顧華蓉，張琦夢(mèng)，穆洪濤，趙孟斌，陳瑜珠，高向陽(yáng),

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室, 廣東廣州 510642；2.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院, 廣東廣州 510303；3.汕頭魚露廠有限公司, 廣東汕頭 515021）

魚露是東南亞沿海國(guó)家的一種傳統(tǒng)調(diào)味品，以低價(jià)值的魚蝦為原料，經(jīng)自然發(fā)酵制成，具有獨(dú)特的鮮美風(fēng)味[1]。魚露中的鮮味肽來(lái)自于原料的酶解產(chǎn)物，是魚露獨(dú)特滋味形成的重要原因[2]。目前對(duì)鮮味肽的研究多集中于分離鑒定，其呈鮮機(jī)理與構(gòu)效關(guān)系尚不明確。鮮味肽評(píng)價(jià)主要依賴感官評(píng)價(jià)與電子舌分析，然而感官評(píng)價(jià)主觀性強(qiáng)、誤差大，電子舌又不能完全還原人的感官系統(tǒng)[3]，因此建立新型的鮮味評(píng)價(jià)模型對(duì)鮮味肽的研究具有重要意義。STC-1細(xì)胞為小鼠小腸內(nèi)分泌細(xì)胞，它可以表達(dá)多種鮮味受體與傳導(dǎo)元件，包括CaSR、GPRC6a、T1R1/T1R3、mGluR1、mGluR4、Gα-gustducin、PLC-β2 和 TRPM5[4-5]，其味覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制與舌上皮味覺(jué)細(xì)胞極其相似[6]，均涉及味覺(jué)感受細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)存庫(kù)中Ca2+的釋放。同時(shí)，研究顯示L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸等多種L-氨基酸及寡肽可引起STC-1細(xì)胞內(nèi)的鈣離子信號(hào)[7-10]，說(shuō)明STC-1細(xì)胞可作為評(píng)價(jià)鮮味肽的感知模型。此外，Yue等[11]研究發(fā)現(xiàn)黃連等苦味化合物使STC-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子顯著增加，還使苦味受體TAS2R38的mRNA表達(dá)量增加，并通過(guò)基因敲除證明苦味化合物激活了TAS2R38受體。毛赟燕[12]用不同濃度的甜味劑刺激STC-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)鈣離子濃度隨蔗糖濃度增加而升高，且蔗糖可誘導(dǎo)甜味受體mRNA表達(dá)。這些研究表明具有鮮味、苦味、甜味或濃厚感的物質(zhì)能引起STC-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)響應(yīng)以及相應(yīng)味覺(jué)受體mRNA表達(dá)量的增加。然而，利用STC-1細(xì)胞對(duì)味覺(jué)物質(zhì)的劑量效應(yīng)研究卻鮮有報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)室前期從傳統(tǒng)發(fā)酵1.5年的潮汕魚露中分離鑒定出了多種二肽與三肽，其中大多數(shù)含有脯氨酸。脯氨酸是甜味氨基酸[13]，且Shinoda等[14]研究發(fā)現(xiàn)含有脯氨酸殘基的苦味肽所呈現(xiàn)的苦味較溫和、易被接受甚至令人愉悅，說(shuō)明已鑒定出的脯氨酸二肽可能對(duì)魚露鮮美滋味的形成起到重要作用。因此，本研究以實(shí)驗(yàn)室從魚露中鑒定得到的12個(gè)脯氨酸二肽[2]為研究對(duì)象，利用STC-1細(xì)胞味覺(jué)感知模型，通過(guò)鈣離子成像技術(shù)探究脯氨酸二肽呈味強(qiáng)度與濃度的關(guān)系，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR探究介導(dǎo)魚露脯氨酸二肽呈鮮的主要受體。本研究利用STC-1小鼠小腸內(nèi)分泌細(xì)胞客觀反映了鮮味肽的劑量效應(yīng)，提供了一種鮮味肽呈味特性的新型評(píng)價(jià)方法，并為鮮味肽呈味機(jī)理與構(gòu)效關(guān)系的研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚露中鑒定得到并進(jìn)行固相合成的12個(gè)脯氨酸二肽（Ser-Pro、Pro-Ser、Gly-Pro、Pro-Gly、Ala-Pro、Pro-Ala、Val-Pro、Pro-Val、Tyr-Pro、Pro-Tyr、Ile-Pro、Pro-Ile）、二肽 pGlu-Pro（純度≥98%）、qRTPCR引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；谷氨酸鈉、蔗糖、檸檬酸、氯化鈉 食品級(jí)，廣州利成實(shí)業(yè)有限公司；奎寧 色譜純，廣州叢源儀器有限公司；STC-1小鼠小腸內(nèi)分泌細(xì)胞（338701） 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；杜氏細(xì)胞培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）（不含鈣鎂、酚紅）、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、PBS緩沖液生化試劑 Gibco公司；Fluo-8 AM 超級(jí)純，上海懋康生物科技有限公司；Steady Pure Universal RNA Extraction Kit、Evo M-MLV Premix for qPCR、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit 湖南艾科瑞生物工程有限公司。

