李蔣偉，侯生珍，王志有，桂林生

(青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016)

【研究意義】反芻動物腸道微生物菌群對飼料營養(yǎng)的消化、吸收、代謝和免疫反應等生理活動均具有較強干預。腸道微生物多樣性是促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機體免疫和新陳代謝的基礎(chǔ)，其多樣性變化極易對宿主免疫產(chǎn)生影響[1]。腸道微生物不僅阻止外界病菌的侵入, 從而維持腸道屏障的完整性并促進宿主免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育[2]，也能夠誘導T淋巴細胞的分化和調(diào)節(jié)早期B淋巴細胞的發(fā)育。羅海霞等[3]研究灘寒雜交健康羔羊和腹瀉羔羊腸道微生物群落表明，腹瀉羔羊腸道中變形菌門顯著高于健康羔羊；擬桿菌門、藍細菌門、黏膠球形菌門和無壁細菌門在腹瀉羔羊中的含量顯著低于健康羔羊；且其微生物豐度及優(yōu)勢微生物都具有顯著的差異；進一步佐證了腸道菌群結(jié)構(gòu)對機體健康的重要影響。在藏羔羊斷奶早期，其消化道微生物菌群處于不穩(wěn)定且脆弱的狀態(tài)，在此階段調(diào)整飼糧精粗比可影響其生產(chǎn)性能和機體消化代謝。【前人研究進展】李沖等[4]研究表明：對新生湖羊羔羊進行21日齡斷奶處理，相較于對照組(未斷奶)空腸微生物α多樣性指數(shù)(Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)等)有升高的趨勢,但對空腸回腸β多樣性指數(shù)無顯著性差異。一些研究表明，消化道微生物群落過早發(fā)育，高度多樣化和豐富的菌群可能對幼齡反芻動物腸道健康和免疫功能產(chǎn)生負面影響[5]；理論上，腸道微生物群落的高度多樣性有利于抵御外界環(huán)境變化[6]，且在幼齡反芻動物上腸道微生物群落有隨著日齡增加的趨勢[7]，所以大部分研究證實腸道菌群多樣性有益宿主健康，并認為菌群豐度的逐漸增加是腸道微生物群發(fā)育成熟的標志[8]。【本研究切入點】本試驗通過采用不同精粗比飼糧對早期斷奶藏羔羊小腸細菌群進行干預，篩選出適宜早期斷奶藏羔羊小腸細菌群定植的飼糧結(jié)構(gòu)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】此研究為探尋其健康高效的飼養(yǎng)條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

動物飼養(yǎng)試驗于2019年5月15日至2019年8月25日在青海省海南州共和縣切吉鄉(xiāng)哇合村青海香咔梅朵牧業(yè)有限公司進行；2019年8月20日食靡樣品交由百邁克生物科技公司進行腸道微生物16S rDNA基因的測序工作。

1.2 設計及飼養(yǎng)管理

選擇健康、體況相近且體重無顯著差異(P<0.05)的90日齡早期斷奶藏羊母羔共210只，隨機分成7組，每組30只。7組羔羊分別飼喂精粗比為80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70和20∶80的飼糧；飼糧精粗比為干物質(zhì)比，飼糧中精飼料完全一致，粗飼料由燕麥青干草與燕麥青貯按干物質(zhì)比例1∶1混合而成。飼養(yǎng)試驗預飼期為10 d，正試期為90 d。精飼料組成及營養(yǎng)水平如表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗羔羊全舍飼分欄飼養(yǎng)，分別于8:30和16:30飼喂羔羊2次，飼糧自由采食，自由飲水，每天飼喂前清掃殘留飼料并稱重。每天中午12:30定期清掃羊舍，保持羊舍衛(wèi)生、通風和干燥，每周對羊舍和運動場進行兩次消毒殺菌。試驗期對羔羊進行羊四聯(lián)、小反芻獸、口蹄疫和羊痘等疫苗的免疫注射，分別用伊維菌素和溴氰菊酯淋浴進行內(nèi)外寄生蟲防治。

1.4 樣品采集和處理

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每組中隨機抽取3只羔羊于清晨空腹屠宰，在小腸段取食靡于5 mL凍存管中，混勻后投入液氮，于實驗室-80 ℃冷凍保存。

