王子歡，劉丹怡,2，鄭嘉琛，謝宜桐，韓建春, ，王英男

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030；

2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院, 黑龍江哈爾濱 150028）

大豆分離蛋白（Soybean Protein Isolate, SPI）是一種含有多種必需氨基酸及豐富不飽和脂肪酸的植物蛋白，其蛋白含量在90%以上。主要由大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白組成[1]。大豆分離蛋白因其營養(yǎng)價值和表面活性，常作為乳化劑被廣泛應(yīng)用于食品配方中。然而由于一些外界加工條件（如溫度、pH、濃度等），蛋白的乳化性質(zhì)受到了一定影響[2]。隨著溫度的下降，水相中會形成尖銳的冰晶，穿透油水界面并使乳液變得不穩(wěn)定[3]。而ZHANG等[4]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)pH可以大幅度增強大豆分離蛋白的乳化能力和乳化穩(wěn)定性。所以為了提高其乳化性以適用于更多的生產(chǎn)，要對大豆分離蛋白進(jìn)行改性。目前常用的化學(xué)改性方法有酸堿化、?；⒚擋；⒘姿峄?、糖基化（即美拉德反應(yīng)）等[5]。

蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)是指碳水化合物和蛋白質(zhì)的結(jié)合物在加熱條件下自發(fā)產(chǎn)生，不使用對人體害的化學(xué)產(chǎn)品。反應(yīng)可以分為三個階段：初級、中級和高級。初始階段包括還原糖的羰基與蛋白質(zhì)可利用的?-氨基（賴氨酸是主要的活性氨基）縮合形成席夫堿，以及Amadori化合物的重排[6]。研究證明在初始階段蛋白質(zhì)與糖可以通過共價鍵持久結(jié)合，從而使酸堿度、離子強度和溫度的變化等對結(jié)合產(chǎn)物的影響很小，且功能特性有所改善，包括乳化性質(zhì)的增強。張志凱等[7]研究大豆分離蛋白與木糖的美拉德反應(yīng)，得出美拉德反應(yīng)可以顯著增強SPI的乳化活性。左穎昕等[8]將大豆分離蛋白與葡萄糖在55 ℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，其產(chǎn)物的乳化性質(zhì)得到明顯改善。但是由于美拉德反應(yīng)過程復(fù)雜，如果控制不當(dāng)，就會產(chǎn)生醛、雜環(huán)胺和晚期糖基化末端終產(chǎn)物等有害致癌物質(zhì)[9]，且到后期產(chǎn)物會發(fā)生褐變，不利于蛋白質(zhì)的感官和營養(yǎng)價值。

超高壓（High Hydrostatic Pressure, HHP）處理作為一種新型的加工技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品殺菌、物理改性以及功能性質(zhì)強化等食品工業(yè)[10?11]。其壓力范圍為幾十到幾百兆帕，通過改變反應(yīng)體系的壓力，從而使化學(xué)平衡、反應(yīng)速率以及分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。目前許多研究表明HHP對美拉德反應(yīng)進(jìn)程會產(chǎn)生一定影響，ISAACS等[12]指出壓力極大抑制了雜環(huán)產(chǎn)物、類黑素和揮發(fā)物的形成。MA等[13]通過對高壓下賴氨酸/精氨酸-葡萄糖/果糖模型的研究，發(fā)現(xiàn)高壓延緩了美拉德反應(yīng)的中間和最后階段。KOBAYASHI等[14]對天冬酰胺-葡萄糖模型在100~300 MPa范圍內(nèi)，于120 ℃處理60 min后測定丙烯酰胺和類黑精的濃度。發(fā)現(xiàn)在高壓條件下，所有模型系統(tǒng)中丙烯酰胺的生成都被顯著抑制。BUCKOW等[15]發(fā)現(xiàn)牛血清蛋白與葡萄糖反應(yīng)速率在0.1~600 MPa壓力范圍內(nèi)，隨著壓力的升高而降低。因此，利用HHP對美拉德反應(yīng)中后期具有一定的抑制作用，從而控制美拉德反應(yīng)的進(jìn)程以獲得理想的產(chǎn)物，對超高壓聯(lián)合美拉德反應(yīng)條件的選擇也顯得尤為重要。