ZA120R4萬(wàn)分之一分析天平 上海贊維衡器有限公司；Nikon ECLIPSE Ti系列倒置顯微鏡 日本尼康；5415R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó) Eppendorf；SMA4000微量紫外分光光度計(jì) Merinton公司；A100基因擴(kuò)增儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)價(jià)小組由10名味覺(jué)正常的學(xué)生組成（5女5男，年齡在20～25歲），并依據(jù)GB/T 16291.1-2012[15]接受了感官培訓(xùn)以辨別五種基本味覺(jué)（酸、甜、苦、咸、鮮）。參考叢艷君等[16]分別以檸檬酸（0.8 mg/mL）、蔗糖（10 mg/mL）、奎寧（0.8 mg/mL）、氯化鈉（3.5 mg/mL）和谷氨酸鈉（3.5 mg/mL）作為酸、甜、苦、咸、鮮的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。樣品以超純水溶解，肽的初始濃度為2 mg/mL，并在此濃度下進(jìn)行感官描述評(píng)價(jià)。采用三角試驗(yàn)法[17]確定每個(gè)魚露二肽的味覺(jué)閾值，將恰好可以區(qū)分樣品與空白溶液時(shí)的稀釋倍數(shù)記為味覺(jué)稀釋因子（Taste dilution，TD），該濃度即為肽的味覺(jué)閾值。稀釋因子采用各感官評(píng)價(jià)員評(píng)定結(jié)果的平均值，且每個(gè)評(píng)定員之間的誤差應(yīng)不超過(guò)2個(gè)稀釋水平。感官評(píng)價(jià)在恒定溫度（24±1 ℃）下進(jìn)行。

1.2.2 STC-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光信號(hào)測(cè)定 以8×104個(gè)/孔的密度將STC-1細(xì)胞接種于24孔板，每孔加500 μL含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h至細(xì)胞占據(jù)孔板的70%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用5 μmol/L Fluo-8 AM鈣離子熒光探針在37 ℃孵育細(xì)胞30 min，分別用HBSS與DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液（不含酚紅）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行漂洗與脫酯化。將細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡下，在第20 s加入不同濃度的谷氨酸鈉或脯氨酸二肽溶液，于490 nm（激發(fā)波長(zhǎng)）和514 nm（發(fā)射波長(zhǎng)）波長(zhǎng)處采集細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光信號(hào)，每5 s一次圖像采集，持續(xù)180 s。樣品均以HBSS溶解，其中谷氨酸鈉（monosodium glutamate, MSG）終濃度為 0.5、1、2、4、8 mmol/L，二肽終濃度為 0.25、0.5、1、2、4 mmol/L，空白組加入等量HBSS。

1.2.3 STC-1細(xì)胞鮮味受體mRNA表達(dá)量測(cè)定 將生長(zhǎng)匯集至60%左右的STC-1細(xì)胞在含有3 mmol/L二肽的培養(yǎng)液中孵育8 h，提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄，再采用SYBR Green嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以鼠源GAPDH基因作為內(nèi)參基因，檢測(cè)不同二肽刺激下細(xì)胞內(nèi)T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a受體mRNA表達(dá)量的變化。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：4 μL SYBR Green Premix Pro Taq HS Premix，2 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，其余用去離子水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑?5 ℃，30 s；第二步：95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

