陳 偲，王 穎，謝生茂，李忠輝，武建軍

（1.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六九醫(yī)院消化內(nèi)分泌科,呼和浩特 010010; 2.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院a.老年病科; b.腫瘤內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014010; 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，呼和浩特 010010 ）

近年隨著基因分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活及眾多信號(hào)分子通路，基于分子生物學(xué)的研究為腫瘤的研究及診治提供了新的方向和思路[1]。G 蛋白偶聯(lián)受體家族C 群5 成員A（G protein coupled receptor C type group 5 member A，GPRC5A）是3-G 蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，以往研究發(fā)現(xiàn)GPRC5A 在多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，提示GPRC5A 可能參與腫瘤的進(jìn)展。GPRC5A 的作用首次在肺癌中被揭示，認(rèn)為是一種促進(jìn)生長(zhǎng)的基因和一種新的p53 轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)[2]。且研究表明，與鄰近正常組織相比，肺腫瘤組織中GPRC5A 表達(dá)下調(diào)[3]，其在肺腺癌中發(fā)揮抑癌作用。而在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)GPRC5A 基因具有高突變率[4]。另?yè)?jù)報(bào)道顯示，信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在眾多癌細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，能夠促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明，敲除STAT3 能夠通過(guò)刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，提高免疫原性化療的療效[5]。STAT3 在多種癌癥中的表達(dá)及功能已被證實(shí)，GPRC5A 和STAT3 表達(dá)具有相關(guān)性[6]。且證實(shí)，GPRC5A 在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，正向調(diào)控STAT3 表達(dá)，與結(jié)直腸癌臨床病理關(guān)系密切[6]。提示GPRC5A 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮某種作用。因此，本研究擬探究GPRC5A 在肝癌中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，以期為臨床提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年12月～2019年11月在本院行手術(shù)治療的38 例肝癌患者癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織樣本，均經(jīng)臨床病理確診。人正常肝上皮細(xì)胞株HL-7702 和人肝癌細(xì)胞株（HepG2，HCCLM3，HuH-7 和MHCC-97H）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)液購(gòu)自Biological Industries 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol 試劑盒購(gòu)自大連Takara 公司；LipofectamineTM2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自Life technologies 公司；BCA 檢測(cè)試劑盒、Transwell 小室購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗鼠GPRC5A 單抗、兔抗鼠VEGF 單抗、兔抗鼠caspase-3 單抗、兔抗鼠STAT3 單抗、兔抗鼠c-MYC 單抗、兔抗鼠Socs3 單抗和鼠抗GAPDH購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；陰性對(duì)照pcDNA3.1 質(zhì)粒，pcDNA3.1-GPRC5A 質(zhì)粒及PCR 引物由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；酶標(biāo)儀購(gòu)自DR-200Bs Diatek 公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) : 將實(shí)驗(yàn)肝癌細(xì)胞置于含10ml/dl胎牛血清及雙抗RPMI1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞融合至85%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 按照Lipo 2000 試劑盒說(shuō)明書(shū)將陰性對(duì)照pcDNA3.1 和pcDNA3.1-GPRC5 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HepG2 細(xì)胞，37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)48 h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。分組：根據(jù)轉(zhuǎn)染情況分為空白對(duì)照組（control 組），pcDNA3.1（對(duì)照pcDNA3.1 組），pcDNA3.1-GPRC5（pcDNA3.1-GPRC5A 過(guò)表達(dá)組）。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)：采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板配置PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)，以β-actin 為內(nèi)參，檢測(cè)GPRC5A 相對(duì)表達(dá)。引物序列如下，GPRC5A 正向：5’-AGCAGGTCTCATCGCAGCTT-3’，反向：5’-ACTTGCGAATCATACGCACG-3’；β-actin 正向：5’-CTGACGATCGATAGTCATATGGC-3’，反 向：5’- agCatacGttGtCacGactCc-3’。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blotting）實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48 h 后收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液于冰上裂解，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度；取20 mg 蛋白樣品行SDSPAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5g/dl 脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗孵育過(guò)夜；次日，TBST 洗膜3次，加HRP 標(biāo)記二抗，孵育2 h；TBST 洗膜3 次，ECL 顯色觀察。

1.3.5 MTT 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn): 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞接種于96 孔板，濃度6×105個(gè)/孔，培養(yǎng)4h后每孔加入MTT 溶液10 μl，繼續(xù)孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm 處吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè) ：將pcDNA3.1-GPRC5A 或空載pcDNA3.1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染在HepG2細(xì)胞，37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞接種在6 孔板，濃度1×106個(gè)/孔，根據(jù)V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測(cè)：待細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用于以下實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：①ROS 含量檢測(cè)：以1×106個(gè)/孔接種在6 孔板，48 h 后收集細(xì)胞，加入10 μmol/L DCFH-DA 重懸，根據(jù)ROS 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。②NAD+/NADH 檢測(cè)：以同樣密度接種于96 孔板，48 h 后收集提取細(xì)胞蛋白，按照NAD+/NADH 試劑盒說(shuō)明書(shū)配制檢測(cè)液，并加入配置好的樣本液，37℃避光孵育1 h，檢測(cè)450 nm 處吸光度值。③ATP 含量檢測(cè)：以同樣密度接種于96 孔板，48 h 后收集提取細(xì)胞蛋白；按ATP 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制檢測(cè)液，加入50 μl 樣本液，避光孵育30 min，檢測(cè)450 nm 處吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用one-way ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。肝癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPRC5A 在肝癌組織及細(xì)胞中的表達(dá) qRTPCR 法檢測(cè)肝癌組織、配對(duì)正常組織和肝癌細(xì)胞、肝正常上皮細(xì)胞中GPRC5A 表達(dá)，結(jié)果顯示肝癌組織中GPRC5A 表達(dá)量（0.34±0.09）顯著低于癌旁正常組織（0.73±0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.869，P<0.01），見(jiàn)圖1A；類似地，GPRC5A 在肝癌細(xì)胞

