唐鮮娥，何一多，陳穎，夏德堯，覃曉莉，趙方毓，王鳳杰，陳顯兵*

1.湖北民族大學醫(yī)學部(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大學附屬民大醫(yī)院病理科(湖北 恩施 445000)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)是由脊柱骨折或脫位引起的脊髓或馬尾神經(jīng)的損傷。我國SCI患者超過100萬，患病人數(shù)逐年遞增，感覺運動功能的完全或部分消失嚴重影響SCI患者的生活質量和生存壽命[1]。目前臨床尚無特效藥，主要包括手術減壓和穩(wěn)定、神經(jīng)保護藥物等治療[2]。研究表明[3]SCI繼發(fā)性損傷時期的病理生理變化可促進神經(jīng)元的凋亡，搶救損傷邊緣區(qū)域的神經(jīng)元對于神經(jīng)功能修復至關重要，神經(jīng)元凋亡成為SCI的重要發(fā)病機制之一。延齡草苷(Trillium Tschonoskii Maxim,TTM)具有抗癌、抗炎、免疫調節(jié)、清除氧自由基等功效，可通過上調脊髓組織中的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體-α(CNTFR-α)對SCI起保護作用[4]。然而延齡草苷對過氧化氫(H2O2)誘導的腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株(PC12)細胞損傷是否具有保護作用以及其潛在機制尚無文獻報道。本研究以H2O2誘導PC12細胞損傷構建神經(jīng)細胞損傷模型，觀察TTM是否對H2O2誘導PC12細胞損傷具有保護作用，并初步探討TTM是否通過抑制凋亡從而減輕H2O2誘導的PC12細胞損傷，揭示TTM是否具有作為SCI治療的潛力。

1 材料與方法

1.1試劑TTM(CAS No.14144-6-0,Bellancom)訂購于北京環(huán)球材料有限公司，高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)測定其純度大于98%，用二甲亞砜(DMSO)溶解TTM形成80 mmol/L的儲備溶液于-20°C保存，使用前將原液稀釋至所需濃度。MTT試劑盒、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Solarbio(索萊寶,中國北京)，Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3一抗購自賽信通(上海)生物試劑有限公司，二抗購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)大鼠PC12購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢)。正常對照組的PC12細胞不做任何處理。H2O2損傷組以300 μmol/L H2O2處理細胞15 min，再換成普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，H2O2+TTM(6.25 μmol/L)、H2O2+TTM(12.50 μmol/L)組、H2O2+TTM(25.00 μmol/L)組分別用300 μmol/L H2O2預處理細胞15 min后，換成相應濃度梯度的TTM處理細胞24 h。細胞培養(yǎng)基選用DMEM，加入10%滅活胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(0.1 mg/mL)，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)。

1.3 MTT法檢測細胞活力將PC12細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)約為10 000個，加DMEM并于37℃孵育，使用不同濃度梯度的H2O2(0、50、100、200、300或400 μmol/L)誘導PC12細胞損傷，MTT法測定細胞活力以確定最佳劑量的H2O2。24 h后在DMEM培養(yǎng)基中加入濃度梯度的TTM(0、6.25、12.50、25.00 μmol/L)并孵育24 h。每孔加入20 L 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后每孔加入DMSO充分溶解MTT結晶甲瓚。使用酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo Scientific,Multiskan Go,Waltham,MA,USA)OD490 nm處測量各孔的吸光值，通過對照孔測得的信號百分比表示細胞活力。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒通過流式細胞術檢測細胞凋亡。凋亡早期的PC12細胞使用熒光素FITC標記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V)染色，使用PI染色觀察凋亡中晚期的細胞和死亡細胞。在細胞懸浮液(100 μL)中加入5 μL的Annexin-V，再加入5 μL的PI，4 ℃下避光反應15 min后，細胞懸液中加入400 μL緩沖液，1 h內在流式細胞儀上機檢測(FACScalibur,Becton Dickinson,美國加利福尼亞州圣何塞)，以細胞總數(shù)的百分比表示凋亡細胞的比例。