近幾年超高壓多用于蛋白質(zhì)的預(yù)處理,在適當(dāng)?shù)臏囟群蛪毫ο?，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，有利于蛋白質(zhì)與糖的共價結(jié)合。而對于蛋白與糖在HHP條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，所得產(chǎn)物（Maillard Reaction Products,MRPs）功能性質(zhì)（例如乳化性質(zhì)）的研究報道很少見。本文通過測定反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度及乳化性質(zhì)，確定HHP下美拉德反應(yīng)的最佳條件，以及在此條件下產(chǎn)物及其乳狀液的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。為制備優(yōu)良性質(zhì)的SPI乳狀液提供新的技術(shù)方法，為拓寬SPI作為乳化劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白、果糖、半乳糖、葡聚糖、海藻酸鈉、魔芋膠 上海源葉生物科技有限公司；九三非轉(zhuǎn)基因大豆油 九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）和鄰苯二甲醛（OPA） 美國Sigma試劑公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

HHP-400高壓設(shè)備 沈陽人和機電工程設(shè)備有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁新徑儀器有限公司；UV2600紫外-可見光分光光度計 日本島津有限公司；數(shù)顯恒溫水浴箱 常州丹瑞實驗儀器設(shè)備有限公司；RET control/t磁力攪拌器、T50高速勻漿機 德國IKA公司；SDS-PAGE電泳儀 美國Bio-Rad公司；CD J-815圓二色譜儀 日本JASCO公司；F4500熒光分光光度計 日本日立有限公司；Malvern激光粒度及ZETA電位儀 英國馬爾文公司；SP-2激光共聚焦顯微鏡 徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MRPs 的制備

1.2.1.1 制備工藝 將 SPI分別與糖按不同糖-蛋白質(zhì)量比（0.4:1、0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1, g:g）溶解于 0.05 mol/L pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌 2 h后，在 4 ℃ 的條件下水化 24 h。置于不同壓力條件下（0.1、100、200、300 MPa）反應(yīng)（12、18、24、30、36、42 h），反應(yīng)結(jié)束后測定所有反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度及乳化活性。

1.2.1.2 糖的選擇 將 5 組含有 2%（W/V）的 SPI溶于磷酸鹽緩沖溶液（0.05 mol/L, pH8.0）中，分別向其中加入果糖、半乳糖、葡聚糖、海藻酸鈉和魔芋膠，蛋白質(zhì)與糖的質(zhì)量比為1:1。磁力攪拌器在室溫條件下攪拌 2 h，在 4 ℃ 的條件下水化 24 h，使蛋白與糖充分接觸水合。轉(zhuǎn)移至PVC袋中封口，放入超高壓處理腔內(nèi)，升壓至實驗所需壓力，再使水浴溫度達(dá)到60 ℃，處理24 h后取出。反應(yīng)結(jié)束后測定5組反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度及乳化活性，確定合適的糖。

1.2.1.3 SPI-糖質(zhì)量比對美拉德反應(yīng)的影響 將2%（W/V）的SPI和 1.2.1.2中選擇的糖與 SPI分別按 0.4:1、0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1的比例溶于磷酸鹽緩沖溶液（0.05 mol/L，pH8.0）中配制成混合溶液，磁力攪拌器（1000 r/min）在室溫條件下攪拌 2 h，在4 ℃的冰箱中水化 24 h，使蛋白與糖充分接觸水合。轉(zhuǎn)移至PVC袋中封口，將樣品放入超高壓處理腔中，升壓至實驗所需壓力，再使水浴溫度達(dá)到60 ℃，處理 24 h后取出。處理壓力分別為：0.1、100、200、300 MPa，處理時間：24 h。反應(yīng)結(jié)束后測其反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度及乳化活性。

1.2.1.4 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)的影響 將2%（W/V）SPI和糖以質(zhì)量比（0.8:1）溶于磷酸鹽緩沖溶液（0.05 mol/L，pH8.0）中配制成混合溶液，其他方法同1.2.1.3，高壓處理時間分別為：12、18、24、30、36、42 h，反應(yīng)結(jié)束后測其反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度及乳化活性。

1.2.1.5 緩沖溶液pH對美拉德反應(yīng)的影響 將2%（W/V）SPI和一定比例的糖分別用 0.05 mol/L pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0磷酸鹽緩沖溶液配制成混合溶液，其他方法同1.2.1.3。反應(yīng)結(jié)束后測其反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度及乳化活性。

1.2.1.6 接枝度的測定 根據(jù) JIANG[16]的方法并稍作改動。將樣品濃度調(diào)整為2 mg/mL，取200 μL加入到 4 mL OPA 試劑中，在 35 ℃ 水浴中反應(yīng) 2 min，測定樣品在340 nm處的吸光值?？瞻讓φ战M為4 mL OPA+200 μL 去離子水。（OPA 試劑的制備：40 mg OPA 溶于 1 mL 甲醇，加入 25 mL 0.1 mol/L硼砂溶液，2.5 mL 20%（W/W）SDS 溶液，100 μLβ-巰基乙醇，用去離子水定容至50 mL。）

