李 忍，姜 鵬，戴凌燕，阮長青，張東杰, ，王長遠(yuǎn)，李志江,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

根據(jù)現(xiàn)代流行病學(xué)研究報道，經(jīng)常食用全谷物可降低人體患肥胖、心血管疾病和2型糖尿病等慢性疾病風(fēng)險[1]。高粱（Sorghum bicolorL.Moench）屬禾本科，是世界上種植最早和最廣泛的農(nóng)作物之一，也是亞洲和非洲等非半干旱地區(qū)主要的主食來源[2]。高粱富含維生素B、賴氨酸、膳食纖維、多酚、礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，是一種重要的糧食原料[3]。

蛋白質(zhì)作為一種人類生命活動中基本的營養(yǎng)物質(zhì)，在日常膳食結(jié)構(gòu)中具有重要作用，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)對食品的食用品質(zhì)具有顯著影響。近年來，人們研究了各種物理和化學(xué)方法來改善蛋白質(zhì)的溶解性、起泡性及吸油性等性質(zhì)，以提高食品食用品質(zhì)[4]。由于高粱蛋白中醇溶蛋白含量較高，因此高粱蛋白具有消化率低、不易溶于水和加工性能差等特點(diǎn)[5]。目前，國內(nèi)外對高粱蛋白的研究主要集中在提高蛋白提取率、改善蛋白消化率、制備功能性蛋白抑制肽和調(diào)控蛋白基因表達(dá)等方面[6]。微波技術(shù)作為一種新型的熱加工技術(shù)，具有操作簡單、安全和綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在食品加工領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。研究表明，微波處理可提高青稞蛋白質(zhì)的提取率[7]。劉海波等[8]研究發(fā)現(xiàn)，微波處理可導(dǎo)致小麥面筋蛋白中的巰基和二硫鍵含量減少，面筋蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得疏松。胡方洋等[9]研究發(fā)現(xiàn)，微波處理可降低苦蕎蛋白的起泡性和乳化性。此外，王娜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，微波處理可降低小麥醇溶蛋白的抗原性，具有良好的脫敏效果。然而，微波處理對高粱蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性及其理化性質(zhì)的研究相對較少。本研究利用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）等方法來探討微波處理前后高粱理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化情況，旨在為高粱食品的開發(fā)和利用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍米糧1號、龍雜13號和紅糯高粱 均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；考馬斯亮藍(lán)試劑盒 南京建成生物工程研究所；光譜級溴化鉀 天津市福晨化學(xué)試劑廠；胃蛋白酶（活力250 U/mg） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；金龍魚食用大豆油 北京華聯(lián)超市；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 北京博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑 無特殊說明均為分析純。

755B型紫外可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DELTA320型pH計 上海珂淮儀器有限公司；S-4800N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Nicolet 6700型紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；TDZ5-WS臺式低速離心機(jī) 上海精若科學(xué)儀器有限公司；Beta2-8LD plus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；SL-100型高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市松青五金廠；NH310色差儀 深圳三恩時科技有限公司；M1-211A微波爐 美的集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 微波處理 參考姜鵬等[11]方法并稍作改動。取500 g高粱清洗除雜后在室溫下浸泡3 h后取出備用，待表面水分自然風(fēng)干后，在微波600 W的條件下處理6 min，冷卻至室溫，45 ℃熱風(fēng)干燥，冷卻至室溫后用組織粉碎機(jī)粉碎并過60目篩，置于4 ℃保存；除未經(jīng)微波處理外，未處理組的前處理步驟均與處理組相同。

1.2.2 高粱蛋白質(zhì)的提取 根據(jù)周劍敏等[12]方法稍作修改。稱取500 g過篩后的高粱粉放置于3500 mL石油醚中，在室溫下脫脂6 h后，除去石油醚，脫脂后的高粱粉在40 ℃條件下烘干。取200 g的脫脂后的高粱粉于燒杯中，并加入1 mol/L的NaOH溶液（pH=14），攪拌4 h后在4000 r/min條件下離心30 min，取上清液并調(diào)節(jié)pH至5.0，靜置2 h，在4000 r/min條件下離心30 min后取出沉淀，用去離子水清洗并在4000 r/min條件下離心3次，收集沉淀，冷凍干燥后備用。

1.2.3 高粱總蛋白質(zhì)含量及可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 總蛋白質(zhì)含量根據(jù)GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

