范高福，劉 寅，梁延波,，付恩桃，湯 潔

1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 合肥市教育名師工作室(安徽 合肥 238000) 2.上海海虹實(shí)業(yè)(集團(tuán))巢湖今辰藥業(yè)有限公司(安徽 巢湖 238000)

石榴(PunicagranatumL.) 為落葉灌木或小喬木，是石榴科石榴屬植物，別名安石榴、山力葉、丹若等，在我國南北地區(qū)均有栽培，而安徽懷遠(yuǎn)石榴是國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效[1-3]。當(dāng)前石榴主要以品種改良、果品、果飲深加工為主[4]，但加工過程中會(huì)產(chǎn)生石榴皮、石榴葉、石榴花、石榴籽等廢棄物，而文獻(xiàn)報(bào)道這些廢棄物均含黃酮醇類、多酚類、生物堿及有機(jī)酸等多種生物活性成分[5-9]。石榴皮提取物富含多酚類生物活性物質(zhì)鞣花酸(EA)、沒食子酸(GA)、安石榴苷(Pu)，具有抑制氧化、消炎、抑菌殺菌、護(hù)肝、抗癌及降血糖等多種藥理作用[10-14]。因此，對(duì)石榴皮多酚類單體成分提取工藝的優(yōu)化，進(jìn)一步拓展石榴皮變廢為寶再利用的價(jià)值具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。研究表明[15-16]對(duì)多酚類單體成分EA或GA的檢測方法較多，但關(guān)于安徽本地石榴不同功能部位中鞣花酸、沒食子酸等多酚類生物活性物質(zhì)的含量同時(shí)檢測的方法尚未見報(bào)道，本次實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，對(duì)本地不同品種石榴皮提取物中GA、EA多酚類物質(zhì)含量進(jìn)行同時(shí)檢測并建立方法學(xué)，旨在為安徽本地石榴皮部位的成分的檢測標(biāo)準(zhǔn)及其提取物單體的深加工及臨床應(yīng)用提供借鑒的研究方法。

1 材料與儀器

1.1材料與試劑安徽懷遠(yuǎn)石榴，購自安徽省蚌埠市懷遠(yuǎn)王氏榴園，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭華勝教授鑒定為石榴科石榴屬石榴；石榴GA、EA自制(批號(hào)：20190725，石榴皮購自安徽省蚌埠市藥材公司，石榴GA、EA提取物干粉經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測，純度≥90%)EA對(duì)照品：純度≥98%(sigma)；GA對(duì)照品：純度≥98%(sigma)；Milli-Q超純水，甲醇、乙腈為色譜純；其余所需試劑均為分析純；石榴皮干粉及其石榴皮提取物，本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備Waters-e2695 HPLC系統(tǒng)：配有2998-PDA檢測器(美國沃特世公司)；Mnli-Q Biocel超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)；KL-020S型小型超聲波清洗器(深圳科力超聲波洗凈設(shè)備公司)；RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；ME104E電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；WSY-106數(shù)顯恒溫水浴鍋(無錫市石油儀器設(shè)備有限公司)；SHZ-95B型實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水真空泵(上海申生儀器抽濾真空泵廠)，F(xiàn)D-1C-50冷凍干燥機(jī)(上海比朗儀器有限公司)等。

2 方法與結(jié)果

2.1 GA和EA檢測的色譜條件色譜柱：Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相含甲醇(A)-0.08%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～9 min，97%B；9～15 min，97%～70%B；15～30 min，70%B)，甲醇沖柱10 min，95%B平衡30 min。流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長270 nm，進(jìn)樣體積10 μL[17]。在此色譜條件下，GA、EA特征峰峰型良好，無肩峰、拖尾等現(xiàn)象，見圖1。

注：A:GA對(duì)照品，B:EA對(duì)照品，C:樣品白玉石榴皮，D:樣品紅酸石榴皮。圖1 HPLC色譜圖

2.2 GA、EA對(duì)照品溶液的制備分別快速精密稱取GA對(duì)照品和EA對(duì)照品干粉適量，加50%甲醇溶解定量，配成52.50 μg/mL，50.80 μg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.3 GA、EA檢測的供試品石榴皮溶液的制備精密稱取干燥石榴皮粉末，經(jīng)三號(hào)篩過篩后，精密稱取0.252 0 g，加入容量瓶中，量取50%甲醇25 mL，稱重，超聲30 min，放冷，稱重，用50%甲醇補(bǔ)減失的質(zhì)量，均勻震搖，通過多次抽濾制得濾液，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)精濾制得[18-19]。

2.4檢測波長的選擇對(duì)照品溶液采用二極管陣列檢測器PDA進(jìn)行紫外全波長掃描，吸收輪廓線圖譜見圖2。結(jié)果表明EA在254 nm處有最大吸收(見圖2-A)，GA在215 nm和270 nm處有最大吸收(見圖2-B)，無干擾峰出現(xiàn)，且分離度較好。同時(shí)研讀相關(guān)文獻(xiàn)[17-18]，最終確定270 nm作為EA和GA同時(shí)檢測波長。