接枝度由下式計算：

式中：At為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶液在波長340 nm處的吸光值；A0為未經(jīng)美拉德反應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液在波長340 nm處的吸光值。

1.2.1.7 乳化活性的測定 乳化活性（Emulsifying Activity Index, EAI）是根據(jù) ZHAO 等[17]的方法，稍作改動。反應(yīng)結(jié)束后，用0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液將上述糖基化蛋白與原2% SPI（作為對照）配制成濃度為1 mg/mL的樣品溶液15 mL，分別向其中加入5 mL的大豆油，隨后在室溫下用高速均質(zhì)機均質(zhì)在 10000 r/min條件下均質(zhì) 1 min，立即從幾種乳化液的同一位置取樣50 μL，加入到1 mg/mL的SDS溶液中，混勻后測定500 nm處的吸光值。按上述方法測定的吸光值記為A0，用作空白對照組的是0.1%的SDS溶液。

式中：c為乳化前的蛋白濃度（g/mL）；φ為代表光學(xué)路徑（1 cm）；θ 為油相比例 0.25；DF 為稀釋倍數(shù)100。

1.2.2 MRPs 的結(jié)構(gòu)分析

1.2.2.1 MRPs 的制備 在 1.2.1 實驗中所得的最佳條件下（果糖-蛋白質(zhì)量比：0.8:1，反應(yīng)時間：24 h，pH8.0），分別在 60 ℃、200 MPa 超高壓裝置及 60 ℃常壓水浴中制備SPI美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（分別記為200-MRPs及0.1-MRPs）。再將蛋白與糖按質(zhì)量比0.8:1在常溫常壓條件下于pH8.0的磷酸鹽緩沖液中混合均勻 24 h（記為 SPI-Fru-Mix）。

1.2.2.2 SDS-PAGE 凝膠電泳分析 根據(jù)LAEMMLI等[18]的電泳方法并稍作修改，方法如下：

制膠：配制12%分離膠和5%濃縮膠，小心注入凹型玻璃板與平玻璃板之間，避免產(chǎn)生氣泡，插入梳子等待凝膠形成。

樣品處理：將 1.2.2.1的 3種樣品（200-MRPs、0.1-MRPs、SPI-Fru-Mix）與 2% SPI濃度均調(diào)整到2 mg/mL，再加入等體積的樣品緩沖液（0.15 mol/L、pH6.8 的 Tris-HCl溶液中加入 4% SDS、2%β-巰基乙醇、20%甘油和0.02%溴酚藍(lán)）。

電泳：樣品在水浴中煮沸5 min，冷卻后用進(jìn)樣針向孔中注入 10 μL。倒入電極緩沖液（pH8.3、0.1% SDS、0.384 mol/L 甘氨酸和 0.05 mol/L Tris）開始電泳，初始電壓為80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入到分離膠后，將電壓增大到120 V，當(dāng)?shù)竭_(dá)距底部還有1 cm時結(jié)束。

染色：取出凝膠放入平皿中，在考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（向100 mL 50%甲醇、6.8%乙酸混合溶液中加入 0.1 g R-250 考馬斯亮藍(lán)）中染色 10 min，平皿置于水平搖床上不斷搖晃。

脫色：將凝膠放置于脫色液（7.5%冰醋酸，5%甲醇）脫色，直至膠背景透明。

1.2.2.3 圓二色性光譜分析 圓二色性光譜（Circular Dichroism, CD）是根據(jù) FU等[19]的方法并稍作改動。用磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH7.0）將樣品 200-MRPs、0.1-MRPs、SPI-Fru-Mix、SPI稀釋至濃度為0.1 mg/mL 置于 CD J-815 圓二色譜儀上進(jìn)行測定。光譜分析條件：掃描范圍：190~250 nm、掃描速度為50 nm/min、光譜間隔 1 nm，狹縫寬 1 nm、靈敏度20 mdeg。通過儀器提供的軟件：the Model JWSSE-480 Protein Secondary Structure Estimation Program，由儀器提供的Reed氏參照CD光譜估算花生球蛋白二級結(jié)構(gòu)中α—螺旋，β—折疊，β—轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所占的比率。

1.2.2.4 內(nèi)源熒光光譜分析 參照LI[20]的方法并略作調(diào)整。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）將樣品稀釋至濃度為1 mg/mL。設(shè)定參數(shù)：熒光光譜激發(fā)波長295 nm，掃描發(fā)射光譜范圍310~450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均5 nm，間隔為0.2 nm，掃描速度為 1200 nm/min，光電倍增管負(fù)高壓 400 V。

