張 軍，王 芳，王 杭，于寧康，岳興旺，王晴晴

（鄭州工程技術(shù)學院化工食品學院，河南鄭州 450000）

隨著現(xiàn)代社會文明進程加快，由食物引起的營養(yǎng)過剩等代謝性疾病如：高血脂、糖尿病、卒中等危害越來越嚴重。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）官網(wǎng)（www.diabetesatlas.org）發(fā)布的最新報告，2019年全球約4.63億人患糖尿病，其中我國1.164億；預(yù)測到2045年，全球糖尿病患者會達到7.002億人，我國1.472億人。據(jù)新華網(wǎng)發(fā)布，2019年我國高血脂患者已達4億人[1]。糖尿病的治療主要是使用α-葡萄糖苷酶抑制劑，其中較為常用的是α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）抑制劑阿卡波糖（Acarbose）等藥[2]，高血脂的治療往往選擇血脂代謝關(guān)鍵限速HMGCoA[3]，有效抑制劑是阿托伐他?。ˋtorvastatin）。天然產(chǎn)物小分子影響α-葡萄糖苷酶和HMG-CoA還原酶來改善糖尿病、高血脂越來越受到人們的關(guān)注，如Magana-Barajas等[4]研究胡椒堿、辣椒素對α-Glucosidase的抑制，Mahdavi等[5]分析了天然產(chǎn)物抑制HMG-CoA活性的研究進展。

甜菊糖苷（Steviolglycosides）是從甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）的莖葉中提取出來的具有甜味成分的總稱[6]，甜菊糖苷中的甜菊糖（Stevioside）經(jīng)酶解或使用高碘酸鈉和強堿處理可以得到甜菊醇（Steviol，或斯特維醇），甜菊醇在酸性條件下發(fā)生分子重排得到異甜菊醇（Isosteviol，或異斯特維醇）[7]，甜菊醇與異甜菊醇互為同分異構(gòu)體，分子式：C20H30O3[8]。甜菊醇與異甜菊醇具有多種藥理生物活性[9-10]，如降血糖、降血脂等。Gregersen等[11]的研究表明甜菊糖苷有降低血糖的功能；Gu等[12]基于體外細胞研究了異甜菊醇對胰島素抑制和脂細胞的功能影響；Xu等[13]發(fā)現(xiàn)異甜菊醇有控制胰島素和降血脂作用。以上研究基于藥理學研究思路，可以從表型上解釋糖尿病、高血脂癥治療的因果關(guān)系，對于作用關(guān)鍵靶點及相互作用機理仍需要進一步探討。

隨著計算化學的發(fā)展，“分子對接”成為研究分子相互作用領(lǐng)域的一項重要技術(shù)，其是基于生物信息學的理論模擬方法，從理論上模擬蛋白質(zhì)分子與配體的相互作用情況[14]。它首先運用于探索藥物小分子和受體的作用方式和結(jié)合構(gòu)型，篩選可以與靶點結(jié)合的藥物，解釋藥物分子產(chǎn)生活性的原因，優(yōu)化藥物分子結(jié)構(gòu)[15]。近些年，研究食品功能因子對疾病的干預(yù)逐漸成為熱點，如馬慶一等[16]研究杜仲、桑葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制，葉雅沁等[17]研究南非葉總黃酮的降血脂作用，即對糖尿病、高血脂發(fā)生和預(yù)防提出了新的嘗試，而甜葉菊醇、異甜菊醇與受體的相互作用和分子對接效果未見報道。

本研究依據(jù)甜菊醇、異甜菊醇對高血糖、高血脂病理形成的關(guān)鍵限速酶：α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶的酶動力學反應(yīng)特征，利用AutoDock軟件對甜菊醇、異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶蛋白進行分子對接，以阿卡波糖[2]、阿托伐他汀[3]作參照，探索甜菊醇和異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶的作用機理，為進一步開發(fā)新藥品或功能食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-葡萄糖苷酶、對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、阿卡波糖（純度95%） 上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無水碳酸鈉 分析純，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；甲醇、水、二甲基亞砜 色譜純，天津市福晨化學試劑有限公司；SDS裂解液、二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na）、還原型輔酶Ⅱ（NADPH） 北京索萊寶科技有限公司。

UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津公司；BS 210 S電子天平 德國Sartorius公司；上海雷磁PHS-3CpH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜菊醇與異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用α-葡萄糖苷酶活性的檢測方法、反應(yīng)體系參照文獻[18-19]，設(shè)置甜菊醇與異甜菊醇6個濃度梯度 10、20、40、80、120、160mg/L，設(shè)置陽性對照試驗阿卡波糖 6個濃度梯度 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L，計算α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制濃度（IC50）；取 10、20、40 mg/L三個濃度用雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk）研究甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶活性的抑制類型。

1.2.2 甜菊醇與異甜菊醇對HMG-CoA還原酶活性的抑制作用 HMG-CoA還原酶活性的檢測方法、反應(yīng)體系參照文獻[20-21]方法，設(shè)置甜菊醇與異甜菊醇 6個濃度梯度 10、20、40、80、120、160mg/L，設(shè)置陽性對照試驗阿托伐他汀6個濃度梯度1、2、4、8、12、20 mg/L，計算 HMG-CoA 還原酶 IC50；取10、20、40 mg/L三個濃度用雙倒數(shù)法研究甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA還原酶活性的抑制類型。

1.2.3 甜菊醇、異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶分子對接 配體準備及預(yù)處理：從pubchem數(shù)據(jù)庫下載配體化合物結(jié)構(gòu)（見圖1），使用Chem3D軟件MM2分子力學優(yōu)化，使用AutodockTools1.5.6在PMV中給配體小分子加氫、計算電荷等。

圖1 配體化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of ligand compound

受體準備及預(yù)處理：從PDB數(shù)據(jù)庫http://www.rcsb.org 下載α-Glucosidase（PDB ID：2F6D）和HMGR（PDB ID：1HWK，2.22?阿托伐他汀的催化部分的復(fù)合物）的蛋白晶體結(jié)構(gòu)（含配體），作為本研究對接所用的蛋白，下載為MOL格式。再使用PyMOL軟件對蛋白晶體結(jié)構(gòu)去除其中的溶劑分子、鈉離子和磷酸根離子及原配體，保存為PDB格式，備用。

運用AutoDock軟件預(yù)測甜菊醇、異甜菊醇和對照物阿卡波糖與阿托伐他汀分別于與受體α-Glucosidase、HMG-CoA蛋白的結(jié)合，對接參數(shù)采用默認設(shè)置，用autogrid計算格點能量，采用拉馬克遺傳算法，用半經(jīng)驗的自由能計算方法評價甜菊醇、異甜菊醇、阿卡波糖與阿托伐他汀與蛋白受體之間的結(jié)合情況。使用PyMOL的AutoDock插件進行查看AutoDock分子對接的結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

AutoDock 4.2及AutoDock Tools 1.5.6軟件下載自http://autodock.scripps.edu，美國斯克利普斯研究所官網(wǎng)；蛋白受體晶體結(jié)構(gòu)來源于http://www.rcsb.org數(shù)據(jù)庫；分子可視化分析軟件PyMOL為免費授權(quán)軟件，DeLano Scientific LLC軟件公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同濃度的甜菊醇、異甜菊醇分別與α-葡萄糖苷酶發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果顯示：甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶的抑制呈明顯劑量依賴關(guān)系，隨著濃度增大，抑制率增高。當甜菊醇、異甜菊醇濃度為160 mg/L時對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別達到81.4%與89.1%，見圖2。當阿卡波糖濃度為0.5 mg/L時對α-葡萄糖苷酶的抑制率為96.3%。酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）是用來衡量物質(zhì)效價強度的指標，半數(shù)抑制濃度越低，說明其效價越高，抑制效果越好[22]，由本試驗得出甜菊醇、異甜菊醇、阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的IC50分別為70.75、49.65、0.11 mg/L。因此，甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，但抑制強度遠小于對照物阿卡波糖，抑制強度排序為：甜菊醇＜異甜菊醇＜阿卡波糖。

圖2 甜菊醇、異甜菊醇及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of steviol, isosteviol and acarbose on α-glucosidase