HepG2（0.35±0.06），HCCLM3（0.38±0.10），HuH-7（0.53±0.07） 和MHCC-97H（0.67±0.06）中的表達(dá)量均顯著低于人正常肝上皮細(xì)胞HL-7702中的表達(dá)量（1.00±0.08），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 11.258，8.386，7.658，5.716，P<0.05，見(jiàn)圖1B），其中HepG2，HCCLM3 細(xì)胞中表達(dá)最低。因此選擇HepG2 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 GPRC5A 在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)量

2.2 GPRC5A 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，與對(duì)照組（1.00±0.10）和pcDNA3.1組（1.02±0.08）相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A組（2.49±0.22）細(xì)胞中GPRC5A 表達(dá)水平顯著增加（F=101.421，P<0.001），見(jiàn)圖2A 和2B。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A 組（0.94±0.16）36 h 的細(xì)胞增殖A值較對(duì)照組（1.49±0.05）和pcDNA3.1 組（1.45±0.07）顯著降低（F=25.640，P<0.01），見(jiàn)圖2C。GPRC5A 過(guò)表達(dá)組（0.98±0.04）細(xì)胞上皮增長(zhǎng)因子VEGF 表達(dá)量較Control 組（2.94±0.15）和pcDNA3.1 組（2.89±0.11）也顯著降低（F= 310.450，P<0.001），見(jiàn)圖2A 和2B。以上結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)GPRC5A抑制了肝癌HepG2細(xì)胞的增殖。

圖2 過(guò)表達(dá)GPRC5A 抑制肝癌細(xì)胞的增殖

2.3 GPRC5A 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 經(jīng)檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A 組（182.12±13.42）細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)因子ROS水平較對(duì)照組（101.23±11.20）和pcDNA3.1 組（98.30±10.26）顯著增加（F=49.577，P<0.001）；NAD+/NADH（35.24±6.43） 及ATP（55.34±6.51）水平較對(duì)照組（100.25±12.41，100.17±14.36）和pcDNA3.1 組（97.86±9.67，102.23±11.02）顯著降低（F=42.338 和17.077，P<0.05），見(jiàn)圖3A。GPRC5A過(guò)表達(dá)組（20.70%）細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組（4.70%）和pcDNA3.1 組（5.00%）顯著提高，見(jiàn)圖3B。細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3（2.61±0.16）表達(dá)量較對(duì)照組（1.00±0.11）和pcDNA3.1 組（1.01±0.02）也顯著增加（F=202.843，P<0.001），見(jiàn)圖3C。以上結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)GPRC5A 促進(jìn)了HepG2，HCCLM3 細(xì)胞的氧化應(yīng)激，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 過(guò)表達(dá)GPRC5A 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡

2.4 GPRC5A 對(duì)STAT3/Socs3/c-MYC 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 研究通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞中GPRC5A 表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（1.00±0.13）和pcDNA3.1 組（1.03±0.12）相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A 組（0.43±0.06）細(xì)胞中p-STAT3 表達(dá)量顯著降低（F=29.476，P<0.001），見(jiàn)圖4A 和4B；pcDNA3.1-GPRC5A 組下游基因Socs3（0.47±0.05），c-MYC（0.54±0.06）表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（1.01± 0.05，1.00±0.04） 和pcDNA3.1 組（0.98±0.09，1.02±0.06）（F=63.275，75.409，均P<0.001），見(jiàn)圖4A，4C 和4D。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中STAT3 與GPRC5A 表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.746，P<0.01），見(jiàn)圖4E。以上結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)GPRC5A抑制STAT3 的表達(dá)，并抑制Socs3/c-MYC 通路的激活。

圖4 過(guò)表達(dá)GPRC5A 抑制STAT3/Socs3/c-MYC 信號(hào)通路激活

2.5 STAT3 介導(dǎo)的Socs3/c-MYC信號(hào)通路參與GPRC5A 對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制 為探究GPRC5A與Socs3/c-MYC 信號(hào)通路在肝癌中作用機(jī)制，研究在HepG2 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPRC5A，pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)VEGF 蛋白表達(dá)（P<0.05），見(jiàn)圖5A；抑制細(xì)胞凋亡率（P<0.05），見(jiàn)圖5B；增加細(xì)胞內(nèi)IL-6 水平（P<0.05），見(jiàn)圖5C；細(xì)胞內(nèi)ROS 水平明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖5D，顯著逆轉(zhuǎn)了pcDNA3.1-GPRC5A 的抑制作用。以上結(jié)果表明STAT3 介導(dǎo)的Socs3/c-MYC 信號(hào)通路參與GPRC5A 對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制。

