黃攀豪，湯紫照，聶方欽，符陽(yáng)霞，晏欣，李岱，郭韌

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長(zhǎng)沙410013；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院I期臨床試驗(yàn)中心，湖南長(zhǎng)沙410008）

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥及其在臨床疾病中的應(yīng)用為提高全世界人民的健康水平做出了巨大貢獻(xiàn)。近幾十年來，青蒿素在治療瘧疾、三氧化二砷在治療白血病等方面取得的重大成就，證實(shí)了中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展前景[1-2]。在前期的篩查研究中，筆者提取了部分中藥單體有效成分，并通過高通量篩選技術(shù)篩選出了一些具有明顯抗癌活性的中藥提取物，其中篩選出的提取物白樺脂醛對(duì)A549 細(xì)胞活性展現(xiàn)出了較大的抑制作用。筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選白樺脂醛作用于肺癌的靶點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)EGFR 是其潛在靶點(diǎn)，而EGFR 可調(diào)控Raf/MEK/ERK 和PI3K/Akt/mTOR 等通路，起到調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增值、分化和侵襲轉(zhuǎn)移的作用；IL-6/JAK/STAT3 也是EGFR 下游的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖過程中起重要作用。因此，筆者猜想白樺脂醛白樺脂醛的抑瘤作用可能和Akt、ERK、STAT3 通路有關(guān)。由于自噬在腫瘤進(jìn)展中起著重要的作用，故白樺脂醛也有可能通過調(diào)節(jié)A549 細(xì)胞的自噬水平發(fā)揮抑瘤作用。因此，本研究擬通過運(yùn)用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在整體動(dòng)物上觀察白樺脂醛的抑瘤作用，并通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段確定白樺脂醛抑瘤作用可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

白樺脂醛購(gòu)美國(guó)MCE 公司， 分子式為C30H48O2，分子量440.70，純度= 98.56%；TUNEL 試劑盒 （KGA704） 購(gòu)自凱基生物 （KeyGEN BioTECH）；蘇木素伊紅（HE） 染色試劑盒購(gòu)自Wellbio 公司；抗Akt、磷酸化AKT （P-Akt）、抗ERK、抗STAT3、抗LC3、抗p62、抗actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；磷酸化ERK （P-ERK） 和磷酸化STAT3 （P-STAT3） 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；DMEM（含4 500 mg/L D-葡萄糖）培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 購(gòu)自上海中喬新舟公司，培養(yǎng)于DMEM 高糖培基含10%胎牛血清，置37 ℃恒溫含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 周齡SPF 級(jí)雄性裸鼠，12～15 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK （湘） 2020-0019。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 成瘤模型的建立和分組給藥 白樺脂醛溶解于DMSO 配置成20 mg/mL 儲(chǔ)備液。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按2×106個(gè)/100 μL 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549通過腋下皮下注射植入裸鼠，待瘤體生長(zhǎng)到合適大小，隨機(jī)分成4 組，每組7 只裸鼠，分別為對(duì)照組（DMSO），白樺脂醛低劑量組（50 mg/kg），中劑量組（100 mg/kg），白樺脂醛高劑量組（200 mg/kg），腹腔注射給藥干預(yù)持續(xù)1 周，1 次/d。

1.3.2 腫瘤生長(zhǎng)曲線和抑瘤率測(cè)定 成瘤后每周進(jìn)行2 次瘤體測(cè)量，腫瘤大小用用游標(biāo)卡尺測(cè)定長(zhǎng)軸（A） 和短軸（B） 計(jì)算，計(jì)算公式為V （cm3） =A×B2/2。種瘤21 d 后，采用頸椎脫臼處死裸鼠。

