朱買勛

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

仔豬腹瀉是困擾生豬養(yǎng)殖的重要疫病之一，有效預(yù)防仔豬腹瀉是直接決定豬場(chǎng)能否正常發(fā)展的關(guān)鍵。近30a來(lái)，我國(guó)在仔豬腹瀉領(lǐng)域取得了明顯的突破，在疫病檢測(cè)技術(shù)、疫苗研發(fā)、防控藥物研發(fā)、仔豬養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理等領(lǐng)域都做出了突出成績(jī)，但是繁瑣的誘因增加了防控的難度，雖然有了良好的防控技術(shù)，臨床上仔豬腹瀉卻仍然不斷暴發(fā)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因腹瀉死亡的豬群占死亡總數(shù)的50.47%，分析其原因復(fù)雜多樣，尤其在仔豬進(jìn)入保育階段前，面臨著斷奶、疫苗注射、轉(zhuǎn)群、飼料更換、藥物的使用等各種應(yīng)激問(wèn)題[1]，容易造成仔豬應(yīng)激反應(yīng)，增加病原微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)該階段的仔豬腸道黏膜組織發(fā)育尚不健全，抵御病原微生物入侵的能力較弱，腸道微生物菌群容易發(fā)生紊亂，影響仔豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[2]，同時(shí)感染仔豬的采食量下降，出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，精神沉郁，嚴(yán)重者出現(xiàn)脫水，甚至死亡。臨床中針對(duì)細(xì)菌引起的腹瀉主要以抗生素治療為主，長(zhǎng)期的抗生素使用直接導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生和抗生素在環(huán)境中暴露等問(wèn)題，不僅危害仔豬的健康養(yǎng)殖，還造成了生態(tài)環(huán)境的污染[3]，尤其是大腸埃希氏血清型較多，致病性差異較大，單一的抗生素還無(wú)法實(shí)現(xiàn)廣泛的抗菌作用，增加了臨床用藥。因此，本試驗(yàn)充分利用中藥綠色、生態(tài)、作用靶點(diǎn)多的特點(diǎn)，選擇白頭翁、蒼術(shù)、黃連、訶子等中藥進(jìn)行配伍，利用現(xiàn)代制藥技術(shù)進(jìn)行提取制備，控制中藥提取物的質(zhì)量，通過(guò)體外抑制臨床分離的致病性大腸埃希氏和豬霍亂沙門氏菌，明確復(fù)方中藥提取物對(duì)這2種引起仔豬腹瀉病原菌的抑制效果，為尋求更為高效合理的防控方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠若干只，18～22g，SPF級(jí)，購(gòu)于重慶實(shí)崠生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 受試藥物

受試藥主要由白頭翁、蒼術(shù)、黃連、訶子等中藥組成，采用50%的乙醇作為溶劑，80℃減壓提取濃縮，添加可溶性淀粉制備成1.0mL提取物含1.0g生藥，4℃保存，備用。

1.1.3 試驗(yàn)材料

生化鑒定管，均購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染液，購(gòu)于南京建成生物工程研究所；陽(yáng)性血清，購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定

采集豬場(chǎng)臨床腹瀉仔豬肛門拭子45個(gè)，參照宋立等[4]的研究方法，分別進(jìn)行大腸埃希氏菌(E.coli)和豬霍亂沙門氏菌(S.Choleraesuis)分離鑒定。大腸埃希氏菌的鑒定包括革蘭氏染色、生化鑒定(IMViC試驗(yàn))、血清學(xué)鑒定(玻片凝集試驗(yàn))。豬霍亂沙門氏菌鑒定主要包括革蘭氏染色和生化鑒定。

1.2.2 小鼠致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)選擇健康的昆明種小白鼠，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組5只，第Ⅰ組給小鼠灌胃1×108cfu·mL-1的大腸埃希氏菌(O9血清型)，第Ⅱ組給小鼠灌胃1×108cfu·mL-1的大腸埃希氏菌(O138血清型)，第Ⅲ～Ⅴ組分別給小鼠灌胃1×108cfu·mL-1的豬霍亂沙門氏菌，灌胃之后，連續(xù)觀察72h，考察大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌的致病性。

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

參照宋立等[4]的研究方法，選擇具有致病性的大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌作為研究對(duì)象，將藥物進(jìn)行稀釋后，分別考察復(fù)方中藥提取物對(duì)大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌的MIC和MBC。

1.2.4 體外抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)采用牛津杯法，取0.1mL濃度為1×105cfu·mL-1菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上。每個(gè)平板中放置3個(gè)牛津杯，分別取2.0g·mL-1、1.0g·mL-1、0.5g·mL-1的藥液200μL，37℃分別培養(yǎng)12h和24h，測(cè)量抑菌圈，判斷藥物敏感性[5]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

采集的45個(gè)樣品中，44個(gè)樣本有菌落，其中43個(gè)出現(xiàn)紅色菌落，革蘭氏染色共有42株為G-短桿菌，經(jīng)IMViC試驗(yàn)測(cè)定，結(jié)果顯示，42株細(xì)菌吲哚試驗(yàn)和甲基紅為陽(yáng)性，VP試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)為陰性，血清型鑒定，主要包括O8、O9、O20、O101、O138、O141共6個(gè)血清型，其中O8、O9、O138血清型占比最高；有3個(gè)樣本有灰白色菌落，接種到沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，均出現(xiàn)紫色菌落，革蘭氏染色結(jié)果為陰性，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、MR試驗(yàn)、枸櫞酸鹽和硫化氫試驗(yàn)表現(xiàn)為陽(yáng)性，乳糖、蔗糖、尿素、靛基質(zhì)試驗(yàn)和VP試驗(yàn)為陰性，確定3株都是豬霍亂沙門氏菌。

