李秋樺，夏體淵，任 禛*，裴 妍，尹 敏，陳澤斌，唐佐芯，字學(xué)慶

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214；2.云南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650091)

【研究意義】三七(Panaxnotoginseng)是中國(guó)重要的中藥材之一，有著“金不換”的美譽(yù)，它屬于五加科人參屬草本植物，云南文山是三七的原產(chǎn)地和主產(chǎn)地。三七具有極高的醫(yī)療價(jià)值，可以預(yù)防心腦血管疾病，降低三高以及消腫止痛等[1]。鑒于三七在中國(guó)中藥材中的重要地位，對(duì)其進(jìn)行生理生長(zhǎng)、抗病耐病等方面的研究具有重要意義。植物內(nèi)生菌在植物根、莖和葉等組織中廣泛存在，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[2-4]。大部分植物內(nèi)生菌不會(huì)使植物致病，并且可以與植物建立共生關(guān)系。在藥用植物中，內(nèi)生菌可以與植物協(xié)同進(jìn)化，產(chǎn)生與植物相同或相似的生物活性物質(zhì)[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生細(xì)菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，降低病蟲(chóng)害等諸多功能[6-9]。劉瑩等[5]運(yùn)用純培養(yǎng)法在三七植物組織中分離出11株內(nèi)生菌，并篩選出一株可以產(chǎn)皂苷的內(nèi)生菌株，經(jīng)鑒定為腸桿菌屬(Enterobacter)細(xì)菌。張玉潔等[10]對(duì)三七內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)三七體內(nèi)存在大量的內(nèi)生真菌資源，并且通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)可以得到眾多抗根腐病病原菌活性的菌株。沈永昶等[11]通過(guò)對(duì)三七內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了能夠抑制三七根腐病原菌的菌株，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)?？梢?jiàn)，三七內(nèi)含有豐富的內(nèi)生菌資源，并在抵抗病害等方面具有積極作用。對(duì)三七內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行多樣性研究，可為篩選促進(jìn)三七生長(zhǎng)以及增強(qiáng)其抗病性的優(yōu)良菌株奠定基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)三七內(nèi)生細(xì)菌多樣性的研究方式主要為純培養(yǎng)，應(yīng)用免培養(yǎng)技術(shù)的研究報(bào)道較少，三七中大部分內(nèi)生細(xì)菌還未被檢測(cè)到，限制了三七內(nèi)生細(xì)菌資源的開(kāi)發(fā)和利用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)云南文山三七根、莖和葉的內(nèi)生細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析。旨在全面揭示文山三七不同部位的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探究三七內(nèi)生細(xì)菌的生態(tài)功能以及互作機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2020年1月在云南省文山市新溝農(nóng)場(chǎng)采集的健康、無(wú)病蟲(chóng)害的三七植株，用清水洗凈表面泥土后備用。該地區(qū)海拔約1662 m，年平均氣溫16.4 ℃，平均降水量為1206.8 mm，平均日照約2056.2 h，經(jīng)緯度為104°5′40′′E，24°8′40′′N(xiāo)。

1.2 表面消毒

取新鮮健康的三七根、莖、葉，試驗(yàn)設(shè)置3組處理，每組樣本3個(gè)重復(fù)，葉部樣品標(biāo)記為(PNL)：PNLl、PNL2、PNL3；莖部樣品標(biāo)記為(PNS)：PNSl、PNS2、PNS3；根部樣品標(biāo)記為(PNR)：PNR1、PNR2、PNR3。在無(wú)菌條件下分別用蒸餾水進(jìn)行多次沖洗，再用70%乙醇浸泡3次，每次浸泡1 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～4次。隨后提取樣品的DNA。

1.3 基因組DNA提取

將消毒后的三七根、莖和葉放入液氮中迅速降溫，保護(hù)DNA不被破壞，然后根據(jù)TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。采用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA的濃度和純度，并分別加入超純水將DNA樣品濃度稀釋到1 ng/μL。