1.3.3 HE 染色 烤片，二甲苯脫蠟；梯度濃度的乙醇中復(fù)水；用蘇木素染細(xì)胞核，蒸餾水沖洗后用PBS 返藍(lán)；伊紅染染細(xì)胞核，蒸餾水沖洗，再用梯度酒精脫水，取出后置于二甲苯；中性樹膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.4 TUNEL 染色 烘片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合；高碘酸封閉后依次加Proteinase K 工作液、內(nèi)源性親和素封閉A 液和內(nèi)源性生物素封閉B 液孵育，再加TdT 酶反應(yīng)液和Streptavidin-HRP 標(biāo)記液和DAB 工作液反應(yīng)，漂洗后加蘇木素染液染色；1%鹽酸甲醇中分化；梯度無水乙醇脫水，晾干后加中性樹膠和蓋玻片，用光學(xué)顯微鏡觀察拍照TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取各組腫瘤組織加RIPA 裂解，提取組織總蛋白；取蛋白上清，蛋白定量；10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，依次加一抗和二抗孵育；ECL 化學(xué)發(fā)光液與膜孵育，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X 膠片曝光，顯影沖洗；掃描底片，用Quantity one 軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件（IBM，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步多組內(nèi)兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，各組小鼠接種A549 細(xì)胞3 周后，接種部位均出現(xiàn)明顯腫瘤。于第3 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組裸鼠移植瘤情況見圖1；不同劑量的白樺脂醛均可一定程度地減慢移植瘤的生長(zhǎng)，并呈一定的劑量依賴性，3 周后，中、高劑量白樺脂醛處理組移植瘤體積與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（0.33±2.57）cm3vs.（0.53±0.10）cm3；（0.24±5.42）cm3vs.（0.53±0.10）cm3，均P＜0.01]，而低劑量白樺脂醛處理組移植瘤體積與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（0.43±1.70）cm3vs.（0.53±0.10）cm3，P＞0.05]（圖2）。

圖1 各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況

圖2 各組移植瘤體積變化曲線

2.2 移植瘤組織病理情況比較

各組裸鼠移植瘤呈圓形、橢圓形或分葉狀包塊，包膜完整，與周圍組織分界清楚。HE 染色后顯微鏡下可觀察到不同白樺脂醛劑量組小鼠瘤體組織呈現(xiàn)出不同程度的退行性病變，部分區(qū)域出現(xiàn)明顯細(xì)胞壞死區(qū)，在高劑量白樺脂醛處理組較為明顯。對(duì)照組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，大小不一，有一定異型性，細(xì)胞核較大，瘤體組織未見明顯壞死（圖3）。

圖3 各組瘤體組織HE染色情況（×100）

2.3 各組瘤體組織細(xì)胞增凋亡平比較

使用TUNEL 染色檢測(cè)了腫瘤組織中細(xì)胞的凋亡比例，結(jié)果顯示，不同劑量的白樺脂醛處理成瘤小鼠后，使瘤體組織中TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，并且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

圖4 各組瘤體組織TUNEL染色結(jié)果（×100）

2.4 白樺脂醛對(duì)腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)增殖信號(hào)通路的影響

通過Western blot 法檢測(cè)白樺脂醛給藥后對(duì)瘤體組織細(xì)胞中Akt、ERK、STAT 信號(hào)通路的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白樺脂醛可呈劑量依賴性地抑制Akt、ERK、STAT 信號(hào)通路的活化，表現(xiàn)為p-Akt、p-ERK、p-STAT3 表達(dá)的明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 白樺脂醛對(duì)細(xì)胞內(nèi)增殖信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的影響

2.5 白樺脂醛對(duì)腫瘤組織自噬水平的影響

本研究還觀察了白樺脂醛對(duì)瘤體組織的自噬水平的影響，結(jié)果顯示，白樺脂醛可呈劑量依賴性地提升瘤體組織的自噬水平，表現(xiàn)為p62 表達(dá)的降低及LC3 II/I 水平的升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖6）。

