李夏林，潘大宇

1華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院脊柱外科，廣東 深圳 518000；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津 300052

脊髓損傷可以導(dǎo)致軸突的嚴重受損和神經(jīng)元的死亡，最終導(dǎo)致永久的運動或者感覺功能的喪失，脊髓損傷的治療對于全球的科研和臨床工作者來說都是巨大的挑戰(zhàn)［1-4］。轉(zhuǎn)化生長因子-βs（TGF-βs）是一類多功能肽生長因子［5,6］。TGF-β僅存在于哺乳動物中，對于組織重塑和/或修復(fù)以維持組織動態(tài)平衡很重要［7,8］。但是，不同器官中的許多疾病與異常激活或TGF-β水平升高有關(guān)，例如皮膚、腎臟、肺、肝的纖維化和不同腫瘤的轉(zhuǎn)移［9-12］。而1D11，一種人源化形式的單克隆抗體，可中和3種主要的活性TGF-β亞型（TGF-β1、2 和3），并且不結(jié)合TGF-β超家族中的其他配體［13］。部分研究表明，TGF-β可以促進成纖維細胞的募集以及纖維瘢痕的形成，而纖維化瘢痕也是脊髓損傷后軸突再生和生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，其構(gòu)成部分包括纖連蛋白，I型膠原，IV型膠原和層粘連蛋白等［14-17］。目前對于TGF-β與纖維瘢痕構(gòu)成組分尤其是纖連蛋白之間的關(guān)系尚不清楚，而如何減少瘢痕形成來減少軸突生長的物理屏障和促進神經(jīng)元細胞的存活成為目前脊髓損傷治療的一個重要研究方向［18,19］。本研究是通過不同的小鼠脊髓損傷模型來研究小鼠脊髓損傷后TGF-β的抑制與纖連蛋白沉積之間的關(guān)系，并同時觀察成纖維細胞募集以及神經(jīng)功能學(xué)恢復(fù)的情況。現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 脊髓損傷小鼠半切模型和鉗夾模型的建立和治療

本研究所有動物實驗均符合《實驗動物管理條例》及國家有關(guān)法律法規(guī)規(guī)定，并通過華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院科研倫理委員會審批。從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心購得6～8周齡雌性C57小鼠24只。按照華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院動物房管理規(guī)定給小鼠提供足夠的標準食物和水，并在12/12 h的明暗周期下飼養(yǎng)。手術(shù)前對小鼠進行稱重并根據(jù)重量計算麻醉劑的使用量來對小鼠進行深度麻醉，所用麻醉劑為4%水合氯醛，濃度為3 mL/kg。首先使用顯微剪逐層剪開小鼠背部皮膚、筋膜、肌肉，并對T10椎骨進行背側(cè)椎板切除術(shù)，以暴露脊髓，半切模型為虹膜剪尖端將脊髓半切至脊髓后正中靜脈右側(cè)，鉗夾模型為將微型止血鉗橫向鉗夾暴露處整個脊髓5 s后松開，可觀察到小鼠痙攣性擺尾，單（雙）下肢及軀體回縮撲動后單（雙）下肢癱瘓，以及硬脊膜充血水腫。

將12只小鼠分為3組：治療組、對照組和陰性對照組，4只/組。實驗重復(fù)2次。治療組通過對脊髓損傷半切模型小鼠進行腹腔注射TGF-β中和抗體（1D11）來抑制TGF-β的表達量；對照組小鼠腹腔注射載體抗體（13C4）作為對照，損傷后3次/周，每次25 μL/只，4周后安樂死收樣；陰性對照組暴露脊髓后，不進行脊髓半切和鉗夾。

1.2 免疫熒光染色

首先進行心臟灌注取材，隨后損傷部位上下1～2 cm脊柱至4%多聚甲醛中固定24 h，然后剪開脊柱兩側(cè)，取出脊髓，分別轉(zhuǎn)入20%蔗糖，30%蔗糖溶液中各脫水24 h，然后冰凍包埋后切片，切片厚度10、20 μm，并記錄切片張數(shù)。不同組選取同一位置切片進行染色，先于37 ℃烘箱中烘烤1 h后浸泡于磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中5 min，然后使用封閉液常溫封閉1 h（10%驢血清，1.5%牛血清白蛋白（BSA），0.25%Triton以及0.1%N3Na用PBS 配制），使用抗體稀釋液稀釋一抗后4 ℃孵育過夜（抗體稀釋液為2%驢血清，1%BSA，0.25%Triton以及0.1%N3Na 用PBS 配制），所用一抗為FSP1、Fibronectin、PGP9.5、5-HT和GFAP。第2天將切片取出后常溫復(fù)溫1 h 后用含Tween20 的Tris 緩沖鹽水（TBST）洗3次，10 min/次，然后常溫孵育二抗和DAPI 1 h。孵育完成后使用TBST洗3次，10 min/次，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