可溶性蛋白質(zhì)含量的測定參考方趙志浩等[13]方法并稍作修改。稱取高粱粉1.0 g與9 mL生理鹽水混勻，在冰浴條件下機(jī)械均質(zhì)2 min后取出，均質(zhì)液在4000 r/min條件下離心10 min，分離上清液并定容至25 mL。取50 μL定容后的液體于試管中，加入3.0 mL考馬斯亮藍(lán)顯色液，混勻后靜置5 min，在595 nm波長的條件下測定吸光度為A1，用去離子水做空白對照，記錄吸光度為A2，以牛血清白蛋標(biāo)準(zhǔn)品（0.563 g/L）作為標(biāo)準(zhǔn)對照，測得吸光度A3。計算公式如式（1）：

1.2.4 SEM分析 在SEM的載物臺上貼上一定數(shù)量的導(dǎo)電雙面膠帶，取冷凍干燥后的高粱蛋白質(zhì)均勻至于雙面膠上，用吸耳球吹去多余蛋白質(zhì)，載物臺在鍍金儀中鍍金120 s后放入SEM中，在電子槍加速電壓為10 kV的條件下觀察蛋白質(zhì)形態(tài)。

1.2.5 FT-IR分析 在干燥的條件下稱取3 mg干燥至恒重后的高粱蛋白質(zhì)樣品和300 mg的溴化鉀粉末混合后研磨15 min后過篩，將過篩后的混合粉末壓成片后備用，并以溴化鉀片作空白，在波數(shù)為400~4000 cm?1的條件下進(jìn)行掃描。

1.2.6 蛋白質(zhì)體外消化率的測定 采用Mertz等[14]方法測定蛋白質(zhì)的體外消化率。取高粱粉200.0 mg置于離心管中，加入相當(dāng)活力為250 U/mg的胃蛋白酶溶液35 mL。溶液在37 ℃水浴中振蕩2 h，然后加入2 mLNaOH溶液（2 mol/L）并調(diào)節(jié)pH至14終止反應(yīng)。離心后棄上清液，用20 mL磷酸鹽緩沖液（pH=7）洗滌沉淀兩次，在相同條件下離心后，取出沉淀干燥，測定沉淀中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)體外消化率的計算公式如式（2）：

式中：M為樣品消化前的總蛋白含量；m為樣品消化后的總蛋白含量。

1.2.7 持水力和持油力的測定 采用Liu等[15]方法并稍作修改。稱4.0 g高粱粉與20 mL水或大豆油混合，放入50 mL離心管中，30 ℃條件下放置30 min，每5 min攪拌一次，在3500 r/min條件下離心15 min后，棄去上清液稱重，計算公式如（3）：

1.2.8 色度的測定 采用色度計測定微波處理前后高粱的L*、a*、b*和 ΔE值。并按公式（4）計算ΔE值：

式中：ΔE表示色差；L*表示黑白值；a*表示紅綠值；b*表示黃藍(lán)值。

1.2.9 高粱表面微生物的測定 菌落總數(shù)根據(jù)GB4789.2-2016《菌落總數(shù)測定》；霉菌和酵母菌計數(shù)根據(jù)GB4789.15-2016《霉菌和酵母總數(shù)測定》。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均測定三次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0、Graphpad Prism 8.0和Origin 8.0進(jìn)行分析作圖，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)，t檢驗法分析組間差異顯著性，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理影響高粱蛋白質(zhì)含量結(jié)果

蛋白質(zhì)是高粱中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，常與淀粉等絡(luò)合的形式存在。微波處理后，龍米糧1號、龍雜13號和紅糯高粱的總蛋白質(zhì)含量分別顯著（P<0.05）提高了0.60%、0.58%和0.61%（如圖1）。這與劉佳男等[16]的研究結(jié)果相一致，微波處理后白高粱的總蛋白質(zhì)含量提高了0.60%，原因可能是由于微波處理破壞了高粱中的蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)充分釋放。如圖1所示，微波處理前，龍米糧1號、龍雜13號和紅糯高粱的可溶性蛋白質(zhì)含量存在顯著差異（P<0.05），分別為2.74、3.90和1.97 mg/g。微波處理后，三種高粱的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著降低（P<0.05），分別降低至1.56、2.03和1.00 mg/g。這與趙穎等[17]研究的結(jié)果相類似，微波處理可使萌芽糙米中的可溶性含量蛋白質(zhì)降低59.01%。也有研究表明，隨著微波比功率（1.4~2.2 W/g）的增加，萌芽糙米中的可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸降低[18]。微波處理導(dǎo)致高粱中可溶性蛋白質(zhì)含量降低的原因一方面可能與處理過程中蛋白質(zhì)發(fā)生熱降解有關(guān)，另一方面也有可能是因為微波處理使高粱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，大量的疏水基團(tuán)外露，蛋白質(zhì)溶解度降低[19]。