圖6 白樺脂醛對(duì)自噬相關(guān)蛋白水平的影響

3 討論

以往對(duì)白樺脂醛作用的研究較少。Chung 等[3]研究表明，白樺脂醛作為一種FtsZ 蛋白抑制劑，能快速抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，發(fā)揮殺菌作用，并與其他抗菌藥物具有協(xié)同作用。此外，有研究[4-5]表明白樺脂醛作為樺木屬植物提取物具有一定的血糖調(diào)節(jié)能力。Yang 等[6]也發(fā)現(xiàn)白樺脂醛是一種天然的RORγt 激動(dòng)劑，可通過直接與蛋白質(zhì)結(jié)合改變RORγt 的熱穩(wěn)定性。RORγt 的激動(dòng)劑和抑制劑分別是潛在的腫瘤免疫治療藥物和自身免疫性疾病藥物，提示白樺脂醛可能具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[7-8]。由于腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞表現(xiàn)出特異的代謝活性（偏向于以糖酵解和脂代謝方式供能）和免疫活性，因此白樺脂醛可能通過對(duì)代謝和免疫的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，關(guān)于白樺脂醛抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)卻未見報(bào)道。本研究在前期高通量篩選數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)在整體動(dòng)物上進(jìn)一步驗(yàn)證了白樺脂醛的抑瘤作用，并通過分子生物學(xué)技術(shù)確定了其主要參與的分子信號(hào)通路。

A549 細(xì)胞是一種常用的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，常用于抗腫瘤藥物的藥篩和藥敏實(shí)驗(yàn)，本研究中將其接種于裸鼠皮下1 周后，成瘤率達(dá)到了100%，所有接種個(gè)體均形成了大小不等的種植瘤。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了低、中、高劑量的白樺脂醛給藥組，結(jié)果顯示白樺脂醛可明顯降低成瘤小鼠最終的瘤體體積，提示了白樺脂醛在整體動(dòng)物水平能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。確定了白樺脂醛抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用后，進(jìn)一步對(duì)不同處理組的瘤體組織進(jìn)行了病理學(xué)檢查。瘤體組織HE 染色結(jié)果顯示不同劑量給藥的裸鼠移植瘤鏡下呈現(xiàn)不同程度片狀壞死區(qū)，壞死區(qū)腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核裂解消失，壞死灶周邊有少量殘存的腫瘤細(xì)胞。這一結(jié)果提示，白樺脂醛對(duì)瘤體組織A549 細(xì)胞的活性有明顯的抑制作用。

為了進(jìn)一步確定白樺脂醛對(duì)瘤體組織細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響，研究中還使用TUNEL 染色檢查了瘤體組織處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量，與白樺脂醛的抑瘤作用一致，白樺脂醛處理后瘤體組織中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，表明白樺脂醛通過對(duì)A549 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，打破了細(xì)胞原有的凋亡狀態(tài)的平衡，使細(xì)胞趨向于凋亡。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，其胞內(nèi)促存活信號(hào)通路明顯活化，主要包括Akt、ERK、STAT 等信號(hào)通路的活化[9-11]。本研究中運(yùn)用Western blot 的方法檢測(cè)了白樺脂醛給藥后對(duì)瘤體組織細(xì)胞中Akt、ERK、STAT 信號(hào)通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白樺脂醛可呈劑量依賴性地抑制Akt、ERK、STAT 信號(hào)通路的活化，表明白樺脂醛可通過對(duì)多條分子信號(hào)通路的影響發(fā)揮抑瘤作用。既往的研究證實(shí)了異常的自噬水平參與了腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于自噬在腫瘤疾病中是起到抑制還是促進(jìn)的作用，有很多相互矛盾的報(bào)道[12-13]。本研究中另一重要發(fā)現(xiàn)是白樺脂醛的抑瘤作用可能與自噬有關(guān)，白樺脂醛可明顯上調(diào)瘤體組織細(xì)胞中的自噬水平。由于自噬水平的高低對(duì)細(xì)胞的代謝和能量供應(yīng)均有密切關(guān)系，因此白樺脂醛的抑瘤作用也可能與其對(duì)自噬的調(diào)節(jié)有一定關(guān)系，未來需要更進(jìn)一步的機(jī)制實(shí)驗(yàn)以證明這一關(guān)系。

總之，本研究通過裸鼠皮下種瘤實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了一種具有顯著藥理學(xué)活性的植物提取物白樺脂醛，能夠顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，降低A549 細(xì)胞的成瘤能力，其機(jī)制可能與對(duì)種瘤細(xì)胞內(nèi)多條促增殖信號(hào)通路的抑制有關(guān)。白樺脂醛抑瘤作用的發(fā)掘可能為今后臨床治療肺癌及其他惡性腫瘤提供一定的思路。