1.4 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

對(duì)樣品進(jìn)行16S rRNA基因V5～V7區(qū)的PCR擴(kuò)增，上下游引物分別為799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1193R(5′-ACGTCATCCCCACCTTC C-3′)，并引入接頭。擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.4 μL，補(bǔ)足ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)30次；最后在72 ℃延伸10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海美吉生物公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5 序列登錄

所有經(jīng)過(guò)重組和篩選的原始序列都存儲(chǔ)在NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中，葉部3次重復(fù)(PNLl、PNL2和PNL3)的登錄號(hào)分別為SRR12078548、SRR12078549和SRR12078550；莖部3次重復(fù)(PNSl、PNS2和PNS3)的登錄號(hào)分別為SRR12078551、SRR12078552和SRR12078553；根部3次重復(fù)(PNRl、PNR2和PNR3)的登錄號(hào)分別為SRR12078554、SRR12078555和SRR12078556。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七內(nèi)生細(xì)菌OTU及多樣性分析

如表1所示，三七根、莖和葉產(chǎn)生的原始序列在質(zhì)控后獲得V5～V7可變區(qū)的平均有效序列總數(shù)分別為24 334、18 094和22 064條，去除葉綠體和線粒體的序列數(shù)量之后，分別得到14 717、13 870和19 717條序列。同時(shí)按照97%相似性進(jìn)行歸類(lèi)，三七根、莖和葉獲得的可操作分類(lèi)單元(OTUs)的均值分別為385、206和226。通過(guò)單因素方差分析可以看出，三七3個(gè)部位的有效序列數(shù)差異不顯著，但葉部的細(xì)菌序列數(shù)量明顯高于其它部位，而OTU數(shù)量整體表現(xiàn)為根>葉>莖，且根部的OTU數(shù)量顯著高于其它部位。

Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果(表2)表明，三七根、莖和葉的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)無(wú)顯著性差異，但根部的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)值顯著高于葉部和莖部，說(shuō)明根部的微生物群落豐富度較高，物種種類(lèi)較多。此外，從Rank abundance曲線圖(圖1)可以看出，根部下降較緩，而莖部和葉部下降較快，說(shuō)明三七根部的內(nèi)生細(xì)菌豐富度較高，這與多樣性指數(shù)結(jié)果一致。

表1 三七不同部位的OTUs及相關(guān)序列指數(shù)

表2 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)

OTU稀釋曲線(圖2-A)結(jié)果表明，隨著測(cè)序深度的增加，OTU數(shù)量增幅變緩。同時(shí)，從Shannon指數(shù)稀釋曲線(圖2-B)結(jié)果可以看出，當(dāng)測(cè)序深度大于3000時(shí)，三七根、莖和葉的Shannon指數(shù)曲線逐漸趨平，說(shuō)明群落種類(lèi)的多樣性不再增加。此外，所測(cè)樣品的OTU覆蓋率均高達(dá)99%以上(表2)。綜合上述結(jié)果來(lái)看，3個(gè)樣本測(cè)序數(shù)量足夠，可真實(shí)反應(yīng)三七不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌群落的組成。

圖1 Rank abundance曲線圖Fig.1 Rank abundance curves

圖2 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌OTU稀釋曲線(A)和Shannon指數(shù)稀釋曲線(B)Fig.2 Rarefaction curves of the number of OTUs (A) and Shannon indexes (B) of bacterial endophyte communities detected in different parts of Panax notoginseng

2.2 ANOSIM分析

ANOSIM分析中Between為分組之間的差異，PNL、PNS、PNR分別代表葉、莖、根各自的組內(nèi)差異，縱坐標(biāo)刻度表示距離值。由ANOSIM分析(圖3)可以看出，P值為0.011<0.05，表示組間和組內(nèi)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，R值為0.6049>0，且接近1，說(shuō)明組間差異遠(yuǎn)大于組內(nèi)的差異，且組間具有顯著性差異。