表1 大腸埃希氏菌O抗原血清型鑒定

2.2 細(xì)菌致病性結(jié)果

第Ⅰ組小鼠在灌胃O9血清型大腸埃希氏菌48h后5只全部死亡；第Ⅱ組小鼠在灌胃O138血清型大腸埃希氏菌72h后出現(xiàn)2只死亡，有3只小鼠精神萎靡，但未出現(xiàn)死亡。第Ⅲ～Ⅴ組小鼠分別在灌胃3株豬霍亂沙門氏菌的72h后5只全部死亡。

2.3 復(fù)方中藥提取物對(duì)細(xì)菌的MIC和MBC測(cè)定

表2 復(fù)方中藥提取物對(duì)細(xì)菌的MIC、MBC測(cè)定結(jié)果

從表2可知，復(fù)方中藥提取物對(duì)O9血清型大腸埃希氏菌的MIC和MBC值分別為62.5mg·L-1和250mg·L-1，O138血清型大腸埃希氏菌的MIC和MBC值分別為31.25mg·L-1和125mg·L-1。3株豬霍亂沙門氏菌的抑菌、殺菌作用效果較好，MIC值均為62.5mg·L-1，MBC值均為125mg·L-1。

2.4 復(fù)方中藥提取物對(duì)大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌體外抑菌效果

從表3可知，細(xì)菌培養(yǎng)12h后，2.0g·mL-1劑量對(duì)2株大腸埃希氏菌和3株豬霍亂沙門氏菌均為極敏；1.0g·mL-1劑量對(duì)大腸埃希氏菌極敏，對(duì)3株豬霍亂沙門氏菌均為高敏；0.5g·mL-1劑量對(duì)2株大腸埃希氏菌和3株豬霍亂沙門氏菌敏感性為低敏。培養(yǎng)24h后，2.0g·mL-1劑量對(duì)O138血清型的大腸埃希氏菌極敏，對(duì)O138血清型的大腸埃希氏菌和3株豬霍亂沙門氏菌均為高敏；1.0g·mL-1劑量仍然對(duì)2株大腸埃希氏菌和3株豬霍亂沙門氏菌有一定的抑菌效果。說(shuō)明復(fù)方中藥提取物能有效抑制2株大腸埃希氏菌和3株豬霍亂沙門氏菌，且2.0g·mL-1和1.0g·mL-1劑量抑菌效果最佳。

表3 復(fù)方中藥提取物對(duì)大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌體外抑菌效果

3 分析討論

仔豬早期腹瀉的防控是生豬生產(chǎn)的重要需求，針對(duì)斷奶前仔豬胃腸道黏膜組織尚未發(fā)育完善，缺乏完善的益生菌群，分泌消化酶的能力較弱，難以將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為自生的營(yíng)養(yǎng)，在受到病原微生物的入侵時(shí)，機(jī)體不夠及時(shí)適應(yīng)自身并作出抵御作用等問(wèn)題[5]。臨床中要達(dá)到防控仔豬腹瀉比較理想的方法要求藥物既能高效殺死病原菌，又能盡量減少黏膜組織的損傷。本試驗(yàn)臨床45個(gè)樣本中，有3個(gè)樣本是同時(shí)感染大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌，選擇防控藥物時(shí)應(yīng)該能同時(shí)抑制2種致病菌，復(fù)方中藥提取物2.0g·mL-1和1.0g·mL-1劑量在12h內(nèi)大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌均為極敏，24h后仍為極敏或者高敏，顯示出較強(qiáng)的抑菌效果。

從藥理學(xué)的角度分析，復(fù)方中藥中的白頭翁主要含有白頭翁皂苷，有明顯的抑制大腸桿菌的功效[6]；黃連具有明顯的抗炎效果，其成分小檗堿有明顯的抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的作用[7]；訶子富含單寧，能有效抑制大腸桿菌和沙門氏菌[8]；蒼術(shù)主要含有蒼術(shù)醇、蒼術(shù)酮、蒼術(shù)多糖、維生素A樣物質(zhì)、維生素B等，可以有效地為機(jī)體提供微量元素[9]。從而表明復(fù)方中藥具有明顯的抑制大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌的效果，此外，復(fù)方中藥還富含大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以滋養(yǎng)仔豬的腸道，促進(jìn)仔豬腸道的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)防治仔豬腹瀉有明顯的療效，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

根據(jù)中獸醫(yī)辯證論治，腹瀉的根本原因是脾和胃的問(wèn)題，仔豬臟腑嬌嫩，形體未充，脾為后天之本，五臟之母，脾常不足，大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門氏菌侵襲，邪氣聚集，困及脾胃，導(dǎo)致仔豬脾胃損傷，水濕運(yùn)化功能失常，耗損中氣，出現(xiàn)食欲不振、精神困倦、下利不止。在治療過(guò)程中，應(yīng)該以清熱解毒、燥濕健脾、收澀止瀉為主，實(shí)時(shí)根據(jù)病程的轉(zhuǎn)歸及時(shí)調(diào)整治療方案[10]。在復(fù)方中藥中白頭翁性味苦寒，歸胃、大腸經(jīng)，有清熱解毒、涼血止痢的功效，以其為君藥，可解機(jī)體熱毒；黃連性味苦寒，有清熱燥濕、瀉肝膽火之效，以其為臣藥，可瀉肝膽之火；蒼術(shù)性味辛溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，有燥濕健脾，以其為佐藥，可達(dá)燥濕健脾之用；訶子苦、酸、澀、平；歸肺、大腸經(jīng)，能斂肺澀腸，以其為使藥，以收澀腸道，宣通肺氣，使氣機(jī)宣暢，氣化則濕化，從而達(dá)到扶正驅(qū)邪，治療腹瀉的目標(biāo)。