1.2.3 MRPs 乳狀液的性質(zhì)

1.2.3.1 乳狀液的制備 參照根據(jù) SHI等[21]的方法，稍作改動。取一定量的200-MRPs、0.1-MRPs、SPI-Fru-Mix 以及 2% SPI，用 0.1 mol/L、pH7.0 的磷酸鹽緩沖液配制為蛋白濃度為1 mg/mL的溶液15 mL，分別向其中加入5 mL的大豆油，隨后在室溫下用高速均質(zhì)機均質(zhì)在10000 r/min條件下均質(zhì)1 min，均質(zhì)后加入 0.02% NaN3抑菌劑，測定乳狀液的乳化活性、乳化穩(wěn)定性、粒徑、電位以及微觀特征。

1.2.3.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性 參照1.2.1.7的方法測定上述乳狀液的吸光度A0。乳狀液靜置10 min后，依照同樣的方法測定溶液的吸光值A(chǔ)10。根據(jù)下列公式計算乳化穩(wěn)定性（Emulsifying Stability Index,ESI）：

1.2.3.3 乳狀液的粒徑 將 1.2.3.1均質(zhì)后的乳狀液，使用Malvern激光粒度分析儀測定幾種乳狀液的粒度分布。

1.2.3.4 乳狀液的電位 將1.2.3.1均質(zhì)后的乳狀液分別用pH7.0、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液調(diào)整到合適的濃度[22]，注入到毛細(xì)管吸收池中，使用Malvern電位儀測定四種乳狀液的電勢。

1.2.3.5 乳狀液微觀觀察 乳狀液中油滴和蛋白質(zhì)的大小及分布等微觀信息可用激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）進(jìn)行觀察。熒光染料配制方法如下：油滴染色采用尼羅紅無水乙醇溶液（1 mg/mL）為染料，激發(fā)波長為 488 nm；蛋白質(zhì)染色采用尼羅藍(lán)異丙醇溶液（1%）為染料，激發(fā)波長為633 nm；兩種染料均需避光保存。

向1 mL乳狀液加入25 μL尼羅紅染色液和20 μL尼羅藍(lán)染色液，振蕩混勻后避光靜置0.5 h。在提前清潔過的載玻片上滴加約5 μL處理好的乳狀液，涂布均勻后蓋上蓋玻片，為防產(chǎn)生氣泡要緩慢進(jìn)行，將制備完成的樣品放在載物臺上，在較短的時間內(nèi)用40倍物鏡觀察乳狀液的共聚焦圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗進(jìn)行三次重復(fù)獨立操作，其結(jié)果表示為X±SD。數(shù)據(jù)分析采用軟件Statistix 8.1和Origin 8.0，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)-糖美拉德反應(yīng)條件的篩選

2.1.1 糖的選擇 由圖1可知，分別向蛋白溶液中加入等量的不同種類的糖，在200 MPa的高壓裝置中反應(yīng)24 h后，半乳糖的接枝度達(dá)到最高，為（36.08%±0.021%），其次是果糖，為（32.69%±0.109%）。葡聚糖、海藻酸鈉以及魔芋膠的接枝度均較弱?？赡苡捎诎肴樘桥c果糖為單糖反應(yīng)速度較快，而海藻酸鈉及魔芋膠是結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的多糖，與蛋白反應(yīng)的基團(tuán)可能被埋藏在多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，與蛋白反應(yīng)的概率降低。并且多糖具有較弱的還原性和較強的分子空間位阻[23]，所以接枝度較低。果糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化活性（79.33±0.03）m2/g高于半乳糖且高于其他四種糖（P<0.05），比未經(jīng)任何處理的 SPI增加了（39.79±0.024）m2/g?？赡苡捎谌芤赫扯炔煌?，與SPI共價結(jié)合后，較高的溶液粘度會削弱蛋白的界面性質(zhì)[24]。果糖在該實驗中展現(xiàn)出了良好的接枝度及乳化活性，故本試驗選擇果糖作為還原糖，與SPI進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

圖 1 不同種類的糖對接枝度和乳化活性的影響Fig.1 The effect of different kinds of sugar on degree of grafting and emulsifying activity