2.3 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群體聚類(lèi)分析

采用主坐標(biāo)分析(PCoA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)對(duì)樣本進(jìn)行分組考察，對(duì)不同樣本內(nèi)生細(xì)菌群體進(jìn)行聚類(lèi)分析?；谒x距離矩陣進(jìn)行構(gòu)建PCoA圖(圖4-A)，結(jié)果顯示，三七根部的群落結(jié)構(gòu)相似性較高，能夠較好的聚集；葉部聚集性較低，群落結(jié)構(gòu)相似性有所差異；莖部較為散亂，說(shuō)明群落結(jié)構(gòu)相似性較低?；谖锓N豐度矩陣和樣本分組數(shù)據(jù)構(gòu)建的PLS-DA圖(圖4-B)，可以看出根、莖、葉各部位的計(jì)算結(jié)果均可以聚集在同一象限內(nèi)，能夠較好的區(qū)分，表明不同分組的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在組間產(chǎn)生了顯著差異，且在組內(nèi)具有較高的群落結(jié)構(gòu)相似性。

圖3 Anosim分析Fig.3 Anosim analysis

2.4 三七內(nèi)生細(xì)菌種群歸類(lèi)分析

排除不可分類(lèi)的細(xì)菌類(lèi)型后再進(jìn)行種群歸類(lèi)(表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌歸屬于16個(gè)門(mén)，27個(gè)綱，74個(gè)目，134個(gè)科，222個(gè)屬；莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌歸屬于12個(gè)門(mén)，20個(gè)綱，58個(gè)目，108個(gè)科，178個(gè)屬；根部?jī)?nèi)生細(xì)菌歸屬于19個(gè)門(mén)，24個(gè)綱，75個(gè)目，137個(gè)科，202個(gè)屬。從表3可以看出，三七不同部位的內(nèi)生細(xì)菌在門(mén)、綱、目、科和屬等分類(lèi)階元上的數(shù)量明顯不同，但在各階層呈現(xiàn)的規(guī)律較為一致，整體表現(xiàn)為根>葉>莖，這與三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌的OTU數(shù)結(jié)果(表1)指向一致。

2.5 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌在不同分類(lèi)水平的群落組成分析

2.5.1 OTU水平分析 Venn圖可以直觀比較三七根、莖和葉樣品的OTU組成相似性和重疊情況。基于Venn圖分析(圖5)，三七根、莖和葉樣品的全部細(xì)菌OTU數(shù)為877個(gè)，其中共有的OTU數(shù)目為167個(gè)，約占全部的19.04%，這些OTU主要由放線菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)組成。根部獨(dú)有的OTU數(shù)目較多，約占全部的32.61%；葉部次之，約占全部的18.36%；莖部獨(dú)有的OTU數(shù)目較少，約占全部的9.46%。由此可以看出，莖部與其它部位的細(xì)菌的OTU數(shù)量差異區(qū)別較大，且明顯低于其它部位。

圖4 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落PCoA圖(A)和PLS-DA圖(B)Fig.4 The PCoA (A) and PLS-DA (B) analysis of endophytic bacterial community in different parts of Panax notoginseng

表3 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌在各分類(lèi)階層的總數(shù)

2.5.2 門(mén)水平分析 三元相圖(圖6)可以直觀的反映三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌在門(mén)水平上的分布比重和關(guān)系，圖中每個(gè)圓圈代表不同細(xì)菌屬，圓圈顏色相同表示屬于同一個(gè)門(mén)。結(jié)果顯示放線菌門(mén)(Actinobacteria)在三七葉部的分布比重較高，變形菌門(mén)(Proteobacteria)在三七莖部和根部的分布比重較高。同時(shí)，可歸類(lèi)門(mén)水平的群落多樣性(圖7)表明，在三七葉部豐度水平前5的菌門(mén)為放線菌門(mén)(Actinobacteria，52.78%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria，38.87%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，6.92%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，0.66%)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria，0.51%)；在莖部豐度水平前5的菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria，69.77%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria，22.78%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，6.38%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，0.45%)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria，0.34%)；在根部豐度水平前5的菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria，78.99%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria，14.12%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，2.42%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria，1.23%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，0.82%)。從上述結(jié)果可以看出，三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)型相同，但各優(yōu)勢(shì)門(mén)在各部位內(nèi)生細(xì)菌總量的占比并不相同。

