楊漫宇,王 琴,唐宗祥，楊恩年*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，四川 成都 610066；2.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，四川 成都 611130)

【研究意義】小麥(TriticumaestivumL.，AABBDD，2n=6x=42)作為人類最重要的口糧，是世界上種植面積最大的糧食作物之一。近年來，審定并推廣的小麥品種所用親本往往集中在少數(shù)幾個骨干親本，品種的遺傳背景逐漸單一，品種間同質(zhì)化現(xiàn)象日趨明顯，導(dǎo)致其抗病蟲害、抗逆性的能力嚴重下降[1]。2019—2020年的四川省小麥區(qū)試中，由于條銹病生理小種發(fā)生了變化，往年抗病的骨干親本川麥104 及其衍生品種都表現(xiàn)為感病。因此，拓寬遺傳基礎(chǔ)是突破當前小麥育種水平的關(guān)鍵因素。而利用小麥-異源易位染色體和小麥自生易位染色體進行小麥育種，是拓寬小麥遺傳變異的重要途徑之一[2]?！厩叭搜芯窟M展】據(jù)報道，許多歐洲小麥品種含有5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體，這對相互易位染色體是小麥5B和7B染色體斷裂重組而成，研究發(fā)現(xiàn)該易位染色體的抗白粉病、抗條銹病以及對歐洲氣候的適應(yīng)性等優(yōu)良特性使得它們廣泛存在于歐洲小麥品種中[3-4]。利用攜帶5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體的材料培育出含該相互易位染色體的優(yōu)良小麥品種在四川還比較少，目前只有四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所小麥新材料課題組成功培育出了新品種，如：川麥55[5]、川麥62[6-7]和川麥88(未發(fā)表數(shù)據(jù))。表明染色體易位重組能產(chǎn)生有益性狀，為小麥育種改良提供新的遺傳變異。而熒光原位雜交是用于研究小麥及其近緣種屬染色體結(jié)構(gòu)變異的有效方法。尤其是近年來發(fā)展起來的基于寡核苷酸探針的非變性熒光原位雜交(non-denaturing florescence in situ hybridization,ND-FISH)技術(shù)，可以快速、準確和規(guī)?；瘷z測小麥染色體的結(jié)構(gòu)變異。Tang等[8]和Fu等[9]開發(fā)了可用于ND-FISH檢測的寡核苷酸探針Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2，這2種探針的結(jié)合取代了重復(fù)DNA序列pSc119.2和pTa-535的作用，成功鑒定了普通小麥的21條染色體。Jiang等[10]以O(shè)ligo-pSc119.2-1,Oligo-pTa535-1和Oligo-(GAA)6作為探針進行ND-FISH分析，對83份1RS.1BL易位品種(系)、1份小麥-黑麥1RS·1AL易位品種Amigo和普通春小麥中國春的染色體結(jié)構(gòu)進行了研究。Liu等[11]利用ND-FISH技術(shù)評價了76個具有代表性的小麥主產(chǎn)區(qū)品系的遺傳多樣性。因此，相較于傳統(tǒng)FISH檢測的費時費力，ND-FISH技術(shù)簡便，可用于小麥染色體的高通量鑒定。【本研究切入點】小麥品種川麥42和川麥55由四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所選育，分別于2004和2009年審定。川麥42為人工合成小麥，川麥55除了含有5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體外，還含有小麥-黑麥1RS.1BL易位染色體[5]。1RS·1BL易位染色體含有一系列優(yōu)異基因，被廣泛應(yīng)用于小麥育種[12-13]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了更好地將5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體應(yīng)用于小麥育種，本研究利用高通量的ND-FISH技術(shù)對來自川麥42×川麥55的高代重組自交系F6群體進行鑒定，分析5BS·7BS/5BL·7BL相互易位對后代染色體的影響及對農(nóng)藝性狀的影響，以期為這對易位染色體在育種和生產(chǎn)中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究以小麥品種川麥42為母本，川麥55為父本進行簡單有性雜交，再通過單粒傳法構(gòu)建高代重組自交系，獲得包括200個株系的F6RIL群體。