鈣離子信號(hào)的響應(yīng)強(qiáng)度表示為相對(duì)熒光變化[18]：

式中：F表示實(shí)際熒光值，即細(xì)胞區(qū)域“實(shí)時(shí)熒光值-背景熒光值”；F0代表0 s時(shí)的“F”。使用NISElements軟件處理采集到的熒光圖像，每次試驗(yàn)選擇30個(gè)細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)每組平行測(cè)定4次。

qPCR實(shí)驗(yàn)每個(gè)肽樣品設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)平行，每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量表示為 2-ΔΔCt，ΔΔCt為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因校正后PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的差值，其計(jì)算公式為：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示，利用SPSS 25.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，選擇LSD法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)后標(biāo)注的不同字母表示數(shù)據(jù)間具有顯著性差異（P＜0.05）。采用GraphPad Prism 8.0.1進(jìn)行圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 脯氨酸二肽的感官評(píng)價(jià)

對(duì)13個(gè)合成脯氨酸二肽進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其感官特性與稀釋因子如表2所示。感官描述結(jié)果顯示，所有二肽在2 mg/mL濃度下多具有酸味和鮮味，均未表現(xiàn)出苦味。二肽的酸味主要由于R基或C端殘基中羧基的存在，其解離出的氫離子是引起酸味的重要物質(zhì)[19]。目前已報(bào)道的鮮味肽中，有很多肽不僅具有鮮味，同時(shí)還可能呈現(xiàn)一定的酸味、甜味、濃厚感或收斂感，這說(shuō)明鮮味肽的呈味效果不是單一的，而可能具有豐富的口感[20]。因此，本研究中的魚露二肽可能對(duì)魚露的呈鮮起到了重要作用。此外，稀釋因子越大，說(shuō)明肽的閾值越低，則呈味閾值較低的二肽有Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Tyr-Pro、Pro-Ile和 pGlu-Pro。

表2 脯氨酸二肽的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation of proline dipeptides

2.2 STC-1細(xì)胞對(duì)脯氨酸二肽鈣離子熒光響應(yīng)

首先對(duì)鮮味基準(zhǔn)物谷氨酸鈉引起的STC-1細(xì)胞響應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。分別用0.5、1、2、4、8 mmol/L的谷氨酸鈉溶液刺激STC-1細(xì)胞，得到細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線（圖1）。相對(duì)熒光變化率大于0代表胞內(nèi)鈣離子濃度增加，說(shuō)明樣品引起了細(xì)胞響應(yīng)。由圖1可看出，相對(duì)熒光強(qiáng)度在加入谷氨酸鈉后迅速增加，持續(xù)一段時(shí)間后熒光開(kāi)始減弱并逐漸恢復(fù)至平常狀態(tài)。圖1中顯示谷氨酸鈉在0.5 mmol/L時(shí)未引起明顯相對(duì)熒光變化，而在濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)引起明顯鈣熒光信號(hào)，說(shuō)明其閾值介于0.5～1 mmol/L之間。人對(duì)谷氨酸鈉的感官閾值為0.012 g/100 mL[21]，即0.7 mmol/L，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。為了盡可能排除加入樣品時(shí)物理壓力所引起的胞內(nèi)鈣離子濃度變化帶來(lái)的誤差，將相對(duì)熒光變化值大于或等于0.1（ΔF/F0≥0.1）視為有效鈣信號(hào)，同時(shí)將能夠引起ΔF/F0≥0.1的最低濃度記作細(xì)胞對(duì)刺激物的響應(yīng)閾值，因此，將1 mmol/L記錄為STC-1細(xì)胞對(duì)谷氨酸鈉的響應(yīng)閾值。

圖1 不同濃度谷氨酸鈉引起的STC-1細(xì)胞鈣離子熒光響應(yīng)Fig.1 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of MSG