圖5 OTU水平的Venn圖分析Fig.5 Venn analysis on OTU level

圖6 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落在門(mén)水平上的三元相圖Fig.6 Ternary analysis of endophytic bacterial community atphylum level in different parts of Panax notoginseng

圖7 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落在門(mén)水平上的群落多樣性分析圖Fig.7 Community diversity analysis of endophytic bacterial community atphylum level in different parts of Panax notoginseng

2.5.3 屬水平分析 三元相圖(圖8)結(jié)果可以反映不同細(xì)菌屬在三七不同部位中的分布差異，圖中每個(gè)圓圈代表不同細(xì)菌種，圓圈顏色相同表示屬于同一個(gè)屬。其中Cutibacterium在三七葉部的分布比重較高；假單胞菌屬(Pseudomonas)在三七莖部的分布比重較高；Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia和埃希氏-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)在三七根部的分布比重較高。從歸類(lèi)屬水平的群落多樣性(圖9)顯示，三七葉部豐度水平前5的菌屬為Cutibacterium(28.70%)、勞爾氏菌屬(Ralstonia，14.57%)、紅球菌屬(Rhodococcus，12.34%)、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(11.94%)和甲基桿菌屬(Methylobacterium，4.63%)；莖部豐度水平前5的菌屬為假單胞菌屬(Pseudomonas，45.50%)、紅球菌屬(Rhodococcus，6.75%)、鏈霉菌屬(Streptomyces，5.20%)、勞爾氏菌屬(Ralstonia，4.13%)和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(3.78%)；根部豐度水平前5的菌屬為Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(24.78%)、埃希氏-志賀菌屬(Escherichia-Shigella，21.94%)、鮑特菌屬(Bordetella，5.23%)、鏈霉菌屬(Streptomyces，5.13%)和不動(dòng)桿菌屬(Acidibacter，3.91%)。可見(jiàn)，三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬種類(lèi)有明顯差異，僅Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia為3者共有的優(yōu)勢(shì)屬，但該屬在不同部位的豐度占比不同，同時(shí)也可以看出三七根部與其它部位的優(yōu)勢(shì)屬種類(lèi)差異較大。

2.6 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取在屬水平中豐富度位于前20且可進(jìn)行分類(lèi)的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并以環(huán)形圖(圖8)的形式呈現(xiàn)物種的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化關(guān)系。圖中每條線代表一個(gè)屬，線條長(zhǎng)度為物種差異距離，線條顏色相同則表示屬于同一個(gè)門(mén)。圖中綠色為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，該門(mén)有3個(gè)屬，且物種差異程度較??；紅色為放線菌門(mén)(Actinobacteria)，該門(mén)有5個(gè)屬，且進(jìn)化距離較近；紫色為變形菌門(mén)(Proteobacteria)，該門(mén)有12個(gè)屬，且部分屬的物種差異程度較大。

2.7 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落的功能預(yù)測(cè)分析

使用COG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)(圖9)，在不同部位中共獲得了23個(gè)功能分組，但豐度隨部位的不同而異。在三七內(nèi)部，豐度較高的微生物群落功能為：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝功能(Amino acid transport and metabolism，8.59%～9.07%)、轉(zhuǎn)錄功能(Transcription，7.33%～8.01%)、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換功能(Energy production and conversion，7.12%～7.35%)和無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸與代謝功能(Inorganicion transport and metabolism，6.10%～6.53%)。另外，葉部具有碳水化合物運(yùn)輸和代謝(Carbohydratetransport and metabolism)功能的細(xì)菌豐度較高；莖部具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction mechanisms)功能的細(xì)菌豐度較高；根部能夠合成細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等物質(zhì)(Cell wall/membrane/envelopebiogenesis)功能的細(xì)菌豐度較高。