2.1.2 糖-蛋白質(zhì)質(zhì)量比對美拉德反應(yīng)接枝度及乳化性的影響 由圖2（a）可知，當(dāng)壓力達(dá)到100、200或300 MPa時，SPI-Fru的接枝度在不同質(zhì)量比條件下均呈下降趨勢，低于 0.1 MPa（P<0.05）?？赏茰y出SPI-Fru美拉德反應(yīng)在壓力達(dá)到或超過100 MPa時，SPI-Fru美拉德反應(yīng)受到抑制。因為在恒定溫度下，此反應(yīng)的產(chǎn)物體積大于反應(yīng)物體積，增加壓力會使反應(yīng)速率降低[25]。隨著果糖比重的增加，產(chǎn)物接枝度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與GU等[26]研究所得改性產(chǎn)物接枝度變化趨勢相似?？赡芤驗楫?dāng)果糖加入過多時，使空間位阻加大，對果糖-蛋白反應(yīng)產(chǎn)生阻礙，所以當(dāng)果糖與蛋白的質(zhì)量比超過0.8:1后反應(yīng)接枝度降低。圖2（b）當(dāng)壓力為200 MPa時SPI-Fru的乳化活性達(dá)到最大，高于其他壓力條件下的乳化活性（P<0.05）。推測原因可能是，當(dāng)壓力為 0.1 MPa 和100 MPa時美拉德反應(yīng)程度較大，影響了產(chǎn)物的乳化活性。當(dāng)Fru與SPI的質(zhì)量達(dá)到0.8:1時乳化活性在不同壓力作用下同樣均達(dá)到最大，最大為（85.36±0.04）m2/g。當(dāng)果糖的添加量過多時乳化活性也逐漸下降，與ZHAO等[17]的研究結(jié)果表示一致。引入過量的果糖分子基團(tuán)，可能會導(dǎo)致蛋白分子在油水界面的吸收速度降低，內(nèi)部結(jié)構(gòu)的展開和復(fù)位也受到影響，從而降低了乳化活性[27]。

2.1.3 高壓反應(yīng)時間對產(chǎn)物接枝度及乳化性的影響由圖3（a）可知，SPI-Fru 在 0.1 MPa 下的接枝度與 100 MPa無顯著差異（P>0.05），較高的壓力對反應(yīng)有抑制作用。隨著反應(yīng)時間的增加，SPI-Fru的接枝度逐漸上升，24 h后接枝度的增加速率明顯減緩。可能由于較長時間的反應(yīng)導(dǎo)致果糖堿性降解，從而使SPI-Fru相互作用減緩[28]。另一方面，可能由于在有限的反應(yīng)空間內(nèi)，賴氨酸容易與果糖迅速結(jié)合，而剩余的氨基酸越來越難以接進(jìn)果糖分子，反應(yīng)時間增加剩余反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)量也在減少，使反應(yīng)速率降低[29]。與此同時反應(yīng)隨著時間會產(chǎn)生不理想的顏色和風(fēng)味，還會增加其他不溶性聚合物生成的可能性。這些不溶性的聚合物是美拉德反應(yīng)的副產(chǎn)物，對人體健康有害[30]。圖3（b）可知，當(dāng)反應(yīng)條件為24 h、200 MPa時，反應(yīng)產(chǎn)物的乳化活性達(dá)到最大。且隨著時間的延長乳化活性降低，該現(xiàn)象與XU等[24]報導(dǎo)的SPI與葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)物乳化活性結(jié)果類似?？赡芤驗镾PIFru產(chǎn)物的生成降低了分子的流動性，削弱了蛋白在油水界面的吸附作用。所以選擇24 h作為反應(yīng)的最佳時間。

圖 2 不同壓力下果糖-蛋白質(zhì)量比對反應(yīng)接枝度及乳化性的影響Fig.2 Effect of fructose-protein ratio on degree of grafting and emulsifying activity under different pressures

圖 3 不同壓力作用不同時間對反應(yīng)產(chǎn)物接枝度及乳化性的影響Fig.3 Influence of different pressure and time on degree of grafting and emulsifying activity of reaction product

2.1.4 緩沖溶液pH對美拉德反應(yīng)接枝度及乳化性的影響 如圖4（a）所示，反應(yīng)接枝度隨著pH的升高而上升，除0.1 MPa外，其他三種壓力的反應(yīng)速率均在pH8.0時較大,但是并不明顯?？赡芤驗閴A性條件下有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行,但是反應(yīng)進(jìn)行程度較大，顏色和風(fēng)味不利于加工生產(chǎn)的應(yīng)用。圖4（b）所示，SPI-Fru反應(yīng)產(chǎn)物的乳化活性在pH<8.0時逐漸增加而在pH>8.0后隨著pH的增加沒有顯著升高（P>0.05），分析原因可能是由于pH在7.0~8.0之間糖基化的SPI溶解度逐漸升高，而pH>8.0后趨于平緩。蛋白的溶解性會對其乳化活性產(chǎn)生一定的影響[31]，所以乳化活性也有所改善且在200 MPa條件下效果最好。所以后續(xù)試驗選擇在pH8.0的緩沖溶液中進(jìn)行。