根據(jù)谷氨酸鈉濃度，將13個(gè)脯氨酸二肽分別以0.25、0.5、1、2、4 mmol/L濃度刺激 STC-1細(xì)胞，得到不同程度的鈣信號(hào)響應(yīng)曲線。pGlu-Pro是一種已在醬油、麥麩等物質(zhì)中被分離鑒定出來(lái)的鮮味肽[22]，圖2表明pGlu-Pro引起了STC-1細(xì)胞內(nèi)的鈣離子信號(hào)，進(jìn)一步證明STC-1細(xì)胞可對(duì)鮮味物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)。魚露脯氨酸二肽引起的鈣離子響應(yīng)情況如圖3所示，結(jié)合感官評(píng)價(jià)結(jié)果，所有脯氨酸二肽均未呈現(xiàn)苦味，說(shuō)明鈣信號(hào)并不由苦味引起，而可能主要由二肽激活其他G蛋白偶聯(lián)受體（如鮮味或甜味受體）所引起。與谷氨酸鈉響應(yīng)曲線類似，在加入樣品后，胞內(nèi)鈣離子濃度在短時(shí)間內(nèi)迅速增加至最大值再逐漸回歸常態(tài)。但是有些肽的曲線在一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)并緩慢回落，而有些會(huì)在達(dá)到頂峰后迅速降低，這可能與肽的呈味特性有關(guān)。其中，Gly-Pro、Ala-Pro、Ser-Pro與pGlu-Pro的熒光曲線變化相對(duì)平滑，在達(dá)到峰值后回落緩慢，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的鈣離子能在一定時(shí)間內(nèi)保持較高濃度，這可能會(huì)引起下游信號(hào)的持續(xù)傳遞，從而可能使得這些肽的呈味持續(xù)性較強(qiáng)且口感醇厚。相反有些肽的熒光信號(hào)由峰值回落的過(guò)程迅速，曲線較為尖銳，這可能表明肽的后味或持續(xù)感不足。

圖2 不同濃度pGlu-Pro引起的STC-1細(xì)胞鈣離子熒光響應(yīng)Fig.2 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of pGlu-Pro

圖3 不同濃度脯氨酸二肽引起的STC-1細(xì)胞鈣離子熒光響應(yīng)Fig.3 Calcium fluorescence response in STC-1 cells induced by different concentrations of proline peptides

將13個(gè)脯氨酸二肽與谷氨酸鈉的鈣離子熒光信號(hào)響應(yīng)在相同氨基酸濃度下進(jìn)行比較，各濃度下的熒光響應(yīng)強(qiáng)度如折線圖4所示。除Pro-Ser與Val-Pro未引起有效鈣信號(hào)（ΔF/F0≥0.1），其余11個(gè)二肽均引起不同程度的鈣信號(hào)增強(qiáng)，其中Ser-Pro、Gly-Pro、Pro-Gly、pGlu-Pro、Ile-Pro與 Pro-Ile的熒光響應(yīng)隨氨基酸濃度增加而增強(qiáng)；Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Tyr-Pro與Pro-Tyr的響應(yīng)強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)隨濃度增加而增加，而達(dá)到一定濃度后，其響應(yīng)強(qiáng)度反而減弱。這說(shuō)明肽的呈味效果可能并不會(huì)隨著濃度的增加而一直增強(qiáng)，而可能濃度越大，呈味效果越差。Zhuang等[23]通過(guò)感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多肽ALPEEV、LPEEV、EAGIQ在濃度小于2 g/L時(shí)對(duì)谷氨酸鈉有增鮮作用，而在濃度超過(guò)2 g/L后，肽會(huì)呈現(xiàn)出非常強(qiáng)烈的酸澀味，反而會(huì)抵消增鮮作用。Xu等[24]自草菇鑒定出鮮味肽ASNMSDL與LQPLNAH，在谷氨酸鈉的存在下，這兩個(gè)多肽的鮮味強(qiáng)度在濃度為15 mg/mL之前隨肽濃度的增加而增強(qiáng)，而在超過(guò)15 mg/mL之后鮮味下降。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞響應(yīng)的角度也得到了相似的結(jié)論。此外，Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala與pGlu-Pro在各濃度下的鈣信號(hào)強(qiáng)度均高于谷氨酸鈉，推測(cè)它們可能具有優(yōu)于鮮味基準(zhǔn)物的呈味強(qiáng)度，而Tyr-Pro幾乎在各濃度下的鈣信號(hào)均弱于谷氨酸鈉。