1.5 小腸細菌微生物分析方法

本實驗16SrDNA高通量測序部分交由百邁客生物科技有限公司測定，對采集到的21個小腸食靡樣品基于Illumina HiSeq 測序平臺，采用雙末端測序(Paired-End)的方法，構(gòu)建小片段文庫進行測序，進一步對Reads拼接過濾，OTUs聚類分析，物種注釋及豐度分析。提取羔羊瘤胃微生物基因組DNA，根據(jù)保守區(qū)設計得到引物，其中通用引物正向：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，反向：3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’。在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫進行高通量測序，進而得到原始圖像數(shù)據(jù)文件。PCR擴增步驟為：模板DNA經(jīng)加熱至98 ℃左右持續(xù)2 min，輪回30次循環(huán)，依次經(jīng)過98 ℃×30 s、50 ℃×30 s、72 ℃×1 min，最后于72 ℃下延長7 min。

表1 精飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2019整理初始數(shù)據(jù)，用SPSS20.0中的one-way ANOVA進行單因素方差分析，檢測結(jié)果用平均值±標準誤(Mean±SE)的形式表示，差異顯著的評斷標準為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

21個樣品測序共獲得 1679 801 對Reads，雙端 Reads拼接、過濾后共產(chǎn)生 1260 603條Clean tags，每個樣品至少產(chǎn)生43 023 條Clean tags，平均產(chǎn)生 60 029 條Clean tags，被分配至944個分類操作單元(OTUs)，有909個為共有OTUs(圖1)。本試驗覆蓋率大于99%表明測序深度能夠準確反映羔羊小腸細菌微生物組成。

2.2 Alpha多樣性分析

由表2可以看出，Shannon指數(shù)各處理組間并無顯著性差異(P>0.05)；Simpson指數(shù)A、D組顯著高于其余各處理組(P<0.05)；Ace、Chao1指數(shù)變化趨勢相似，E組顯著高于其余各處理組(P<0.05)。

2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性組間差異分析的箱形圖可以直觀的反應組內(nèi)樣本相似性的中位數(shù)，離散程度，最大值，最小值，異常值等，從而分析組間物種Beta多樣性差異是否顯著。由圖2可知,各處理組間和組內(nèi)Beta多樣性沒有明顯差異(P>0.05)。

2.4 不同精粗比小腸細菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 門水平下小腸細菌菌群結(jié)構(gòu)差異分析 對門水平細菌分布前十菌群門類進行顯著性分析，將豐度小于1%的菌門歸為其他(Others)。如表3和圖3所示：各處理組優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)，其豐度均大于30.7%，且C組遠高于其余各組(P<0.05)，達到了49.53%；酸桿菌門(Acidobacteria)有隨著精粗比降低而降低的趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)；F組厚壁菌門(Firmicutes)豐度顯著高于其余各處理組(P<0.05)；A、D組軟壁菌門(Tenericutes)豐度顯著高于其余各組(P<0.05)；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)分布趨勢相似，均為C組顯著高于其余各組(P<0.05)，且隨著精粗比變化有先升高后降低的趨勢。

表2 阿爾法多樣性指數(shù)

2.4.2 科水平下瘤胃細菌分布分析 如表4和圖4所示：鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)為優(yōu)勢菌科，且C組豐度高于其余各處理組(P<0.05)；支原體科(Mycoplasmataceae)各處理組無顯著差異(P>0.05)，但A、B組分別有個體支原體菌科占據(jù)小腸細菌90%以上；A組Pyrinomonadaceae最高(P<0.05),且有隨精粗比降低而豐度下降的趨勢；黃色桿菌科(Xanthobacteraceae)F組顯著高于其余各處理組(P<0.05)；毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)E組高于其余各組(P<0.05)，芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)和噬幾丁質(zhì)菌科(Chitinophagaceae)的豐度隨著精粗比的增高，且在C組時達到最高值(P<0.05)。

表3 門水平下細菌相對含量

表4 科水平下細菌相對含量

2.5 KEGG分析

由圖5可知，小腸細菌功能基因集中于46個代謝途徑，其中：在氨基酸代謝方面，C組相較其余處理組最高(8.12%)；碳水化合物代謝方面，各處理組差別不大，但均大于9%；生物膜轉(zhuǎn)運方面，有隨著精粗比降低而升高的趨勢；翻譯方面，E組高于其余處理組50%；其余途徑各處理組無較大差異。