圖 4 反應(yīng)產(chǎn)物在不同pH不同壓力下的接枝度及乳化活性Fig.4 Degree of grafting and emulsifying activity of reaction product under different pH and pressure

2.2 MRPs的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 MRPs SDS-PAGE 凝膠電泳分析 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）來進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量的分析。蛋白質(zhì)與糖形成美拉德反應(yīng)共價交聯(lián)后其分子量會發(fā)生變化。如圖5所示，結(jié)果與ZHANG等[32]報道的SPI圖譜一致。泳道4展示了SPI的β-伴大豆球蛋白（條帶α'，α，β）和大豆球蛋白（條帶A，B）。泳道1與2的頂端都有新的條帶產(chǎn)生，說明有較大分子量的聚合物產(chǎn)生。且泳道2頂端比泳道1更深，這表明200 MPa的高壓可以抑制美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，與SPI-F美拉德反應(yīng)產(chǎn)物接枝度的結(jié)果一致。泳道3的條帶α'，α，β和A幾乎沒有，可能因為糖包裹在蛋白分子上，使得蛋白分子不能與SDS很好的結(jié)合，因此在圖中顏色最淺。

圖 5 MRPs的電泳圖譜Fig.5 Electrophoresis patterns of MRPs

2.2.2 圓二色性光譜分析 遠(yuǎn)紫外區(qū)域圓二色光譜（Far-UV CD）用于研究蛋白的二級結(jié)構(gòu)[33]。根據(jù)樣品的圓二色性光譜，可計算出SPI-Fru二級結(jié)構(gòu)種類的相對含量。蛋白質(zhì)的主要二級結(jié)構(gòu)是有序結(jié)構(gòu)如α-螺旋和β-折疊，以及非有序結(jié)構(gòu)如β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。這些結(jié)構(gòu)的含量變化可以反映蛋白質(zhì)分子的疏松程度。如表1和圖6可知，與SPI相比，SPI-Fru-Mix二級結(jié)構(gòu)的數(shù)值變化較小，這說明糖與蛋白簡單混合對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響弱于美拉德反應(yīng)，與前人用葡聚糖與蕎麥分離蛋白混合物與蕎麥分離蛋白的對比結(jié)果一致[34]。改性后SPI的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，大豆分離蛋白的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加，α-螺旋和β-折疊含量減少，經(jīng)過200 MPa高壓處理產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的含量變化更顯著（P<0.05）（表1）。這表明在反應(yīng)過程中，蛋白質(zhì)分子被糖分子完全延伸，內(nèi)部基團(tuán)暴露，這導(dǎo)致α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)分解[35]。并且樣品200-MRPs中α-螺旋含量最少以及無規(guī)則卷曲含量最多說明HHP可以進(jìn)一步促進(jìn)SPI結(jié)構(gòu)的展開，使SPI結(jié)構(gòu)由緊密變得松散，提高蛋白質(zhì)的柔韌性，改性效果最好。α-螺旋在HHP和美拉德反應(yīng)處理過程中被破壞，這也被ZHENG等[36]研究證實。

表 1 MRPs的二級結(jié)構(gòu)組成Table 1 Secondary structure composition of MRPs

圖 6 MRPs 的圓二色性光譜Fig.6 CD spectra of MRPs

2.2.3 內(nèi)源熒光光譜分析 內(nèi)源熒光光譜可用來獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。蛋白質(zhì)分子中內(nèi)源熒光主要來自芳香族氨基酸：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）以及苯丙氨酸（Phe）。因為這兩種氨基酸殘基Trp及Tyr殘基對環(huán)境變化較敏感，所以多用Trp的熒光強度來研究蛋白接構(gòu)象的變化[37]。當(dāng)Trp殘基處在偏極性的微環(huán)境時，其最大內(nèi)源熒光強度會減小并且出現(xiàn)紅移[38]。如圖7所示，原始蛋白樣品SPI和簡單混合物SPI-Fru-Mix的熒光強度相差不大，說明簡單混合對大豆分離蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響不大。而200-MRPs與0.1-MRPs產(chǎn)物的熒光強度顯著低于兩者的混合物且發(fā)生了不同程度的紅移，混合物SPI-Fru-Mix的最大掃描波長（λmax）為 334.8 nm，而 0.1-MRPs移至 340.8 nm，200-MRPs移至 339.2 nm。這種現(xiàn)象說明美拉德反應(yīng)及HHP處理的產(chǎn)物200-MRPs與0.1-MRPs中Trp殘基周圍微環(huán)境的極性變大，親水性增加[39]，200-MRPs強于0.1-MRPs。并且改變了SPI及SPI-Fru混合物的結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)變得松散[37]。HHP可以延緩美拉德反應(yīng)的進(jìn)程，所以200-MRPs的熒光強度及λmax均小于0.1-MRPs。