注：A：EA對(duì)照品，B：GA對(duì)照品。圖2 對(duì)照品溶液輪廓線掃描圖

2.5 GA、EA檢測的方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍 分別精密稱定GA、EA對(duì)照品干粉適量，加50%甲醇溶解定容至50 mL，搖勻即得。依次通過等度稀釋得到不同濃度GA溶液(212.400，106.200，53.100，26.550，13.275，6.637 μg/mL)和EA溶液(213.200，106.600，53.300，26.650，13.325，6.662 μg/mL)，每個(gè)濃度均進(jìn)樣10 μL。以溶液濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y軸)制作GA、EA響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，GA回歸方程為Y=28 352X+8 233.8(r=0.999 9)，EA回歸方程為Y=24 580X+8 857.7(r=0.999 9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GA在6.637 5～212.400 0呈線性關(guān)系，而EA在6.662 5～213.200 0 μg/mL呈線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 稱取樣品干粉0.25 g，依據(jù)2.3項(xiàng)下制備方法配制供試品溶液，設(shè)置進(jìn)樣量為10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得GA和EA的峰面積RSD分別為0.3%和0.4%，表明該方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 量取GA和EA供試品溶液適量，分別在0，1，3，5，7，12，24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，測得GA和EA的峰面積RSD分別為1.0%和1.2%，表明該樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取等份樣品干粉6份，取樣0.25 g，精密稱定，依據(jù)2.3項(xiàng)下方法配制供試品溶液，測定并計(jì)算GA和EA的RSD分別為1.7%和1.9%，表明該樣品制備方法具有較好的重復(fù)性。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取等份樣品干粉6份，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入GA適量，按2.3項(xiàng)下操作，測定含量并計(jì)算回收率；另取等份樣品干粉6份，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入EA適量，同法操作，見表1。

表1 石榴皮中GA和EA回收率試驗(yàn)

2.5.6 樣品含量測定 取安徽蚌埠市懷遠(yuǎn)產(chǎn)地石榴經(jīng)典品種2種，分別為白玉石榴(A品種)和紅酸石榴(B品種)，依據(jù)2.3項(xiàng)下條件各自制備供試品石榴皮待測溶液，采用外標(biāo)法同時(shí)測定石榴皮功能部位中EA與GA的含量，見表2。

表2 安徽懷遠(yuǎn)石榴皮部位中EA、GA的含量(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過反相高效液相色譜法同時(shí)檢測本地石榴功能部位皮中生物多酚類物質(zhì)GA、EA含量時(shí)，考察了不同溶劑對(duì)樣品中石榴多酚類物質(zhì)GA、EA的溶解程度、提取量及提取效率，不同時(shí)間對(duì)樣品的浸漬與超聲萃取的影響，不同溫度下提取回流及濃縮中抗氧劑維生素C保護(hù)作用，結(jié)果顯示50%甲醇水溶液浸漬樣品約12 h，再超聲(500 W，40 kHz)萃取30 min，提取回流溫度90℃，可有效浸提樣品中GA、EA成分；80%丙酮浸漬約6 h，超聲(500 W，40 kHz)萃取1h，再用酸化甲醇液有利于石榴皮中游離GA、EA的生成，加入抗氧劑維生素C可減少GA、EA多酚類物質(zhì)濃縮與純化過程中的氧化作用，且通過超聲預(yù)處理樣品也可以保護(hù)石榴皮提取物的抗氧化特性和生物活性。此外，在溶劑選擇上，通過不同濃度乙醇、甲醇、丙酮對(duì)石榴皮部位的提取干燥物進(jìn)行溶解度對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半極性溶劑甲醇中的溶解度較好，且干擾雜峰較少，有利于石榴皮提取物干粉制備，從而優(yōu)選甲醇溶劑。

通過比較多個(gè)流動(dòng)相組份(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-三氟乙酸溶液、乙腈-三氟乙酸溶液、甲醇-磷酸溶液)，多個(gè)流速(0.5，0.8，1.0 mL/min)，不同進(jìn)樣量(5、10、20 μL)，不同pH值，依據(jù)根據(jù)色譜的基線、保留時(shí)間、分離度、面積、數(shù)目等，最終確定EA、GA流動(dòng)相系統(tǒng)為甲醇-0.08%磷酸溶液梯度，流速1.0 mL/min，10 μL，柱溫30℃，通過PDA掃描，2個(gè)對(duì)照品色譜峰在270 nm均有較強(qiáng)的紫外吸收，優(yōu)選270 nm作為檢測波長，實(shí)現(xiàn)樣品峰和雜質(zhì)峰分離。與曲文娟等[20]報(bào)道相比，GA保留時(shí)間基本一致，均為8～10 min之間，且不容易分離，但本實(shí)驗(yàn)采用甲醇提取石榴皮中GA、EA多酚類成分的穩(wěn)定性更好，且流動(dòng)相條件設(shè)置較為簡單易操作。

本課題組采集了安徽懷遠(yuǎn)地區(qū)的不同優(yōu)良品種石榴皮樣品，對(duì)其中GA、EA總含量進(jìn)行了測定，結(jié)果分析表明與紅酸石榴皮(B品種)相比，白玉石榴皮(A品種)所含GA和EA含量分別增加了0.13%和0.55%，從而為安徽本地石榴皮多酚類物質(zhì)EA和GA質(zhì)量控制提供參考。因此，本研究通過RP-HPLC初步建立了同時(shí)檢測安徽本地不同品種石榴皮中EA、GA含量方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該檢測方法與現(xiàn)行版《中國藥典(2020年版)》0512中有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有一致性[21]，且具有準(zhǔn)確方便、靈敏穩(wěn)定、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，可以作為石榴皮功能部位中GA、EA的含量檢測方法。