1.5蛋白質提取和蛋白質印跡分析PC12細胞處理后棄去培養(yǎng)基，用蛋白質提取試劑盒(Beyotime,中國上海)提取蛋白質，BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃變性5 min。提取蛋白定量后按照30 μg蛋白量上樣，進行SDS-PAGE電泳(8%分離膠、5%濃縮膠)，PVDF膜濕轉，用5%封閉液(脫脂奶粉5 g+TBST100 mL)在室溫封閉1 h。加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入酶標二抗室溫孵育1 h?；瘜W發(fā)光(ECL)顯色后利用AlphaView SA軟件中的Analysis Tools-Multiplex Band Anaysisregion、選取測定的蛋白條帶，使用軟件ImageJ進行半定量分析。內參為β-actin。

2 結果

2.1 H2O2誘導的PC12細胞活力及凋亡相關蛋白的檢測與正常對照組比較，H2O2的濃度為300 μmol/L時PC12細胞活力顯著降低(P<0.01)，而濃度為50 μmol/L時PC12細胞未出現(xiàn)明顯損傷(圖1A)。相較于正常對照組，H2O2損傷組凋亡細胞的百分比顯著增高(P<0.01，圖1B)，H2O2損傷組晚期凋亡細胞比例與正常對照組相比，從4.34%上升到6.06%。Western blot結果顯示，H2O2損傷組Bcl-2的表達水平降低(P<0.01)，Bax和Cleaved-caspase3的表達水平顯著升高(P<0.05；P<0.01)(圖1C)。

注：A. MTT測定細胞活力；B.流式細胞術分析測試凋亡細胞的百分比；C.蛋白質印跡檢測凋亡相關蛋白的表達；與正常對照組比較，*:P<0.05，**:P<0.01。圖1 H2O2誘導PC12細胞的細胞活力降低及細胞凋亡增強

2.2 TTM對H2O2誘導的PC12細胞的細胞活力及凋亡相關蛋白的影響如圖2A所示，相較于H2O2處理組，TTM濃度為12.50 μmol/L時能夠顯著提高細胞活力(P<0.01)，且凋亡細胞百分比顯著降低(P<0.01)(圖2B)，H2O2+TTM(12.50 μmol/L)組晚期凋亡細胞比例與H2O2處理組相比，從17.2%下降到5.13%。Western blot結果顯示，H2O2+TTM(12.50 μmol/L)組Bcl-2的顯著升高(P<0.01)，Bax和C-caspase-3的表達水平顯著降低(P<0.01；P<0.05)(圖2C)。

注：A. MTT測定細胞活力；B.流式細胞術分析測試凋亡細胞的百分比；C.蛋白質印跡檢測凋亡相關蛋白的表達；與正常對照組比較，*:P<0.05，**:P<0.01；與H2O2損傷組比較，#:P<0.05,##:P<0.01。圖2 TTM抑制H2O2誘導的PC12細胞損傷及細胞凋亡

3 討論

臨床上SCI主要表現(xiàn)為損傷平面以下部位的運動和感覺功能障礙。在全球范圍內SCI的發(fā)病率、致殘率呈逐年增高趨勢，為社會、家庭帶來巨大負擔。發(fā)現(xiàn)H2O2誘導了細胞凋亡，而TTM可逆轉H2O2誘導的細胞損傷，抑制細胞凋亡，TTM對損傷PC12細胞具有保護作用，其機制尚不清楚。

急性SCI機制復雜，由瞬間機械力導致的原發(fā)性損傷可引起神經(jīng)元結構功能發(fā)生不可逆損傷，而于原發(fā)性損傷之后發(fā)生的繼發(fā)性損傷對人體具有更大的危害性[1]，凋亡在急性SCI中起著重要作用，氧化應激可能通過引起脂質過氧化、改變蛋白和DNA氧化/氧化還原的狀態(tài)，促進神經(jīng)細胞凋亡[5]。其他所涉及的機制包括脂質過氧化、自由基損傷、氨基酸毒性作用、血管痙攣、鈣離子介導的細胞水腫、電解質失調、炎癥反應、細胞調亡，以及損傷后基因表達的改變等。本研究中使用300 μmol/L H2O2作用PC12細胞可顯著降低其細胞活力，提高凋亡中晚期凋亡細胞的百分，因此本次實驗中H2O2作用于PC12細胞的最終濃度為300 μmol/L，H2O2可誘導PC12細胞凋亡。