圖 7 MRPs 的內(nèi)源熒光光譜Fig.7 Fluorescence spectra of MRPs

2.3 MRPs乳狀液的性質(zhì)

2.3.1 乳化活性及乳化穩(wěn)定性 如圖8所示，在超高壓作用下，果糖與SPI進(jìn)行美拉德反應(yīng)所得產(chǎn)物的EAI及 ESI顯著提高（P<0.05）。果糖與 SPI混合后，形成的SPI-Fru-Mix為非共價結(jié)合，其乳化性有所提升。將混合物在常壓及200 MPa下加熱反應(yīng)，使果糖與SPI進(jìn)行共價結(jié)合，其乳化活性分別比混合物提高了43.08%、70.79%。大部分研究表明，蛋白質(zhì)與糖類共價交聯(lián)所得產(chǎn)物的功能性質(zhì)優(yōu)于非共價結(jié)合，共價交聯(lián)既可以不破壞糖類的原始特性又可以提高蛋白質(zhì)的功能特性[40]。引入糖使得親水基團(tuán)引入到SPI上，形成的產(chǎn)物結(jié)合了蛋白質(zhì)在油水界面上強烈的吸附特性和糖在水相介質(zhì)中溶解特性，增加了界面活性，所以乳化活性提高。

圖 8 反應(yīng)產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性Fig.8 Emulsifying activity and emulsifying stability of the reaction product

SPI與Fru共價或非共價結(jié)合后，ESI也得到顯著提升（P<0.05）。研究表明，將糖作為穩(wěn)定劑引入水相,增加乳化系統(tǒng)的黏度和油-水界面穩(wěn)定層的厚度,可以顯著提高乳液的穩(wěn)定性[41]。SPI-Fru-Mix乳液與MRPs乳液進(jìn)行比較，MRPs的乳化穩(wěn)定性得到得到改善。由上述2.2.3結(jié)論得知，MRPs的親水性增強，而且與糖的結(jié)合使其空間位阻增大，油-水界面張力降低，可以有效的減少油滴之間的碰撞，以阻礙油滴絮凝，從而提高了SPI的乳化穩(wěn)定性[42]。同時，可能由于與果糖反應(yīng)使SPI帶電荷數(shù)增多，由于靜電排斥力使SPI不易聚集，乳液體系相對穩(wěn)定，乳化穩(wěn)定性相對提高。

由上述2.2.2得知HHP可以進(jìn)一步促進(jìn)SPI結(jié)構(gòu)的展開，且通過2.1.2可知HHP處理后的蛋白質(zhì)不會連接過多的還原糖分子，從而影響其界面活性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)伸展[43]，所以經(jīng)處理后的MRPs乳化性顯著提升（P<0.05）。與此同時HHP會抑制美拉德反應(yīng)進(jìn)程，使美拉德反應(yīng)不會過度使破壞蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，從而降低其乳化活性及乳化穩(wěn)定性。所以HHP處理后MRPs的兩個性質(zhì)較處理前均有所提（P<0.05）。

2.3.2 乳狀液的粒徑 圖9（a）所示的是四種乳狀液的粒度分布，用來評價乳液的乳化穩(wěn)定性。SPI-Fru-Mix出現(xiàn)雙峰而其他三個乳狀液顯示為單峰。呈單峰的乳狀液屬于單分散體系，其中粒子較小而均勻且分布在一定的尺寸范圍內(nèi)。呈雙峰的乳狀液屬于多分散體系，其粒子大小不同且分布在不同的尺寸范圍內(nèi)[44]。與未經(jīng)任何處理的 SPI相比，0.1-MRPs和200-MRPs的乳液出現(xiàn)向較小粒度分布的方向移動，與LI等[45]研究結(jié)果相似。且經(jīng)HHP處理后的MRPs乳液移動范圍最大，說明其液滴粒徑更小更均勻，乳化穩(wěn)定更好。如圖9（b）所示，SPI與果糖MRPs和Mix穩(wěn)定的乳液相比，MRPs乳液的平均粒徑和粒徑分布（PDI）均減小，且經(jīng)過高壓處理的MRPs平均粒徑和PDI顯著小于常壓下的乳狀液（P<0.05）。RIES等[46]提出，與較大的液滴尺寸乳液相比，粒徑較小的乳液會更穩(wěn)定。可以證明，美拉德反應(yīng)可以使更多的蛋白質(zhì)的疏水殘基暴露于油滴的表面，導(dǎo)致其顆粒尺寸減小，從而提供更好的乳液穩(wěn)定性[47]。高壓可以使蛋白質(zhì)的顆粒尺寸變得更小，獲得更穩(wěn)定的乳狀液。