1.2 ND-FISH分析

分別對親本川麥42、川麥55和來自于川麥42/川麥55雜交組合的200個F6RIL株系進行ND-FISH分析，每個材料選取5粒種子。種子萌發(fā)、根尖預(yù)處理、固定以及染色體制備參照Han等[14]描述的方法。寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1和Oligo-(GAA)7由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列詳見表1，具體標記按照 Tang 等[8]描述的方法。分別在探針Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1和Oligo-(GAA)7的5′端用6-carboxyfluorescein(6-FAM)、6-carboxytetramethylrhodamine(Tamra)和cyanidin 5(Cy5)進行標記。非變性原位雜交(ND-FISH)程序參照Fu等[9]描述的方法。染色體用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)進行染色，使用德國徠卡熒光顯微鏡DM4B進行圖像采集。

1.3 農(nóng)藝性狀及田間抗條銹病調(diào)查

條銹病抗性鑒定：2017年在成都市新都區(qū)四川省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園種植川麥42、川麥55及其RIL群體。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，2次重復(fù)，每個株系種植1行，行長1.5 cm，行距25.0 cm。采用條銹病生理小種條中30號、條中31號、條中32號及水源11的混合菌種接種誘發(fā)材料川育12，菌種由甘肅省農(nóng)科院植物保護研究所賈秋珍提供，待充分發(fā)病時記載嚴重度。

表1 寡核苷酸探針序列

農(nóng)藝性狀調(diào)查：2018年在相同地點采用相同的種植方式進行農(nóng)藝性狀調(diào)查。出苗后勻單株；苗期進行化學除草，中后期施藥防治蚜蟲和條銹病；成熟后，每個株系隨機收獲5個單株進行株高、分蘗、小穗數(shù)和千粒重測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本核型分析

以O(shè)ligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1寡核苷酸探針對親本川麥42(CM42)和川麥55(CM55)根尖有絲分裂中期染色體進行ND-FISH分析，建立標準核型，便于后代中各染色體的識別。川麥42含有正常1B、5B和7B染色體(圖1-A、圖1-B)，川麥55含有1RS·1BL和5BS·7BS/5BL·7BL易位染色體(圖1-C、圖1-D)。此外，雙親的5A、3B、3D和4D染色體存在差異(圖1-B、圖1-D)。5ACM42染色體不含Oligo-pSc119.2-1探針信號帶，5ACM55染色體長臂和短臂各含1條Oligo-pSc119.2-1探針信號帶；3BCM42染色體短臂末端含有1條Oligo-pSc119.2-1探針信號帶，3BCM55染色體短臂末端含2條Oligo-pSc119.2-1探針信號帶；3DCM42染色體短臂末端含有1條較強的Oligo-pSc119.2-1探針信號帶，3DCM55染色體短臂末端不含該信號帶；4DCM42染色體長臂末端含有較強的Oligo-pTa535-1探針信號帶，4DCM55相同位置不含該信號帶。

2.2 易位染色體分布及染色體結(jié)構(gòu)變異事件

每個自交系隨機選取5粒種子利用Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1寡核苷酸探針進行ND-FISH分析。200個自交系中，15份無鑒定結(jié)果，剩余185份根據(jù)1RS·1BL和5BS·7BS/5BL·7BL易位染色體的有無進行統(tǒng)計，純合株系共142份含4種類型：1B和5B/7B(圖2-A)、1RS·1BL和5B/7B(圖2-B)、1B和5BS·7BS/5BL·7BL(圖2-C)、1RS·1BL和5BS·7BS/5BL·7BL(圖2-D)，分別含有43、30、35和32個株系(表2)。此外，還發(fā)現(xiàn)2個含變異染色體的株系17y456和17y588。17y456和17y588兩者染色體數(shù)目均為2n=42，在遺傳上已經(jīng)穩(wěn)定。株系17y456除了含有川麥55中的1RS·1BL，5BS·7BS/5BL·7BL易位染色體，還發(fā)現(xiàn)3B和5A相互易位染色體，即3BS·5AS/3BL·5AL易位染色體(圖3)。株系17y588含有5BS·7BS/5BL·7BL易位染色體以及1對結(jié)構(gòu)變異的4DChanged染色體，與雙親的正常4DNormal染色體相比，該4DChanged染色體的長臂末端出現(xiàn)了極強的Oligo-pSc119.2-1綠色信號(圖4)。