圖1 微波處理對高粱總蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of microwave treatment on protein and soluble protein contents in sorghum

2.2 微波處理改變高粱蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果

微波處理前后，高粱蛋白質(zhì)掃描電鏡結(jié)果如圖2所示。微波處理前，龍米糧1號、龍雜13號和紅糯高粱等3種高粱的蛋白質(zhì)均呈塊狀，表面粗糙，凹凸不平，且粒徑較大，但沒有孔狀結(jié)構(gòu)。微波處理后，3種高粱的蛋白質(zhì)也均呈塊狀，粗糙無序，不平整；但與未處理組相比，處理后的高粱蛋白質(zhì)粒徑明顯減小，且表面出現(xiàn)明顯裂紋。這可能是由于微波處理產(chǎn)生了強(qiáng)烈的熱能，從而促進(jìn)了高粱蛋白質(zhì)的分解，進(jìn)而使其粒徑減小，表面產(chǎn)生裂紋[20]。因此，微波處理后高粱蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，故其所表現(xiàn)的理化性質(zhì)也會隨之改變。

圖2 未處理和微波處理高粱蛋白質(zhì)的SEM圖Fig.2 SEM images of natural and microwave treated sorghum proteins

2.3 高粱蛋白質(zhì)FT-IR分析結(jié)果

高粱蛋白質(zhì)的FTIR結(jié)果如圖3所示。微波處理前后，龍米糧1號、龍雜13號和紅糯高粱等3種高粱的蛋白質(zhì)紅外光譜上的吸收峰波數(shù)沒有發(fā)生明顯的藍(lán)移或者紅移，未發(fā)現(xiàn)新的吸收峰，這表明微波處理并未改變高粱蛋白質(zhì)分子的化學(xué)鍵組成，且未產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)，屬于物理變性。但高粱蛋白質(zhì)的吸收峰強(qiáng)度有所不同，與未處理相比，處理組的吸收峰強(qiáng)度明顯強(qiáng)于未處理組。

圖3 未處理和微波處理高粱蛋白質(zhì)的FT-IR圖譜Fig.3 FT-IR profiles of sorghum proteins treated with natural and microwave

圖3表明，高粱蛋白質(zhì)在3010~2700 cm?1內(nèi)有明顯的吸收峰，這主要是烴類的氫鍵或碳碳鍵伸縮振動峰，在2800 cm?1附近出現(xiàn)的吸收峰主要是-NH和-OH的伸縮振動峰[21]，而在1745 cm?1附近出現(xiàn)的伸縮振動峰主要是C=O鍵的特征峰[22]。在1600 cm?1附近的吸收峰是蛋白質(zhì)典型的肽鍵（O=C-N-H）伸縮振動峰[23]。在1300~1200 cm?1范圍內(nèi)的伸縮振動峰主要是由O-H和C-O引起的，而在1150~1000 cm?1范圍內(nèi)的伸縮振動峰則是由碳水化合物產(chǎn)生的[24]。

2.4 微波處理降低高粱蛋白質(zhì)體外消化率結(jié)果

如圖4所示，微波處理前，龍米糧1號、龍雜13號和紅糯高粱等3種高粱的蛋白質(zhì)消化率為60%~70%。龍雜13號高粱的蛋白質(zhì)消化率顯著（P<0.05）高于其他2種高粱。Awika等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高粱中蛋白質(zhì)的結(jié)合形式及脂類、多酚、膳食纖維、細(xì)胞壁等成分均可導(dǎo)致抗酶解復(fù)合物的形成，從而影響高粱蛋白質(zhì)的消化率。因此，本研究中，3種高粱蛋白質(zhì)的消化率存在差異的原因可能與其自身組成成分有關(guān)。微波處理后，3種高粱的蛋白質(zhì)消化率分別顯著降低 17.40%、15.55%和 43.63%（P<0.05）。這與Duodu等[26]研究結(jié)果相類似，高粱在熱處理后其蛋白質(zhì)消化率降低約30%，由于在熱處理過程中高粱內(nèi)部形成大量的含有二硫鍵的低聚蛋白質(zhì)，導(dǎo)致其消化率降低。

圖4 微波處理對高粱蛋白質(zhì)體外消化率的影響Fig.4 Effects of microwave treatment on in vitro digestibility of sorghum protein