圖 9 乳狀液的平均粒徑和分布情況Fig.9 Average particle size and distribution of emulsions

2.3.3 乳狀液的電位 乳狀液的Zeta電位反映了乳狀液顆粒表面的帶電性質(zhì)，粒子所帶電荷越多其靜電斥力越強，靜電斥力可以有效防止分子的聚集，進(jìn)而可以反映出乳狀液的乳化穩(wěn)定性[48]。由圖10可以看出，在pH7.0的條件下，SPI所帶電荷為負(fù)電荷，SPI與果糖混合溶液的電位為（?10.2±0.03）mV，二者在0.1 MPa發(fā)生美拉德反應(yīng)后，其電位的絕對值增加了（3.66±0.04）mV，在 200 MPa下的 MRPs電位絕對值增加了（4.85±0.04）mV。SPI與Fru結(jié)合后乳狀液電位有所降低，充分說明了帶有負(fù)電荷的果糖分子與蛋白結(jié)合使其負(fù)電荷增多，在200 MPa的HHP條件下，乳狀液表現(xiàn)出更低的Zeta電位，其乳化穩(wěn)定性增強。

圖 10 不同乳狀液的 Zeta 電位Fig.10 Zeta potential of different emulsions

圖 11 不同乳狀液的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.11 Confocal laser scanning microscopy images of different emulsions

2.3.4 乳狀液的微觀觀察 本實驗使用激光共聚焦顯微鏡更直觀地觀察蛋白油脂所形成的乳狀液的微觀形態(tài)，分別使用尼羅紅和尼羅藍(lán)對油脂和蛋白進(jìn)行染色，結(jié)果如圖11所示，圖中紅色表示油脂，綠色表示蛋白。未經(jīng)任何處理的SPI乳液中存在液滴的聚集和蛋白沉淀，加入糖后的SPI-Fru-Mix乳狀液顆粒的分布較為均勻，但是仍有聚集和沉淀產(chǎn)生。經(jīng)過美拉德反應(yīng)的蛋白，不但油脂液滴直徑減小而且蛋白與油脂分布均勻。經(jīng)過HHP處理的MRPs乳狀液的蛋白和油脂呈現(xiàn)出最佳的大小和分布，所以說明經(jīng)過HHP處理的MRPs乳化性能最好。

3 結(jié)論

本研究通過對SPI與Fru的美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化，以接枝度及乳化性為指標(biāo)，結(jié)果表明：200 MPa的壓力對SPI-Fru的乳化性可以顯著提升且接枝度較低，可以抑制美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)壓力為200 MPa、質(zhì)量比為0.8:1、反應(yīng)時間為24 h、溶液pH為8.0時，反應(yīng)的乳化活性及乳化穩(wěn)定性達(dá)到最佳，乳化活性為 (85.36±0.04) m2/g，是 SPI-Fru-Mix 的 1.71 倍，是 SPI的 2.17 倍，乳化穩(wěn)定性為 (27.66±0.03) min，是 SPI-Fru-Mix的 1.15倍，是SPI的1.40倍。還通過在此條件下所制得200-MRPs與0.1-MRPs、SPIFru-Mix以及SPI的結(jié)構(gòu)及其乳狀液的結(jié)構(gòu)對比，圓二色性光譜圖以及內(nèi)源熒光光譜圖表明200 MPa下的HHP影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，使其變得松散且親水性增強。200-MRPs的乳狀液的粒徑變小，電位的絕對值增大且激光共聚焦呈現(xiàn)出粒子均勻分布。說明HHP對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化性質(zhì)有明顯的改善。本實驗優(yōu)化出 HHP作用下，SPI與Fru的美拉德反應(yīng)最佳條件，提高了SPI的乳化性質(zhì)并改變其結(jié)構(gòu)，是改善SPI乳化性質(zhì)的有效方法。同時為SPI美拉德反應(yīng)提供新的技術(shù)，使美拉德反應(yīng)得到更廣泛的應(yīng)用。