通過GraphPad Prism 7軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，使用Student'st檢驗進行成對比較，使用帶有Tukey事后檢驗的One-way ANOⅤA分析確定行為學(xué)分析中的差異，包括重復(fù)的數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制TGF-β的表達可以減少脊髓損傷半切模型損傷區(qū)域成纖維細胞的募集

本研究結(jié)果顯示，和對照組相比，治療組使用1D11后TGF-β的表達量明顯下降（P=0.0039，圖1）。為觀察TGF-β的抑制對脊髓損傷后成纖維細胞募集的影響，在小鼠脊髓損傷半切模型損傷部位檢測FSP1的表達水平，結(jié)果顯示，脊髓損傷后，對照組成纖維細胞大量募集于損傷區(qū)域，而治療組成纖維細胞募集減少（P=0.0015，圖2，3）。

圖1 1D11可以抑制脊髓損傷后TGF-βFig.1 1D11 injection inhibits TGF-βexpression after spinal cord injury(SCI)in mice.

圖2 抑制TGF-β的表達量可以減少脊髓損傷半切模型損傷區(qū)域成纖維細胞的募集Fig.2 Inhibition of TGF-β attenuates fibroblast recruitment in the injury site in a mouse model of spinal cord hemisection(Scale bar=50 μm).

圖3 脊髓損傷半切模型損傷區(qū)域成纖維細胞的募集的定量分析Fig.3 Quantitative data of fibroblast recruitment in the injury site in mice with spinal cord hemisection.

2.2 抑制TGF-β的表達量可以減少脊髓損傷半切模型損傷區(qū)域纖連蛋白的沉積并改善神經(jīng)功能恢復(fù)

為觀察抑制TGF-β的表達量和脊髓損傷半切模型損傷區(qū)域纖連蛋白沉積的關(guān)系，在小鼠脊髓損傷半切模型損傷部位檢測纖連蛋白表達水平。結(jié)果顯示，脊髓損傷后，對照組纖連蛋白在脊髓損傷區(qū)域大量沉積，治療組纖連蛋白沉積明顯減少（圖4，5）。進一步通過免疫熒光檢測PGP9.5相關(guān)的神經(jīng)學(xué)染色，結(jié)果顯示，脊髓損傷后，損傷區(qū)域PGP9.5陽性的神經(jīng)數(shù)量明顯減少，而與對照組相比，治療組PGP9.5陽性的神經(jīng)數(shù)量增加（圖4，6）。

圖4 抑制TGF-β的表達量可以減少脊髓損傷半切模型損傷區(qū)域纖連蛋白的沉積并改善神經(jīng)功能恢復(fù)Fig.4 Inhibition of TGF-β decreases fibronectin deposition of in the injury site and promotes neurological recovery in mice with spinal cord hemisection.Scale bar=200 μm.

圖5 脊髓損傷半切模型損傷區(qū)域纖連蛋白沉積的定量分析Fig.5 Quantitative data of fibronectin deposition in mice with spinal cord hemisection.

圖6 脊髓損傷半切模型損傷區(qū)域神經(jīng)學(xué)染色的定量分析Fig.6 Quantitative data of neurological function recovery in mice with spinal cord hemisection.

2.3 抑制TGF-β的表達可以增加脊髓損傷鉗夾模型損傷區(qū)域星形膠質(zhì)細胞的分布并改善神經(jīng)功能恢復(fù)

為進一步證明1D11抑制TGF-β表達量對于神經(jīng)功能學(xué)恢復(fù)的促進作用，本研究采用第2種脊髓損傷鉗夾模型來進行驗證，結(jié)果顯示，與sham組相比，脊髓損傷后，對照組5-HT陽性神經(jīng)遞質(zhì)無法向下傳遞，損傷區(qū)域星形膠質(zhì)細胞分布大大減少，治療組5-HT陽性神經(jīng)遞質(zhì)下行距離延伸，且GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞在損傷區(qū)域分布數(shù)量明顯增加（圖7～9）。

圖7 抑制TGF-β的表達可以增加脊髓損傷鉗夾模型損傷區(qū)域星形膠質(zhì)細胞的分布并改善神經(jīng)功能恢復(fù)Fig.7 Inhibition of TGF-β increases astrocyte distribution and improves functional recovery in mice with spinal cord clamp injury(Scale bar=100 μm).

圖8 脊髓損傷鉗夾模型損傷區(qū)域星形膠質(zhì)細胞的分布的定量分析Fig.8 Quantitative data of astrocytes distribution in mice with spinal cord clamp injury.