圖5 STAT3 介導(dǎo)的Socs3/c-MYC 信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡

3 討論

肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，高死亡率，是全世界癌癥相關(guān)死亡率的第三大常見(jiàn)原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，遺傳、表觀遺傳改變、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素、吸煙、肥胖和糖尿病等是肝癌的主要危險(xiǎn)因素[7-8]。高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率是肝癌患者預(yù)后差的主要原因[9]。因此，基于分子生物學(xué)角度找尋特異性分子靶標(biāo)對(duì)肝癌臨床診治及攻克具有顯著意義。

研究發(fā)現(xiàn)，GPRC5A 異常表達(dá)與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。GPRC5A 在肺組織中異常低表達(dá)，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[3]。GPRC5A 通過(guò)激活表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號(hào)導(dǎo)致MDM2 失調(diào)，促進(jìn)肺腫瘤的發(fā)展[11]。GPRC5A 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。GPRC5A 通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)了喉癌的進(jìn)展[13]。提示GPRC5A 在人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演原癌或抑癌基因作用。而本研究檢測(cè)表明GPRC5A 在肝癌組織和細(xì)胞中顯著低表達(dá)，GPRC5A 過(guò)表達(dá)顯著抑制了肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

最近研究表明，GPRC5A 功能障礙發(fā)生在多種與人類癌癥相關(guān)的途徑中，包括NF-κB，F(xiàn)AK/SCR 和STAT3 途徑[3]。STAT3 被認(rèn)為是癌癥治療的重要靶點(diǎn)，易在各種惡性腫瘤中被激活[14]。研究發(fā)現(xiàn)，化合物K 通過(guò)調(diào)控STAT3 誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡[15]。MEST 通過(guò)STAT3 激活誘導(dǎo)乳腺癌中twist-1 介導(dǎo)的EMT，STAT3，Twist 和EMT標(biāo)記物可作為防治乳腺癌的潛在分子靶點(diǎn)[16]。此外，BRM 轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-302a-3p 靶向SOCS5/STAT3 信號(hào)軸，增強(qiáng)胰腺癌轉(zhuǎn)移[17]。GPRC5A 過(guò)表達(dá)抑制了IL-6 誘導(dǎo)的STAT3 活化，抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，阻止了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)一步惡化。同樣，在本研究中探究發(fā)現(xiàn)GPRC5A 抑制了STAT3的表達(dá)，而STAT3 促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖，兩者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，這表明STAT3 在促進(jìn)肝癌的發(fā)展中起著重要作用。

據(jù)報(bào)道，IL-6 激活的STAT3/Socs3 軸促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。研究發(fā)現(xiàn)，MiR-203 通過(guò)靶向SOCS3 調(diào)控JAK-STAT 通路影響胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡[19]。認(rèn)為STAT3 和SOCS3 之間存在負(fù)反饋，這可能通過(guò)抑制特異性細(xì)胞因子和凋亡信號(hào)的產(chǎn)生在T 細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)揮致癌作用。此外，STAT3和c-MYC 在人胃癌組織和細(xì)胞中上調(diào)，c-MYC 的敲除抑制胃癌細(xì)胞的增殖和糖酵解，提示STAT3/c-MYC 可能是胃癌潛在的治療靶點(diǎn)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，GPRC5A 過(guò)表達(dá)能夠下調(diào)STAT3 及下游基因Socs3，c-MYC 表達(dá)量，抑制Socs3/c-MYC 通路激活，當(dāng)同時(shí)共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT3 或pcDNA3.1-NLRP3 時(shí)，GPRC5A 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的作用被完全逆轉(zhuǎn)，提示STAT3 介導(dǎo)的Socs3/c-MYC 信號(hào)通路參與GPRC5A 對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制，靶向STAT3/Socs3/c-MYC 通路可能是肝癌潛在的腫瘤治療方法。本研究初步探明了GPRC5A 對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為及氧化應(yīng)激的影響，揭示了其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)作用機(jī)制，為臨床肝癌的研究治療提供了新的分子靶標(biāo)，具有可推廣性。然而腫瘤發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，其中涉及分子通過(guò)的異常激活或失活，本研究雖證實(shí)GPRC5A 通過(guò)調(diào)控STAT3 介導(dǎo)的Socs3/c-MYC 信號(hào)通路發(fā)揮作用，但其更深入的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探究闡明。

綜上所述，肝癌細(xì)胞中GPRC5A 顯著低表達(dá)，GPRC5A 過(guò)表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡，其通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3 介導(dǎo)的Socs3/c-MYC 信號(hào)通路和NLRP3 炎癥小體參與調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，提示GPRC5A 可作為新的與肝癌細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步探究GPRC5A 的功能作用，有助于為人類惡性腫瘤的治療找尋新的治療途徑。