凋亡與包括SCI在內的多種神經(jīng)退行性疾病有關，而抑制神經(jīng)元凋亡在SCI治療中擁有較廣泛的前景[6-9]。Bcl-2蛋白家族控制的內在細胞死亡通路是啟動細胞凋亡的主要方式之一[10]，包括抗凋亡成員Bcl-2、Bcl-X(L)和促凋亡成員Bax、Bak、Bad，通過激活調控細胞凋亡的關鍵蛋白酶Caspase-3，從而進行大規(guī)模蛋白水解導致細胞凋亡[11]。本研究表明，H2O2作用于PC12細胞后其細胞凋亡百分比顯著增高，促凋亡蛋白Bax與Cleaved-caspase3表達水平上調，抗凋亡蛋白Bcl-2低表達，提示H2O2誘導了PC12細胞凋亡。過去的研究顯示[12]，在SCI大鼠損傷脊髓組織中，神經(jīng)元的凋亡水平顯著升高，由Nrf2/ARE通路介導的體內氧化應激參與了SCI大鼠神經(jīng)元的損傷。以上研究結果提示，凋亡參與了SCI發(fā)生發(fā)展，通過調控凋亡的水平有機會搶救損傷邊緣的神經(jīng)元，從而改善SCI患者的預后。

頭頂一顆珠(TTM)又名延齡草，主要化學成分以皂苷為主包括甾體皂苷、黃酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷，具有免疫調節(jié)、清除氧自由基DPPH、抑制脂質的過氧化反應，改善心功能和降壓、抗衰老等功效。本研究中，H2O2可誘導PC12凋亡，而TTM可顯著提高H2O2作用后的PC12細胞活力，降低凋亡細胞百分比。另外，從蛋白水平上證實了TTM可上調抗凋亡蛋白Bcl-2，下調促凋亡蛋白Bax以及C-caspase-3，然而TTM通過抗凋亡改善神經(jīng)元損傷的具體機制尚不十分清楚。有研究顯示，TTM可以提高抗氧化酶活性、抑制脂質的過氧化反應、改善SCI大鼠的運動功能。提取液還可通過提高損傷心肌中的SOD、GPx活性和降低MDA含量，抑制糖尿病大鼠心肌損傷中的心肌細胞凋亡[13]。另外TTM在上調脊髓組織中CNTF和其受體表達的同時，還顯著降低損傷脊髓組織中的SOD及ROS的產生，抑制凋亡，通過Nrf2/ARE途徑抑制體內氧化應激反應保護損傷脊髓中的神經(jīng)元細胞[12]，TTM在遭受SCI的大鼠中具有神經(jīng)保護功效[14]。有研究顯示[4,14-15]TTM對SCI大鼠的保護作用與nBax和caspase-3表達的降低有關。以上結果說明，TTM能夠抑制H2O2誘導PC12胞氧化應激及細胞凋亡，減輕H2O2毒性，這可能與觀察到的Bcl-2表達上調和裂解的caspase-3上調相關，分析其原因可能是由于SCI發(fā)生后，導致PC12細胞內ROS積聚、MDA的產生，降低SOD、GSH-Px活力，胞質中Nrf2與Keap1所形成復合體被破壞，Nrf2轉位至細胞核內與ARE序列結合，促進抗氧化酶的表達氧化應激活化Nrf2/ARE通路，Bcl-2蛋白家族控制的內在細胞死亡通路。TTM對H2O2誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，這一保護作用可能通過抑制細胞凋亡實現(xiàn)。

通過本研究驗證了TTM對H2O2誘導的PC12細胞損傷起保護作用，TTM有望成為SCI的潛在治療藥物，為尋找SCI的潛在治療靶點提供了依據(jù)，然而TTM抑制凋亡保護神經(jīng)細胞損傷的具體分子通路及藥物作用靶點尚待進一步研究。