2.3 易位染色體對農(nóng)藝性狀的影響

為評價1RS.1BL、5BS.7BS/5BL·7BL易位染色體對農(nóng)藝性狀的影響，研究對142份純合株系的株高、分蘗、小穗和千粒重進行統(tǒng)計分析。4種類型株系的株高、分蘗、小穗數(shù)和千粒重在0.05水平上均沒有顯著差異(表2)。說明，1RS·1BL、5BS·7BS/5BL·7BL易位染色體對株高、分蘗、小穗數(shù)和千粒重沒有不良影響。

表2 不同染色體類型對農(nóng)藝性狀的影響

表3 含染色體結(jié)構(gòu)變異的株系與親本川麥42和川麥55的農(nóng)藝性狀比較

比較2份含染色體結(jié)構(gòu)變異的株系與親本川麥42和川麥55的農(nóng)藝性狀(表3)，發(fā)現(xiàn)17y456的株高90.40 cm，與川麥42(88.00 cm)沒有顯著差異，但顯著高于川麥55(77.60 cm)；分蘗數(shù)5.00個，顯著低于川麥42(9.60個)和川麥55(10.20個)；小穗數(shù)20.40個，與川麥42(19.60個)沒有顯著差異，顯著低于川麥55(22.80個)；千粒重50.20 g，顯著低于川麥42(61.60 g)，顯著高于川麥55(44.20 g)。17y588的株高53.60 cm，顯著低于川麥42和川麥55；分蘗數(shù)9.60個，與川麥42和川麥55沒有顯著差異；小穗數(shù)20.80個，與川麥42無顯著差異，顯著低于川麥55；千粒重40.20 g，顯著低于川麥42和川麥55。此外，17y456和17y588的條銹病嚴重度分別為5和0，高抗條銹病，顯著低于親本川麥42和川麥55的嚴重度100和20，在條銹病抗性方面得到了顯著性提高和改善。綜上，17y456和17y588中的染色體結(jié)構(gòu)變異對產(chǎn)量相關(guān)性狀無明顯的不良影響，但高抗條銹病，可以應(yīng)用于小麥抗病育種改良。

3 討 論

5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體在20世紀60—70年代普遍存在于西歐小麥中,如Bersee和Cappelle-Desprez[15]。Badaeva等[4]對來自歐洲、亞洲及美國等37個國家的460份小麥和39份小黑麥材料進行分析，發(fā)現(xiàn)9份法國面包小麥品種攜帶了5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體。在來自于英國小麥基因庫的538個小麥株系中，66%的材料含有5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體[16]。另外，Badaeva等[4]提到其他學者至少鑒定了16個攜帶了這對易位染色體的小麥品種。有學者認為，5BS·7BS/5BL·7BL相互易位的5BS染色體臂上攜帶的條銹病成株抗性基因[3,17]及其對歐洲氣候的適應(yīng)性[4]是該相互易位染色體普遍存在于西歐小麥中的重要因素。楊漫宇等[5-6]和Hu等[7]報道了四川小麥品種川麥62、川麥55和川麥88(未發(fā)表數(shù)據(jù))也攜帶5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體。Hu等[7]認為，除了歐洲環(huán)境，5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體也適應(yīng)四川的生態(tài)環(huán)境，這對易位染色體在四川小麥育種改良中具有較大的潛力。此外，在川麥42×川麥55的F6RIL群體中，還發(fā)現(xiàn)含1RS·1BL，5BS·7BS/5BL·7BL和3BS·5AS/3BL·5AL易位染色體的多重易位系材料17y456以及含5BS·7BS/5BL·7BL和4DChanged染色體的材料17y588。此前，筆者曾報道了含有3BS·5AS/3BL·5AL易位的新材料，但是該材料還攜帶了6VS·6AL和5BS·7BS/5BL·7BL易位[6]。Hu等[7]在“內(nèi)麥”系列品種中也檢測到了3BS·5AS/3BL·5AL易位染色體。這些材料與本研究中的17y456均不同。關(guān)于本研究中的4D染色體變異，在前人研究中還未見報道。表明，17y456和17y588是含多重易位系的新材料。由于5B 染色體長臂上攜帶了強效配對抑制基因Ph1[18]，能夠抑制部分同源染色體配對，因此筆者推斷5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色體很有可能是川麥42×川麥55的F6RIL群體后代中出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)變異的誘因，但誘導(dǎo)變異形成的機制有待于研究。