2.2 甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA還原酶的抑制作用

如圖3所示，隨著濃度的增大，甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA還原酶活性抑制率增高。甜菊醇為160 mg/L時，對HMG-CoA還原酶的抑制率達到88.3%，而異甜菊醇濃度為80 mg/L時，抑制率達到85.9%，說明異甜菊醇對HMG-CoA還原酶的抑制作用強于甜菊醇。甜菊醇、異甜菊醇和阿托伐他汀對HMG-CoA還原酶的IC50分別為46.29、36.66、2.11 mg/L，說明甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA還原酶活性具有一定的抑制作用，但抑制作用與小于對照物阿托伐他汀，而甜菊醇活性小于異甜菊醇。酶的半數(shù)抑制濃度取決于酶的活力和來源、濃度以及反應(yīng)時間、溫度、pH等，本實驗HMG-CoA還原酶來自新鮮豬肝，因此，提取過程中盡可能模擬與豬身體環(huán)境相似條件，從而減少可能的誤差。

圖3 甜菊醇、異甜菊醇及阿托伐他汀對HMG-CoA還原酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of steviol, isosteviol and atorvastatin on HMG-CoA

2.3 甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶的抑制類型

由圖4所示，隨著抑制劑甜菊醇、異甜菊醇濃度的上升，α-葡萄糖苷酶Lineweaver-Burk曲線的米氏常數(shù)Km逐漸增加，最大反應(yīng)速度Vm逐漸減小，不同甜菊醇、異甜菊醇濃度的直線交于坐標第二象限的一點，而并非交于橫軸或縱軸[23]，表明甜菊醇、異甜菊醇采用競爭性與非競爭性相混合方式抑制α-葡萄糖苷酶活性，也即甜菊醇、異甜菊醇不僅與α-葡萄糖苷酶的活性部位相結(jié)合，還可與酶的非活性部位相結(jié)合，發(fā)揮抑制作用，因而在酶抑制實驗中展現(xiàn)了明顯的抑制效果，這與韓芬霞等[24]研究異甘草素抑制α-葡萄糖苷酶作用類型相似。

圖4 甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk圖Fig.4 Lineweaver-Burk curve of steviol, isosteviol on α-glucosidase

2.4 甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA還原酶的抑制類型

由圖5所示，不同濃度甜菊醇、異甜菊醇抑制劑的Lineweaver-Burk曲線均為相交于縱軸，隨著抑制劑甜菊醇、異甜菊醇溶液濃度增大，Lineweaver-Burk曲線截距不變，斜率逐漸增大，因此，米氏常數(shù)Km值隨抑制劑濃度的增大而增大，最大反應(yīng)速率Vmax(縱截距為1/Vmax)保持不變，可推測甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA還原酶的抑制類型為競爭性抑制[19]。

圖5 甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA酶的Lineweaver-Burk圖Fig.5 Lineweaver-Burk curve of steviol,isosteviol on HMG-CoA

2.5 對照物阿卡波糖、阿托伐他汀與配體蛋白的對接驗證

利用分子對接軟件Autodock分別構(gòu)建對照物阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶、阿托伐他汀與HMGCoA還原酶的對接模型，確定和驗證該條件的準確性，圖6展示了阿卡波糖、阿托伐他汀分別與α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶的對接模式和氫鍵相互作用。

圖6 阿卡波糖、阿托伐他汀與配體的對接相互作用Fig.6 Docking interaction of acarbose and atorvastatin with ligands

對照物阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶用Autodock作分子對接，對接結(jié)合能最小為-11.43 kcal/mol，其均方根偏差值refRMS值為1.57，一般認為refRMS值小于2就可認為小分子與蛋白質(zhì)受體是有效對接[25]。圖6A可見阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶能很好的結(jié)和，說明參數(shù)設(shè)置合適。把對接結(jié)果用可視化軟件Pymol進行分析，結(jié)果顯示配體作用位點有19 個：TYR63、TYR135、LEU364、LEU471、TRP209、TRP473、TRP67、GLU456、ASP70、TRP362、ALA138、TYR351、 TRP139、 PHE206、 ARG69、 LEU208、GLU211、ARG345、GLU210，與 6個作用位點形成氫鍵作用，分別為：ARG69、ASP70、GLY140、TRP209、GLU210、ARG345，與 Sevcik 等[26]的研究結(jié)果相似。由此可見，阿卡波糖α-葡萄糖苷酶結(jié)合的主要作用力是氫鍵作用。