3 討 論

3.1 飼糧精粗比對小腸細菌多樣性的影響

飼糧結(jié)構(gòu)的變化導致其可消化程度產(chǎn)生差異，從而影響腸道微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)及功能的變化[9]。消化道微生物是保證反芻動物正常消化功能的潤滑劑，除品種、健康狀況及生活環(huán)境和環(huán)境中共生微生物的群體效應外，飼糧結(jié)構(gòu)是影響其健康的重要人為可控因素[10-11]。在藏羔羊斷奶早期復胃發(fā)育不健全時，腸道擔任養(yǎng)分消化的主要角色，失衡的腸道菌群則會因為對動物機體的調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，進而產(chǎn)生一系列的與腸道微生態(tài)失衡相關(guān)慢性或內(nèi)分泌紊亂的并發(fā)癥[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ace指數(shù)和Chao1均為精粗比40∶60組顯著高于其余處理組，證明在此飼糧結(jié)構(gòu)下腸道菌群豐富度較高；但Beta多樣性各處理組并無顯著差異，與尹福泉[13]等研究結(jié)果一致。門水平上，各處理組的優(yōu)勢菌門均為變形菌門(大于30.7%)，大量研究表明變形菌門能反應腸道微生態(tài)失調(diào)或不穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)；酸桿菌門在高精料條件下廣泛存在(80∶20、70∶30、60∶40)，厚壁菌門則隨著精粗比降低豐度明顯增加；二者共同構(gòu)成了小腸的次優(yōu)勢菌門；這與胡丹丹[14]、吳兆海[15]等等對不同精粗比下奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)變化研究結(jié)果相似?？扑缴?，鞘脂單胞菌科為各處理組優(yōu)勢菌群(大于3.72%)，且精粗比60∶40組顯著高于其余各組約100%；精粗比80∶20、70∶30組中有個體支原體科豐度占到90%以上，可能精粗比例過高導致小腸微生物菌群失調(diào)，還未在個體健康水平上表現(xiàn)出來，其致病機理還需進一步研究；芽單胞菌科和噬幾丁質(zhì)菌科的豐度隨著精粗比的增高，且在精粗比60∶40時達到最高值。本實驗結(jié)果與其他研究者在反芻動物腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)存在差異，可能是藏羊處于高海拔高寒地區(qū)，且舍飼育肥方式相對傳統(tǒng)放牧模式在近幾年才逐漸推廣，在試驗所用飼糧結(jié)構(gòu)下表現(xiàn)出上述情況。

3.2 飼糧精粗比對小腸細菌功能的影響

腸道菌群結(jié)構(gòu)對機體的生理功能、免疫功能、酶代謝等方面有一定影響[16]。阿日查等[17]對內(nèi)蒙古錫林郭勒冬季放牧蒙古牛腸道微生物進行功能預測分析發(fā)現(xiàn)放牧蒙古牛腸微生物與分子、糖的生成和代謝等基礎(chǔ)生命功能有關(guān)。說明各月份樣品雖然都具有相同的功能，但是由于每個月份的樣品中所含微生物的種類和數(shù)量有區(qū)別，所以各月份的效能存在差異。王柏輝等[18]研究不同飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)腸道中細菌微生物代謝主要包括了10種代謝途徑；其中代謝活躍度較高的有能量的產(chǎn)生和運輸、氨基酸代謝和運輸、碳水化合物代謝和運輸、轉(zhuǎn)采、核糖體合成和翻譯、DNA復制和重組及修復和無機鹽代謝和運輸；其中氨基酸代謝、碳水化合物代謝、轉(zhuǎn)錄和DNA復制等代謝在舍飼羊中較活躍。本研究表明：在不同精粗比飼糧影響下，各處理組小腸微生物基因功能存在差異，尤其是在氨基酸和碳水化合物代謝方面，其變化趨勢與理論一致；在此特定試驗條件下，各處理組也出現(xiàn)了具有抗菌、抗腫瘤、耐藥等功能的微生物基因，其有效提取和作用機理機制有待下一步工作探究。

4 結(jié) 論

利用基于ITS高通量測序技術(shù)對小腸微生物基因測序，探索了不同精粗比飼糧腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)變化。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧精粗比，小腸微生物多樣性和豐度均呈現(xiàn)不同程度變化，群落組成與結(jié)構(gòu)也有相應的變化；強調(diào)了小腸微生物在早期斷奶藏羔羊營養(yǎng)和腸道微生態(tài)學中的重要作用，為了解不同精粗比飼糧下早期斷奶藏羔羊小腸微生物群的動態(tài)關(guān)系提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。