趙珍，邢琰，張風(fēng)華，劉妍，景尚華

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，河北石家莊050000；2.河北省石家莊人民醫(yī)院普通外科三病區(qū)，河北石家莊050000；3.河北省人民醫(yī)院腺體外科，河北石家莊050000）

甲狀腺癌是近年來增長最快的內(nèi)分泌惡性腫瘤，發(fā)病率大于5%[1]。其中，80%～85%為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）。PTC的治療方式有手術(shù)切除，放射性碘消融等。盡管大多數(shù)PTC 患者預(yù)后良好，PTC 的5年總生存率為95%， 但仍有20%～30% 的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和進(jìn)展[2]。

PTC 的形成是一個十分復(fù)雜的生物化學(xué)過程，其特征是各種分子的異常[3-4]。大規(guī)?；蚪M研究表明遺傳改變在PTC 的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[5-7]。目前對其持續(xù)高發(fā)的原因尚未明確[8]。目前，我國多數(shù)地區(qū)將甲狀腺超聲篩查甲狀腺癌作為常規(guī)體檢項目。由于受檢查醫(yī)師主觀認(rèn)知水平限制較大，仍有很多的甲狀腺癌誤診或漏診，導(dǎo)致過度醫(yī)療和延誤治療。臨床應(yīng)用于診療PTC 的分子生物標(biāo)志物在特異度和敏感度方面很低，對于臨床的價值不大[9-11]。PTC 發(fā)病人數(shù)的迅速增長迫切需要開發(fā)新的有效的用于PTC 診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

本研究試圖找到檢測PTC 患者的新的高效的分子生物指標(biāo)，使之能夠提高臨床的診斷和預(yù)后，成為潛在的治療靶標(biāo)。通過檢測從Gene Expression Omnibus （GEO） 數(shù)據(jù)庫（GSE60542，GSE33630 和GSE3467）中PTC 和正常甲狀腺組織之間的差異表達(dá)基因，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析基因的表達(dá)數(shù)據(jù)譜，對篩選出的基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋分析。建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI） 網(wǎng)絡(luò)來鑒別與PTC 相關(guān)的關(guān)鍵基因。這些關(guān)鍵基因的生存分析使用在線數(shù)據(jù)庫Cbioportal 工具進(jìn)行，并進(jìn)一步研究驗證。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究中分析的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集是從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo） 獲得的。從數(shù)據(jù)庫中檢索到總共2 079 個關(guān)于人類甲狀腺癌的系列文章。經(jīng)過仔細(xì)審查，選擇了3 個基因表達(dá)譜（GSE60542，GSE33630 和GSE3467）。

1.2 差異基因的數(shù)據(jù)處理

使用GEO2R 在線分析工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r） 檢測PTC 和正常樣品之間的差異基因。對每個數(shù)據(jù)集進(jìn)行統(tǒng)計分析，調(diào)整P值和|logFC|以符合臨界標(biāo)準(zhǔn)。篩選出P＜0.05 和|logFC|≥2.0 的基因被視為差異基因，其中l(wèi)ogFC≥2 代表基因表達(dá)上調(diào)，logFC≤-2 代表基因表達(dá)下調(diào)。Venn 圖網(wǎng)絡(luò)工具（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）確定重合的基因。

1.3 差異基因的GO功能富集分析

使用注釋， 可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（DAVID） 工具（https://david.ncifcrf.gov） 進(jìn)行差異基因的GO 注釋分析,供研究者挖掘大量基因背后的生物學(xué)價值。P＜0.01 和基因計數(shù)≥10 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與關(guān)鍵基因識別

對于篩選出的差異基因，使用搜索工具（STRING） 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org） 用于PPI 信息分析。以＞0.15 的組合分?jǐn)?shù)提取PPI。通過Cytoscape 軟件（www.cytoscape.org）將PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化處理。在本研究中，篩選出前10 個具有高連通性的節(jié)點基因，即為PTC 的關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因?qū)τ赑TC的生存分析

cBioPortal （https://www.cbioportal.org） 在線工具可以通過可視化的形式展示癌癥研究樣本的基因組數(shù)據(jù)，同時也可以幫助研究人員探索樣本、基因和通路之間的遺傳變化，并與臨床結(jié)果相結(jié)合。本研究使用cBioPortal 評估篩選出的關(guān)鍵基因在PTC的預(yù)后價值。P＜0.01 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果。