5BS·7BS/5BL·7BL易位染色體雖然已被廣泛應(yīng)用于小麥育種[3-4,15]，但這對易位染色體對農(nóng)藝性狀的影響還未見相關(guān)報道。本研究通過對1B和5B/7B、1RS·1BL和5B/7B、1B和5BS·7BS/5BL·7BL、1RS·1BL和5BS·7BS/5BL·7BL 4種類型株系的農(nóng)藝性狀進行評價，發(fā)現(xiàn)4種類型株系在株高、分蘗、小穗數(shù)和千粒重上沒有差異，說明RS·1BL、5BS·7BS/5BL·7BL易位染色體對株高、分蘗、小穗數(shù)和千粒重沒有不良影響。除了抗病性和適應(yīng)性，對農(nóng)藝性狀無負作用可能是5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體能夠成功應(yīng)用于小麥育種改良的另一個重要因素。研究還發(fā)現(xiàn)，多重易位系17y456和17y588在分蘗、小穗數(shù)和千粒重3個產(chǎn)量性狀上與親本相比無明顯不良影響，但是高抗條銹病，與親本相比得到了顯著的改良和提高。表明多重易位染色體在這2個株系中達到了協(xié)調(diào)，這些材料為今后研究小麥染色體變異協(xié)調(diào)的機制提供了材料基礎(chǔ)。前人研究證明，多重易位系具有良好的抗病性或優(yōu)異的農(nóng)藝性狀特性，這與本研究結(jié)果一致。例如：小麥-黑麥-簇毛麥三重易位系(1RS·7DS，1BL·7DL，6VS·6AL)具有良好的農(nóng)藝性狀和白粉病抗性[19]；小麥-黑麥三重易位(5BS·7BS，5BL·7BL，4BL·5RL)對微量元素銅具有高效利用率[20]；小麥-簇毛麥三重易位(6VS·6AL、5BS·7BS和5BL·7BL)和五重易位系(6VS·6AL、5BS·7BS、5BL·7BL、3BS·5AS和3BL·5AL)具有高產(chǎn)、高抗條銹病和白粉病的優(yōu)良特性[6]。因此，小麥染色體多重易位是拓寬小麥遺傳變異的有效途徑，可以作為今后小麥育種及種質(zhì)創(chuàng)新的一個方向。

有性雜交除了引起基因組結(jié)構(gòu)重排，還可引起表觀遺傳變異，與基因表達活性密切相關(guān)，有助于新的基因表達，有利于增加其抗性、產(chǎn)量和保持其物種穩(wěn)定性[21-22]。本研究鑒定的多重易位系材料17y456和17y588田間銹病嚴重度分別為5和0，表現(xiàn)為高抗條銹病，與親本相比在條銹病抗性方面得到了顯著提高。因此，筆者推斷其抗病性優(yōu)于雙親的原因可能是川麥42和川麥55有性雜交過程中發(fā)生的基因組重排，引起遺傳或表觀遺傳的變異，最終導(dǎo)致親本中不表達的抗病基因被激活，表現(xiàn)出抗病性。說明多重易位系材料17y456和17y588是育種和進行理論研究的好材料。

4 結(jié) 論

1RS·1BL、5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體對株高、分蘗、小穗數(shù)和千粒重無負作用，這為育種家在應(yīng)用易位系進行品種改良提供了指導(dǎo)意義。多重易位系17y456(1RS·1BL，5BS·7BS/5BL·7BL和3BS·5AS/3BL·5AL)和17y588(5BS·7BS/5BL·7BL和4DChanged)是高抗條銹病的新材料，豐富了小麥育種改良的物質(zhì)基礎(chǔ)。5BS·7BS/5BL·7BL易位染色體可以誘導(dǎo)產(chǎn)生染色體結(jié)構(gòu)變異，這為今后小麥育種及種質(zhì)創(chuàng)新提供了方向。