圖8 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落屬水平的三元相圖Fig.8 Ternary analysis of endophytic bacterial community at genus level in different parts of Panax notoginseng

圖9 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落屬水平的群落多樣性分析Fig.9 Community diversity analysis of endophytic bacterial community at genus level in different parts of Panax notoginseng

3 討 論

3.1 高通量測(cè)序技術(shù)在植物內(nèi)生細(xì)菌研究中的應(yīng)用

植物內(nèi)生菌廣泛存在于植物的各個(gè)器官和組織中，是植物體內(nèi)的正常菌群，包括眾多的互惠共生細(xì)菌，它們不僅不會(huì)使植物受到傷害，還可以在植物的生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-14]，所以對(duì)植物內(nèi)生菌的研究與開(kāi)發(fā)尤為重要。目前，在植物內(nèi)生菌多樣性的研究中運(yùn)用較多的方法是高通量測(cè)序法，該技術(shù)具有信息量大、可靠性高等優(yōu)點(diǎn)[15-18]，與純培養(yǎng)相比可以獲得較為全面的生物種群信息，并且可準(zhǔn)確的反映植物內(nèi)生微生物的種類(lèi)組成和真實(shí)比例[19]。張愛(ài)梅等[20]對(duì)榆中縣中國(guó)沙棘種子內(nèi)生細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究時(shí)，采用純培養(yǎng)的方法僅得到3個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌，而采用高通量測(cè)序得到68個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌。劉曉靜等[21]對(duì)庫(kù)車(chē)小白杏內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序，共檢測(cè)出94個(gè)屬，而采用純培養(yǎng)的方法僅分離獲得28個(gè)屬的菌株。符玉松[22]采用高通量測(cè)序技術(shù)在菖蒲的根部檢測(cè)到56個(gè)科的細(xì)菌類(lèi)型，而采用純培養(yǎng)法分離僅得到12個(gè)科的細(xì)菌種類(lèi)?？梢?jiàn)，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)可以克服純培養(yǎng)的不足，能夠更準(zhǔn)確全面地檢測(cè)到植物內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)。

圖10 物種環(huán)形進(jìn)化樹(shù)圖Fig.10 Phylogenetic tree

圖11 COG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)柱狀圖Fig.11 COG function classification

3.2 三七內(nèi)生細(xì)菌在不同部位的分布特征

采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)文山三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌，在三七根、莖、葉組織中分別獲得了385、206和226個(gè)OTU，其中共有的OTU數(shù)為167個(gè)，占比19.04%。此外，Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果表明三七各部位中均含有豐富的內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)，其中根部的群落豐富度較高，莖部和葉部較低。眾多研究表明，內(nèi)生菌的群落多樣性受多種因素的影響，同一植物不同部位的內(nèi)生菌亦有差異。林麗等[23]應(yīng)用高通量測(cè)序法檢測(cè)煙草不同部位內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)不同部位的Alpha多樣性指數(shù)為莖>根>葉，呈現(xiàn)明顯的器官差異性。鄧平香等[24]研究2種生態(tài)型東南景天莖、葉內(nèi)生細(xì)菌多樣性，結(jié)果均表現(xiàn)出葉>莖，呈現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌多樣性因部位不同而異。沙月霞[25]研究水稻不同部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)寧夏水稻品種寧粳43號(hào)葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落的豐富度、群落多樣性明顯較高，莖部次之，根部的多樣性水平較低。