2.5 微波處理對高粱粉持水力和持油力的影響結(jié)果

持水力和持油力是評價谷物食品口感和風(fēng)味的重要參數(shù)。如圖5所示，微波處理前，龍米糧1號、龍雜13號和紅糯高粱等3種高粱粉的持水力和持油力均存在顯著差異（P<0.05），持水力為別1.30、1.35和1.50 g/g，持油力分別為1.27、1.35和1.20 g/g。微波處理后3種高粱的持水力分別提高了0.34、0.40和0.32 g/g，而持油力分別降低了0.11、0.18和0.08 g/g。這與Sharanagat等[27]研究的結(jié)果相一致，與對照組相比，隨著微波處理時間（5~15 min）的增加，高粱粉的持水力顯著提高0.25 g/g，持油力顯著降低0.10 g/g。研究表明，微波處理可導(dǎo)致谷物表面出現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，谷物內(nèi)部聚合物減少，從而增加谷物粉的持水力；而持油力降低的原因可能與微波處理過程中氨基酸極性的改變有關(guān)[28]。

圖5 微波處理對高粱粉的持水力和持油力的影響Fig.5 Effect of microwave treatment on water - and oil-holding capacity of sorghum powder

2.6 微波處理對高粱粉色度的影響結(jié)果

顏色作為谷物食品的一種重要感官品質(zhì)，對消費(fèi)者的接受度有很大的影響。如表1所示，與未處理的高粱相比，微波處理后，高粱龍雜13號和紅糯L*值均顯著降低（P<0.05），高粱龍米糧1號和紅糯a*值均顯著升高（P<0.05），高粱龍米糧1號和龍雜13號b*值顯著升高（P<0.05），三種高粱的ΔE值均顯著升高（P<0.05）。這與Sharanagat等[29]研究的結(jié)果相一致，微波處理后高粱的a*、b*和ΔE增加，而L*值降低，原因可能是高粱在微波處理過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)。此外，微波處理后龍米糧1號高粱的L*值變化不顯著（P>0.05）原因可能是龍米糧1號是白色高粱，而微波處理后龍雜13號高粱的a*值和紅糯高粱的b*值變化不顯著（P>0.05），可能由于這兩種高粱的表皮呈紅色，麩皮中含有紅色色素，掩蓋了微波處理前后色度的變化。

表1 微波處理對高粱粉色度的影響Table 1 Effect of microwave treatment on sorghum powder chroma

2.7 微波處理對高粱粉表面微生物的影響結(jié)果

微波技術(shù)作為一種傳統(tǒng)的殺菌技術(shù)，因其具有無污染、殺菌速度快等優(yōu)點(diǎn)，近年來在食品加工中得到了廣泛的應(yīng)用。如表2所示，未處理的高粱中菌落總數(shù)和霉菌數(shù)量最高，酵母菌數(shù)量<10 CFU/g。微波處理前，龍雜13號高粱中菌落總數(shù)和霉菌的數(shù)量顯著（P<0.05）高于龍米糧1號和紅糯高粱。推測原因可能是龍雜13號高粱中的含水率高于其他兩種高粱，有助于霉菌等微生物的生長繁殖[30]。微波處理后，3種高粱中的菌落總數(shù)和霉菌的數(shù)量均顯著（P<0.05）低于對照組，菌落總數(shù)和霉菌的滅菌率分別為98.75%和98.94%。這與Srisang等[31]研究結(jié)果相類似，與未處理的谷物相比，微波處理可使谷物表面的微生物數(shù)量減少約90%。研究表明，在微波的作用下，微生物會因分子極化而吸收微波能量，從而使其蛋白質(zhì)變性，失去生物活性，因此微波處理會導(dǎo)致高粱表面微生物數(shù)量降低[32]。

表2 微波處理對高粱粉表面微生物的影響Table 2 Effects of microwave treatment on surface microorganism of sorghum powder

3 結(jié)論

采用微波處理高粱，并對微波處理前后高粱蛋白和高粱粉的理化性質(zhì)進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，微波處理后，高粱蛋白質(zhì)分子表面粗糙、粒徑減小，體外消化率降低，然而其化學(xué)鍵及化學(xué)基團(tuán)并未發(fā)生改變，為高粱食品原料處理提供物理數(shù)據(jù)依據(jù)。此外，微波處理后高粱粉的蛋白質(zhì)含量和持水力增加，可溶性蛋白質(zhì)含量和持油力降低，表面微生物數(shù)量減少，色澤變暗，有助于指導(dǎo)高粱食品加工中化學(xué)指標(biāo)調(diào)整。因此，微波處理對高粱蛋白和高粱粉的理化性質(zhì)具有明顯影響，可為功能性高粱食品的開發(fā)及應(yīng)用提供一定的參考。