圖4 脯氨酸二肽的熒光響應(yīng)強(qiáng)度隨濃度變化情況Fig.4 Fluorescence response intensity of proline dipeptides varies with concentration

STC-1細(xì)胞對(duì)脯氨酸二肽的鈣離子熒光響應(yīng)情況如表3所示，11個(gè)引起鈣信號(hào)的二肽中，除Pro-Gly的閾值為2 mmol/L，其余10個(gè)肽的響應(yīng)閾值均小于或等于1 mmol/L，其中在相同氨基酸濃度下閾值低于谷氨酸鈉的二肽有Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Pro-Ile、pGlu-Pro。結(jié)合感官評(píng)價(jià)結(jié)果，這些鈣信號(hào)響應(yīng)閾值較低的二肽也具有較大的稀釋因子，說(shuō)明二肽的呈味閾值與細(xì)胞響應(yīng)閾值有一定相關(guān)性。兼具最低響應(yīng)閾值（0.25 mmol/L）與較強(qiáng)最大信號(hào)響應(yīng)（ΔF/F0≥0.5）的肽有 Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val與 Pro-Ile，表明這些二肽具有較強(qiáng)的呈鮮特性。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，除Tyr-Pro外的10個(gè)脯氨酸二肽的最大鈣信號(hào)強(qiáng)度均高于谷氨酸鈉，將其按數(shù)值大小排序?yàn)镮le-Pro≈Pro-Val＞Ser-Pro＞Ala-Pro＞Pro-Ala＞Pro-Tyr＞Pro-Ile＞Gly-Pro≈Pro-Gly≈pGlu-Pro（“≈”表示兩者無(wú)顯著性差異）。

表3 STC-1細(xì)胞對(duì)脯氨酸二肽的鈣離子熒光響應(yīng)情況Table 3 Calcium fluorescence response of STC-1 cells to proline dipeptides

2.3 脯氨酸二肽對(duì)STC-1細(xì)胞鮮味受體mRNA表達(dá)量的影響

文獻(xiàn)報(bào)道采用甜味或苦味化合物、氨基酸及濃厚感肽刺激STC-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)味覺(jué)受體的mRNA表達(dá)量增加，并通過(guò)基因敲除等方法驗(yàn)證了這些味覺(jué)物質(zhì)的呈味依賴于相應(yīng)受體，說(shuō)明味覺(jué)物質(zhì)能促進(jìn)相應(yīng)味覺(jué)受體mRNA的表達(dá)[10-12]。異源二聚體T1R1/T1R3已被確定是主要的鮮味受體[25-26]；CaSR與GPRC6a對(duì)某些L-氨基酸敏感，被看作是鮮味的候選受體[20,27-29]。因此本研究對(duì)魚露脯氨酸二肽刺激下STC-1細(xì)胞中T1R1、T1R3、CaSR和GPRC6a基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，探究脯氨酸二肽對(duì)鮮味受體基因表達(dá)的影響，進(jìn)而判斷介導(dǎo)脯氨酸二肽呈鮮的受體。結(jié)果如圖5所示，相對(duì)表達(dá)量大于1說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的mRNA表達(dá)量大于空白組。在含有3 mmol/L二肽的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 h后，細(xì)胞中各個(gè)鮮味受體的mRNA表達(dá)量發(fā)生了不同程度的變化。已報(bào)道的鮮味肽pGlu-Pro對(duì)T1R1、T1R3和GPRC6a的mRNA表達(dá)量有上調(diào)作用，證明鮮味物質(zhì)可促進(jìn)鮮味受體mRNA的表達(dá)。

圖5 脯氨酸二肽對(duì)STC-1細(xì)胞鮮味受體mRNA表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of proline dipeptides on mRNA expression of umami receptors in STC-1 cells