通過(guò)高通量測(cè)序分析鑒定出三七葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌歸屬于16個(gè)門(mén)，27個(gè)綱，74個(gè)目，134個(gè)科，222個(gè)屬；莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌歸屬于12個(gè)門(mén)，20個(gè)綱，58個(gè)目，108個(gè)科，178個(gè)屬；根部?jī)?nèi)生細(xì)菌歸屬于19個(gè)門(mén)，24個(gè)綱，75個(gè)目，137個(gè)科，202個(gè)屬，呈現(xiàn)出三七各部位的內(nèi)生細(xì)菌在不同分類(lèi)階元上的數(shù)量為根>葉>莖。在門(mén)水平上，各部位的優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)型相同，但豐度不同；在屬水平上，各部位的優(yōu)勢(shì)類(lèi)型均有差異，但不同部位仍具有相同的優(yōu)勢(shì)類(lèi)型。其中，紅球菌屬(Rhodococcus)為三七葉部和莖部的優(yōu)勢(shì)屬，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，該屬菌在工業(yè)合成轉(zhuǎn)化中有廣泛應(yīng)用，且在預(yù)防環(huán)境污染以及環(huán)境治理等生物技術(shù)上有很廣闊的應(yīng)用前景[26]。鏈霉菌屬(Streptomyces)為三七根部和莖部的優(yōu)勢(shì)屬，該菌屬的細(xì)菌能夠產(chǎn)生抗生素和植物生長(zhǎng)激素類(lèi)物質(zhì)，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高抗逆性等方面發(fā)揮重要作用[27]。因此，在三七不同部位存在一定的功能菌株，具有一定的研究利用價(jià)值。

3.3 三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落功能差異

在三七根、莖、葉中既發(fā)現(xiàn)了相同物種又發(fā)現(xiàn)了特有物種，可能是由于土壤中的微生物通過(guò)根部進(jìn)入植物體內(nèi)，部分微生物向上輸送到莖部以及葉部，同時(shí)葉部可以通過(guò)氣孔和葉片表皮毛等讓葉圍的微生物進(jìn)入植物體內(nèi)，部分微生物可以向下輸送至其它部位，使得根、莖和葉有著相同的物種，但由于后期不同部位周?chē)h(huán)境的不同，導(dǎo)致出現(xiàn)特有物種[25]；植物莖部與外界微生物的交換能力較弱，可能是該部位內(nèi)生細(xì)菌較少的主要原因。三七內(nèi)生細(xì)菌參與植物組織中物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄等。葉部參與各種功能活動(dòng)的物種豐度最高，其碳水化合物運(yùn)輸和代謝功能優(yōu)于其它部位，可以推測(cè)由于葉部進(jìn)行光合作用產(chǎn)生的有機(jī)物需要向莖部和根部輸送，所以葉部該功能物種豐度較高；根部參與各種功能活動(dòng)的物種豐度較高，其產(chǎn)生細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等物質(zhì)的功能優(yōu)于其它部位，可能由于根部細(xì)胞壁為土壤與植物的交界面,是抵御重金屬脅迫、土傳病害侵入以及修復(fù)調(diào)控過(guò)程的關(guān)鍵部位，所以根部該功能物種豐度較高；莖部參與各種功能活動(dòng)的物種豐度較低，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能優(yōu)于其它部位，可以推測(cè)由于莖部是信號(hào)傳輸、營(yíng)養(yǎng)輸送上通下達(dá)的必經(jīng)之路，所以莖部該功能物種豐度較高。

4 結(jié) 論

首次采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三七不同部位的內(nèi)生細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，并對(duì)各部位內(nèi)生細(xì)菌在不同分類(lèi)水平的群落組成進(jìn)行探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七根、莖和葉部位中均含有豐富的內(nèi)生細(xì)菌，且不同部位的豐度不同，整體表現(xiàn)為根>葉>莖。此外，在三七不同部位中發(fā)現(xiàn)部分優(yōu)勢(shì)屬細(xì)菌具有一定的功能作用，可進(jìn)行后續(xù)的開(kāi)發(fā)與利用。三七內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的代謝以及調(diào)控等方面均發(fā)揮積極作用，對(duì)其進(jìn)一步的研究尤為重要。三七不同部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性的研究結(jié)果為后續(xù)篩選生防菌株奠定基礎(chǔ)。