阿托伐他汀與HMG-CoA還原酶最低結(jié)合能量約為-4.29 kcal/mol，refRMS值為1.26，由圖6B可見，阿托伐他汀與HMG-CoA還原酶LYS633、PHE615、HIS635等位點結(jié)合。與HMG-CoA還原酶殘基LYS633、LYS633、LEU634形成鍵長分別為 2.1?、2.5?、2.6?氫鍵。阿托伐他汀抑制HMG-CoA還原酶的活性，阻礙了膽固醇的合成，從而達到降血脂的目的，他汀類藥物是臨床上的常用降血脂藥物[27]。

2.6 甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶的分子對接分析

用AutodockTools在PMV中打開1.2.3部分中準備好的α-Glucosidase和HMG-CoA分子，加氫、電荷、質(zhì)子化狀態(tài)確認、進行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義，并保存為pdbqt文件，如下圖7。

圖7 α-葡萄糖苷酶和HMG-CoA還原酶結(jié)構(gòu)晶體Fig.7 Crystal structure of α-glucosidase and HMG CoA

經(jīng)Autodock運算分析，對接使用半柔性對接方法，選擇結(jié)合自由能最低的構(gòu)象來進行后續(xù)的分析，并得到甜菊醇、異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶的最佳復(fù)合結(jié)果。

圖8為對接結(jié)果，表明其結(jié)合位點的位置。圖8中所示：半透明區(qū)域表明甜菊醇、異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶相互作用的分子表面，綠色區(qū)是結(jié)合位點區(qū)域，表示甜菊醇、異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合位點，位點均位于其活性口袋內(nèi)。甜菊醇與α-葡萄糖苷酶對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶活性中心點氨基酸殘基中PRO61、ASP62、TYR63、TRP67、LYS127、TRP139、TRP209、GLU210、GLU211、ARG345、TYR351和ASP354等12個氨基酸酸殘基最容易與甜菊醇配體相互作用，這些殘基有疏水作用。異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶對接有 ASP61、PRO62、TYR63、LYS127、TRP139、 TRP209、 GLU210、 GLU211、 ARG345、TYR351等10個氨基酸殘基與甜菊醇配體相互作用。這些氨基酸殘基與異甜菊醇相互作用形成氫鍵等作用力，其中氨基酸殘基TRP209與異甜菊醇形成了鍵長為1.9?的氫鍵作用力，3.0?以內(nèi)相互作用的氨基酸位點有10個。這些位于α-葡萄糖苷酶蛋白的功能域內(nèi)氨基酸均和甜菊醇、異甜菊醇相互作用形成氫鍵、范德華力等作用力，對于α-葡萄糖苷酶的抑制活性有著重要的作用。

圖8 甜菊醇、異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶的分子對接效果圖Fig.8 Molecular docking effect of steviol, isosteviol and α-glucosidase

將甜菊醇與α-葡萄糖苷酶的所有空腔進行對接并計算結(jié)合能，本次對接使用柔性對接，對接自由能越小配體小分子與受體蛋白結(jié)合越穩(wěn)定[28]。甜菊醇、異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶對接自由能分別是-6.09、-7.34 kcal/mol，而經(jīng)典降血糖藥阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶對接自由能-11.43 kcal/mol，因此表明甜菊醇、異甜菊醇有降血糖功效，其中異甜菊醇的活性稍高于甜菊醇。

2.7 甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA還原酶的分子對接分析

經(jīng)Autodock運算，選擇結(jié)合自由能最低的構(gòu)象進行后續(xù)分析，得到甜菊醇、異甜菊醇與HMGCoA還原酶的最佳復(fù)合結(jié)果。