圖9 脊髓損傷鉗夾模型損傷區(qū)域神經(jīng)學(xué)染色的定量分析Fig.9 Quantitative data of neurological function recovery in mice with spinal cord clamp injury.

3 討論

本研究通過兩種小鼠脊髓損傷模型來觀察小鼠脊髓損傷后，抑制TGF-β表達量對于成纖維細胞募集情況，纖連蛋白沉積情況和神經(jīng)功能恢復(fù)情況的影響。研究結(jié)果顯示，脊髓損傷后，成纖維細胞和纖連蛋白大量聚集在損傷區(qū)域，而與13C4組相比，1D11組成纖維細胞募集減少，纖連蛋白沉積減少且神經(jīng)功能學(xué)有明顯恢復(fù)。以上結(jié)果表明，抑制TGF-β表達可以通過減少成纖維細胞聚集和纖連蛋白沉積，來促進軸突的生長和增加神經(jīng)元的存活來修復(fù)小鼠脊髓損傷。

目前，脊髓損傷的治療方法包括外科治療、康復(fù)治療、藥物治療和細胞治療，但成功率有限［20］。成纖維細胞在周圍結(jié)締組織和器官中無處不在，是細胞外基質(zhì)的主要產(chǎn)生者。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的情況下，成纖維細胞主要與脈管系統(tǒng)相關(guān)，僅對基底層起作用。TGF-β在體內(nèi)的特征性作用是通過募集單核細胞，淋巴細胞，嗜中性粒細胞和成纖維細胞來介導(dǎo)傷口愈合，并誘導(dǎo)血管生成和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生［21,22］。但是，高濃度的活性TGF-β會導(dǎo)致異常的骨形成并調(diào)節(jié)纖維化瘢痕的形成［9-12］。表現(xiàn)為損傷后，成纖維細胞侵入并駐留在損傷部位，并開始增殖和表達纖連蛋白，I型膠原，IV型膠原和層粘連蛋白，形成纖維瘢痕［14］。纖維化瘢痕也是脊髓損傷后軸突再生和生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，病變核心內(nèi)的細胞通過產(chǎn)生細胞外基質(zhì)成分和蛋白水解酶（尤其是金屬基質(zhì)蛋白酶）來介導(dǎo)細胞外環(huán)境動態(tài)［23-25］。金屬基質(zhì)蛋白酶可以降解細胞外基質(zhì)分子，使受體介導(dǎo)的組裝成為致密基質(zhì)［23］。本研究數(shù)據(jù)表明，抑制TGF-β可以減少纖連蛋白的沉積并改善脊髓損傷后的功能恢復(fù)。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的主要亞型，它們維持神經(jīng)元以及血腦屏障。被激活后可以響應(yīng)各種類型的損傷，包括驗證、感染、局部缺血和外傷。反應(yīng)性膠質(zhì)細胞在急性傷口愈合和組織重塑過程中是必需的，也是神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的主要細胞成分［26,27］。脊髓損傷后，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞開始合成更多，并釋放抑制軸突再生的CSPGs，物理性阻隔和限制軸突再生［28,29］，一些細胞外基質(zhì)成分，例如纖連蛋白，在體外也能抑制神經(jīng)突再生。其他如層粘連蛋白，促進更大的神經(jīng)突向外生長［30-34］。同時由于損傷區(qū)域缺乏支持的神經(jīng)營養(yǎng)因子，使得軸突再生受到抑制［35］。近些年來，對于膠質(zhì)瘢痕的研究越來越傾向于損傷區(qū)域的星形膠質(zhì)細胞并不完全扮演著瘢痕的作用并釋放CSPGs來抑制軸突生長，這些細胞本身就是構(gòu)成軸突和支撐神經(jīng)元的重要膠質(zhì)細胞，所以它們的存在可以促進軸突的再生和神經(jīng)元的存活［36,37］。本研究通過實驗結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β表達量后，星形膠質(zhì)細胞在損傷區(qū)域數(shù)量的增加與神經(jīng)功能學(xué)恢復(fù)程度成正相關(guān)。鑒于TGF-β在減少纖連蛋白沉積過程中的重要作用，可為目前減少脊髓損傷后瘢痕形成提供新的視角。

綜上所述，抑制TGF-β表達量可以通過減少成纖維細胞聚集和纖連蛋白沉積，來促進軸突的生長和增加神經(jīng)元的存活來修復(fù)小鼠脊髓損傷。但是鑒于本實驗研究時間較短，抑制TGF-β表達量如何減少纖連蛋白沉積和促進神經(jīng)功能恢復(fù)的機制還有待進一步研究。