1.6 關(guān)鍵基因在臨床標(biāo)本中的驗證

1.6.1 臨床標(biāo)本收集 52 例PTC 組織和與之匹配的相鄰正常甲狀腺組織樣本（距腫瘤邊緣≥2 cm）是我院進(jìn)行手術(shù)的患者中收集的。手術(shù)標(biāo)本立即保存在液氮中直至使用。本研究中所有患者均簽署知情同意書。我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)此項研究。1.6.2 qRT-PCR 檢測 TRIzol（碧云天）提取組織中的總RNA。NanoDrop ND-1000 分光光度計測量RNA 濃度及純度。通過PrimeScript?RT 試劑盒（碧云天） 合成 cDNA。 采用 SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（碧云天）和ABI 7500 實時PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems） 進(jìn)行實時PCR。使用GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行3 次獨(dú)立的實驗。KIT 的比較采用ΔCt 方法。引物序列由Sangon Biotech （上海，中國）合成。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS2 0.0 軟件和GrapPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。關(guān)鍵基因在PTC 癌組織和癌旁正常甲狀腺組織表達(dá)的比較采用配對t檢驗。PTC 癌組織中關(guān)鍵基因表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異基因

在3 個基因表達(dá)譜中，GSE60542 包含33 個PTC 樣本和30 個正常甲狀腺正常樣本，GSE33630和GSE3467 分別包含49 個、9 個PTC 樣本和45 個、9 個正常甲狀腺樣本。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，從基因芯片GSE60542中總共鑒定出307個差異基因，包括168個上調(diào)基因和139 個下調(diào)基因。在基因芯片GSE33630中，鑒定出了323 個差異基因，其中197 個基因上調(diào)，而126 個基因下調(diào)。從GSE3467 中鑒定出了155 個差異基因，包括93 個上調(diào)基因和62 個下調(diào)基因。通過將PTC 樣本與正常甲狀腺樣本進(jìn)行比較來識別所有的差異基因。隨后，進(jìn)行Venn 分析以獲得差異基因輪廓的交集（圖1）。最后，組中有102 個差異基因表達(dá)，其中62 個明顯上調(diào)的基因和40 個明顯下調(diào)的基因。

圖1 3個GEO數(shù)據(jù)集共有的差異基因的Venn圖A：上調(diào)的差異基因；B：下調(diào)的差異基因Figure 1 Venn diagram of the differentially expressed genes shared by the three datasetsA:Up-regulated genes;B:Downregulated genes

2.2 差異基因的GO功能富集分析

GO 是一個國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類系統(tǒng)，全面描述生物體內(nèi)基因和基因產(chǎn)物的性質(zhì)。GO 共有3 個本體論，描述基因的分子功能、細(xì)胞的位置和所涉及的生物過程。使用DAVID 對差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析（圖2）。

圖2 差異基因的GO功能富集分析Figure 2 Significantly enriched GO terms of the differentially expressed genes

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與關(guān)鍵基因識別

Cytoscape 軟件用于計算每個蛋白質(zhì)節(jié)點的連通程度，通常有較高連通性的節(jié)點對整個網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性具有更重要的作用。STRING 檢索先前確定的差異基因提取PPI（圖3），并通過對提取的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理（圖4）。此研究中，前10 個具有高連通性的節(jié)點基因被鑒定為關(guān)鍵基因。

圖3 用差異表達(dá)基因構(gòu)建的PPIFigure 3 PPI constructed based on the differentially expressed genes

圖4 具有較高連通性的10個關(guān)鍵基因Figure 4 The 10 hub genes with high connectivity

2.4 關(guān)鍵基因?qū)τ赑TC的生存分析

cBioPortal 是一種可視化和分析多維度癌癥基因組數(shù)據(jù)的在線工具。其整合了多個腫瘤基因組研究的數(shù)據(jù)，還包括臨床預(yù)后等表型的信息。使研究人員不僅能夠獲取大量的癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)，還能夠?qū)⑦@些數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為圖形化的結(jié)果，使復(fù)雜的癌癥基因組學(xué)資料更易理解和接受。將10 個關(guān)鍵基因于cBioPortal 進(jìn)行生存分析示，其中KIT 具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5）。

圖5 KIT與患者生存的關(guān)系Figure 5 Relationship between KIT and survival of the patients