13個(gè)脯氨酸二肽中有11個(gè)肽對(duì)T1R1的mRNA表達(dá)具有上調(diào)作用，其中Ser-Pro、Gly-Pro、Pro-Gly、Ala-Pro、Pro-Val、Tyr-Pro與 pGlu-Pro對(duì)T1R1上調(diào)作用顯著（P＜0.05），多為X-Pro肽，說(shuō)明這些脯氨酸二肽可能激活了T1R1受體從而呈現(xiàn)鮮味。有8個(gè)肽對(duì)T1R3的mRNA表達(dá)有上調(diào)作用，其中具有顯著上調(diào)作用（P＜0.05）的均為Pro-X二肽（Pro-Gly、Pro-Val、Pro-Ile），而有輕微上調(diào)作用的均為XPro二肽（Ser-Pro、Gly-Pro、Ala-Pro、Val-Pro、pGlu-Pro）。日本學(xué)者認(rèn)為CaSR是濃厚感物質(zhì)的主要感受器，可感知濃厚感肽[30]，結(jié)果顯示Pro-Tyr與Ile-Pro對(duì)T1R1、T1R3無(wú)顯著影響，但對(duì)CaSR有顯著上調(diào)作用，說(shuō)明它們可能激活了CaSR而呈現(xiàn)濃厚感。對(duì)GPRC6a有顯著上調(diào)作用的肽有Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Val、Pro-Ile與 pGlu-Pro，其中在 Ala-Pro與Pro-Ala的影響下GPRC6a的mRNA表達(dá)量分別達(dá)到了空白組的29倍和16.5倍左右，這可能與GPRC6a對(duì)小分子中性L-氨基酸敏感有關(guān)[31]。與鈣信號(hào)響應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是，Pro-Ser與Val-Pro對(duì)四個(gè)受體的表達(dá)并無(wú)顯著上調(diào)甚至有抑制效果，進(jìn)一步解釋了這兩個(gè)肽不具有鮮味的原因。

此外，氨基酸組成相同的一對(duì)肽，其鈣信號(hào)響應(yīng)活性及對(duì)鮮味受體表達(dá)的影響大多有明顯區(qū)別，說(shuō)明肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)影響其呈味活性。Ishibashi等[32]通過(guò)感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)二肽Phe-Pro的苦味明顯強(qiáng)于Pro-Phe，說(shuō)明氨基酸的排列順序確實(shí)會(huì)影響肽的呈味特性。Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Val對(duì)四個(gè)受體 mRNA的促表達(dá)程度均分別強(qiáng)于Pro-Ser、Pro-Ala和Val-Pro，且在胞內(nèi)鈣信號(hào)實(shí)驗(yàn)中，Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Val具有更低的閾值及更大的最大響應(yīng)值，表明二肽的呈味活性與其對(duì)鮮味受體mRNA表達(dá)的影響之間可能存在一定正相關(guān)性。

3 結(jié)論

本文以STC-1細(xì)胞為味覺(jué)感知模型，結(jié)合感官評(píng)價(jià)，對(duì)魚露中脯氨酸二肽的呈鮮特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，魚露中的12個(gè)脯氨酸二肽多具有鮮味和酸味，均無(wú)苦味；二肽的呈味閾值與其細(xì)胞響應(yīng)閾值有一定相關(guān)性，且呈味強(qiáng)度高的肽其響應(yīng)閾值也較低。呈味活性較強(qiáng)的肽按強(qiáng)弱順序依次為Pro-Val、Ser-Pro、Ala-Pro、Pro-Ala、Pro-Ile，其中Ser-Pro、Ala-Pro與Pro-Ala活性強(qiáng)于谷氨酸鈉，它們可能是魚露呈鮮的關(guān)鍵鮮味肽。脯氨酸二肽對(duì)四個(gè)鮮味受體的mRNA表達(dá)量有不同程度的影響，多數(shù)對(duì)T1R1的表達(dá)有上調(diào)作用，表明T1R1可能是介導(dǎo)脯氨酸二肽呈鮮的重要受體。此外，脯氨酸二肽的呈味活性與其對(duì)鮮味受體mRNA表達(dá)的影響之間存在一定正相關(guān)性。本研究提供了一種非人工感官的評(píng)價(jià)方法來(lái)反映鮮味肽的呈鮮特性，同時(shí)為鮮味肽呈味機(jī)理的研究提供了一定理論基礎(chǔ)。魚露脯氨酸二肽呈鮮的構(gòu)效關(guān)系尚未明確，下一步將利用分子對(duì)接方法對(duì)這些二肽與鮮味受體的相互作用進(jìn)行研究，同時(shí)這些鮮味肽與其他鮮味物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)也有待進(jìn)一步探索。