu)域，Pkinase結(jié)構(gòu)域、Pkinase-Tyr結(jié)構(gòu)域、Usp結(jié)構(gòu)域、Arm結(jié)構(gòu)域以及KAP結(jié)構(gòu)域?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果顯示，不同的PUB基因之間包含內(nèi)含子與外顯子個(gè)數(shù)存在差異。

圖2 PUB基因結(jié)構(gòu)分析

2.4 序列比對(duì)及分類

根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化樹比較，將擬南芥中PUB蛋白分為7類。以擬南芥PUB蛋白分類為依據(jù)，對(duì)甜菜PUB蛋白進(jìn)行分類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，甜菜PUB蛋白位于ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ類型中，說明這42個(gè)甜菜PUB蛋白與擬南芥的ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ類型PUB蛋白結(jié)構(gòu)更相近。這為進(jìn)一步研究甜菜PUB蛋白家族提供一定基礎(chǔ)。利用MEME在線網(wǎng)站對(duì)甜菜PUB蛋白的保守基序進(jìn)行分析（圖4），結(jié)果顯示甜菜PUB蛋白包含保守的約70個(gè)氨基酸組成的U-box型結(jié)構(gòu)域（圖5）。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖4 PUB蛋白保守基序示意圖

圖5 U-box保守結(jié)構(gòu)域示意圖

2.5 甜菜PUB蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用STRING網(wǎng)站，將甜菜PUB蛋白與擬南芥蛋白進(jìn)行比對(duì)并繪制PPI。結(jié)果顯示，BvPUB5、BvPUB18、BvPUB 34、BvPUB 35分 別 與 擬 南 芥PUB13(63.7%)、PUB19(43.1%)、AT3G01400(75.7%)、AT3G49810(64.2%)有較高的同源性，并且它們之間具有互作關(guān)系。PUB13與Ras相關(guān)蛋白R(shí)ABA4b存在相互作用關(guān)系，RABA4b屬于Rab家族中的小GTPase亞家族，是一種調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)。AT3G49810可以與BKI1相互作用，BKI1是一種質(zhì)膜定位的磷蛋白質(zhì)，可以直接與BRI1的激酶域相互作用從而抑制激酶活性。PUB19可以與26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基11同源物ATS9相互作用，同時(shí)ATS9又與26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基RPN1A和RPN1B相互作用。這些結(jié)果說明甜菜PUB蛋白可能作為E3泛素連接酶對(duì)不同種蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化修飾，也可與26S蛋白酶體相互作用導(dǎo)致泛素化蛋白質(zhì)降解。

3 討論

植物生長(zhǎng)和發(fā)育依賴于植物感知和響應(yīng)環(huán)境及內(nèi)源信號(hào)的能力，因此對(duì)植物的適當(dāng)刺激和適當(dāng)響應(yīng)之間的相互作用十分復(fù)雜。除了信號(hào)傳輸外，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑本身的調(diào)節(jié)也很重要[14]。泛素介導(dǎo)的蛋白水解作為重要的翻譯后過程在響應(yīng)發(fā)育或適應(yīng)環(huán)境脅迫的真核信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)過程中起到重要作用。蛋白質(zhì)泛素化通過調(diào)節(jié)各種肽豐度、酶活性或蛋白質(zhì)定位從而在植株生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段以及抵抗各種生物脅迫和非生物脅迫過程中起關(guān)鍵作用[15]。E3泛素連接酶作為泛素化修飾過程中重要的酶，在植物響應(yīng)非生物脅迫中起到重要作用。U-box型E3泛素連接酶小麥中TaPUB1通過調(diào)控干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱的耐受性。除此之外，可促進(jìn)TaPYL4和TaABI5的降解，降低轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)ABA的敏感性[16-17]。鹽脅迫下，TaPUB26影響某些抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，破壞細(xì)胞的抗氧化酶系統(tǒng)，降低轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[18]。在鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，AtPUB30作為植物E3泛素連接酶可泛素化BKI1并導(dǎo)致其降解，從而負(fù)調(diào)控植株的耐鹽性[19]。然而AtPUB31在植株響應(yīng)鹽脅迫過程中起到正向調(diào)控的作用[20]。本研究以前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)從中篩選鹽脅迫下差異表達(dá)的甜菜PUB基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為接下來進(jìn)行U-box型泛素連接酶的研究提供了更充分的理論基礎(chǔ)及參考。此外，對(duì)U-box型蛋白的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，26S蛋白酶體亞基相關(guān)蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、激酶等功能蛋白被預(yù)測(cè)到，雖然結(jié)果僅為預(yù)測(cè)結(jié)果，但與已經(jīng)報(bào)道的植物PUB蛋白存在一定相似性，所以結(jié)果可信，可作為后續(xù)互作蛋白鑒定的候選蛋白。

4 結(jié)論

本研究以甜菜T710-Mu品系為研究對(duì)象，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)獲得42個(gè)差異表達(dá)的PUB基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)甜菜PUB基因在甜菜9條染色體上均有定位，依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)可將甜菜PUB蛋白歸為ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ中，它們具有保守的功能結(jié)構(gòu)域，如U-box，Pkinase、Pkinase-Tyr、Usp、Arm以及KAP結(jié)構(gòu)域，可能是潛在的E3泛素連接酶。這些結(jié)果可為接下來研究甜菜U-box型E3泛素連接酶提供理論支持。

圖6 甜菜PUB蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