2.5 臨床標(biāo)本驗證結(jié)果

KIT 表達(dá)水平在PTC 組織較癌旁正常甲狀腺組織表達(dá)明顯降低（P＜0.001）（圖6）。在PTC 組織中，KIT 與患者臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而與年齡、性別、組織分化方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（表1）。

表1 PTC中KIT的表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）Table 1 Relationship between the expression of KIT and clinicopathologic parameters in PTC(±s)

表1 PTC中KIT的表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）Table 1 Relationship between the expression of KIT and clinicopathologic parameters in PTC(±s)

參數(shù)年齡（歲）≤55＞55例數(shù)（n）值t P 30 26 8.64±1.53 7.29±2.48 0.958 0.709性別男女25 31 7.93±1.32 6.74±1.75 0.892 0.653分化程度高/中低29 27 7.84±1.38 6.36±2.52 1.112 0.132臨床分析I/II III 38 18 5.18±1.05 8.26±1.53 4.273 0.008淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無有19 38 4.83±1.32 9.25±1.46 3.753 0.023

圖6 KIT在PTC及癌旁正常甲狀腺組織中的表達(dá)Figure 6 KIT expressions in PTC and normal adjacent thyroid tissues

3 討論

PTC 是甲狀腺癌最常見的腫瘤亞型，主要發(fā)生在中老年人，發(fā)生的中位年齡是50 歲[12]。PTC 的主要特征之一是它能夠侵入鄰近的淋巴管等結(jié)構(gòu)[13-15]。約有27%在就診時出現(xiàn)同側(cè)的頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[16]。手術(shù)是PTC 主要的治療手段，通常具有良好的預(yù)后[17-19]。但是，有些臨床病理和背景特征可能導(dǎo)致不良預(yù)后[20]。在分子水平上進(jìn)一步闡明PTC 在腫瘤行為方面的發(fā)病機(jī)制，找到PTC 診療和預(yù)后的分子生物標(biāo)志物有著重要的臨床意義。

本研究通過公開的數(shù)據(jù)庫資源進(jìn)行基因表達(dá)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)表達(dá)的分析，篩選鑒定與PTC 相關(guān)的潛在的關(guān)鍵基因。依據(jù)GEO 數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出PTC 與正常甲狀腺組織之間的差異基因，并確定了上調(diào)和下調(diào)的差異基因。進(jìn)一步進(jìn)行了差異基因的GO 功能富集分析。通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)研究差異基因的相互關(guān)系，10 個基因被鑒定為關(guān)鍵基因。使用cBioPortal 在線工具來預(yù)測關(guān)鍵基因表達(dá)與PTC 患者預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PTC中KIT 基因的下調(diào)與PTC 患者的預(yù)后不良有關(guān)。

收集我院52 例PTC 手術(shù)患者樣本，通過實時PCR 檢測KIT 在癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)。結(jié)果表明KIT 在PTC 組織中的表達(dá)明顯降低，統(tǒng)計具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與以上生信分析結(jié)果一致。KIT 的表達(dá)與PTC 患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，臨床分期III 期的PTC 比I/II 期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比未轉(zhuǎn)移的PTC 患者KIT 表達(dá)下調(diào)的更明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

KIT 是一種III 型受體酪氨酸激酶，位于染色體4q12，存在于Cajal 間質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞、造血祖細(xì)胞等多種細(xì)胞中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移等功能，在人體發(fā)生發(fā)育和生理調(diào)節(jié)中起著重要的作用[21]。KIT 在癌癥的發(fā)生和增殖中起著至關(guān)重要的作用[22-23]。具有活化的KIT 的腫瘤是伊馬替尼和其他選擇性酪氨酸激酶抑制劑的潛在靶標(biāo)[24-26]。在胃間質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)了突變的KIT，KIT 突變是胃間質(zhì)瘤預(yù)后不良的標(biāo)志，突變的KIT 的存在可預(yù)測疾病對伊馬替尼的反應(yīng)性[27-30]。

基于GEO 數(shù)據(jù)庫獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選PTC 與正常甲狀腺組織的差異基因。鑒定出10 個基因為PTC 潛在的關(guān)鍵基因，其中KIT 下調(diào)與PTC 患者的不良預(yù)后相關(guān),需要進(jìn)一步的研究證實研究的結(jié)果。KIT 可能是治療PTC 的治療靶標(biāo)和分子生物標(biāo)志物。