由阿托伐他汀與HMG-CoA還原酶受體之間的結(jié)合情況用半經(jīng)驗的自由能計算方法評價，針對HMG-CoA還原酶蛋白情況將中心軸改為8.077，-14.968，12.92，分析甜菊醇、異甜菊醇與 HMGCoA還原酶結(jié)合的最佳分子對接復(fù)合結(jié)構(gòu)，如圖9所示，發(fā)現(xiàn)甜菊醇與HMG-CoA還原酶的TYR517、TYR533、 MET534、 PRO535、 ILE536、 VAL538、ALA556、ILE762、ALA763、PRO813和 GLN814等11個氨基酸位點產(chǎn)生結(jié)合，對比阿托伐他汀與HMG-CoA還原酶結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，可知作用位點處于活性口袋內(nèi)，功能域內(nèi)并有MET534、ILE536這2個氫鍵。異甜菊醇與HMG-CoA還原酶結(jié)合11個氨基酸，如 TYR517、VAL522、CYS527、GLY532、TYR533、 MET534、 PRO535、 ILE536、 ALA763、PRO813和 GLN814，有 1個 ILE536位氫鍵，異甜菊醇和阿托伐他汀與HMG-CoA還原酶作用的位點基本一致（見圖9B）。

圖9 甜菊醇、異甜菊醇與HMG-CoA還原酶的分子對接效果圖Fig.9 Molecular docking effect of steviol, isosteviol and HMG CoA reductase

在分子對接中，配體構(gòu)象的結(jié)合自由能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，與蛋白質(zhì)受體結(jié)合的親和力就越強，對蛋白質(zhì)受體可能具有抑制活性越強[29]。因此，對接自由能數(shù)值越小說明抑制效果越好，分析得阿托伐他汀、甜菊醇和異甜菊醇分別與配體HMG-CoA還原酶結(jié)合自由能分別為-4.29、-6.24、-6.27 kcal/mol，說明異甜菊醇對配體HMG-CoA還原酶活性的抑制效果比甜菊醇效果好，異甜菊醇通過抑制HMG-CoA還原酶的活性來影響膽固醇的合成，從而達到降血脂的目的。

3 結(jié)論

甜菊醇與異甜菊醇的功能性[30]已被食品行業(yè)廣泛了解和研究，但其在降血糖、降血脂關(guān)鍵靶點和作用機理方面尚未見報道。本研究以甜菊醇與異甜菊醇為試驗材料，經(jīng)過查閱血糖、血脂代謝通路，確定了代謝關(guān)鍵酶：α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶，并在此基礎(chǔ)上進一步考察分析甜菊醇、異甜菊醇與靶點蛋白之間的相互關(guān)系。

通過酶動力學實驗研究結(jié)果表明甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶有抑制作用且隨著甜菊醇、異甜菊醇濃度的升高，其抑制作用逐漸增強。甜菊醇、異甜菊醇對α-葡萄糖苷酶的 IC50高于阿卡波糖（0.11 mg/L）分別為 70.75、49.65 mg/L，說明甜菊醇活性小于異甜菊醇，小于阿卡波糖；通過Lineweaver-Burk曲線判斷甜菊醇、異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶采用競爭性與非競爭性相混合類型。甜菊醇、異甜菊醇對HMG-CoA還原酶的IC50分別為46.29、36.66 mg/L，阿托伐他汀的IC50為2.11 mg/L，甜菊醇、異甜菊醇與HMG-CoA還原酶屬于競爭性抑制類型。

AutoDock分子對接實驗對接自由能和結(jié)合氨基酸及其形成氫鍵數(shù)量[31]，進一步表明甜菊醇、異甜菊醇分別對α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶有明確的效果。阿卡波糖、甜菊醇和異甜菊醇與α-葡萄糖苷酶對接自由能分別是-6.09、-7.34、-11.43 kcal/mol；阿托伐他汀、甜菊醇和異甜菊醇分別與HMG-CoA還原酶自由能分別為-4.29、-6.24、-6.27 kcal/mol。甜菊醇、異甜菊醇對接與α-葡萄糖苷酶、HMGCoA還原酶均形成疏水活性口袋，有多個氨基酸殘基結(jié)合，說明對接有效。

綜上所述，從酶動力學和分子對接方面確定了甜菊醇、異甜菊醇具有對α-葡萄糖苷酶、HMG-CoA還原酶活性的抑制作用，酶動力學試驗與分子對接技術(shù)結(jié)果相互驗證，為探索天然產(chǎn)物的活性機制提供了新方法，為進一步理清作用機制及其在藥物開發(fā)研究中具有重要意義。