于 紅，馬曉琳，劉永峰，張 瑞,

（1.新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學(xué)自治區(qū)重點實驗室，新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點實驗室，干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實驗室，中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心，新疆烏魯木齊830054；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

動物宰后的成熟過程又稱排酸處理，在此過程會發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)。該反應(yīng)夠促使肉質(zhì)變得柔軟、多汁，美味[1]，同時也能對肉類風(fēng)味的前體物質(zhì)產(chǎn)生影響[2-3]，降低了山羊肉的膻味，改善羊肉口感和營養(yǎng)價值。宰后成熟過程對改善肉品質(zhì)有很大幫助，宰后成熟會影響肌肉的剪切力、色澤、pH、蒸煮損失率、蛋白質(zhì)含量和肌漿（原）蛋白溶解度的變化，繼而影響肉質(zhì)的嫩度、持水性、風(fēng)味等理化指標(biāo)[4]。肌肉在向優(yōu)質(zhì)肉轉(zhuǎn)化中發(fā)生巨大的生化變化，這從根本上決定了生肉的大部分重要品質(zhì)（顏色、保水能力和嫩度）[5-6]。前期項目組針對陜北橫山羊?qū)υ缀?8 h內(nèi)不同部位的肉品質(zhì)進行探索，得到背部最長肌的嫩度和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性優(yōu)于腹部肌肉[7]。

當(dāng)動物被屠宰后，肌肉組織不會立即停止代謝，許多代謝能量系統(tǒng)（糖原分解、糖酵解和氧化磷酸化）試圖在死后早期維持肌肉內(nèi)ATP穩(wěn)態(tài)[5]。由于糖酵解作用產(chǎn)生乳酸，促使H+的積累，導(dǎo)致肌肉的pH顯著下降，通過調(diào)控宰后的能量代謝以及肌肉收縮反應(yīng)來影響肉的品質(zhì)[5]。適宜的成熟時間能夠提高羊肉的嫩度和風(fēng)味，同時參與宰后成熟過程的物質(zhì)受到復(fù)雜的調(diào)控，對肉類品質(zhì)的發(fā)展也起著重要的作用。

新疆山羊是一種絨肉奶兼用的山羊品種，常以瘦肉含量多、有嚼勁為優(yōu)點，且肌纖維細嫩，營養(yǎng)價值較高，受到廣大消費者的喜愛。鑒于不同成熟時間羊肉在嫩度、保水性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都有明顯差異，且目前對具有地方特色的新疆山羊研究以品種改良上居多，在肉品質(zhì)方面變化機制方面的研究較少，本研究以1.5周歲的新疆公山羊為研究對象，通過研究宰后不同成熟時間下的肉質(zhì)理化性質(zhì)變化，探討宰后成熟對山羊肉品質(zhì)的影響作用，為優(yōu)化羊肉儲存方式以及合理改善羊肉品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肉樣品 取自新疆烏魯木齊市華凌畜牧屠宰基地。取三只1.5周歲左右健康的新疆山羊（公）的背部最長肌為研究對象；氯化鉀、硼酸（99.8%）、海砂、氫氧化鈉、95%乙醇、硫酸銅、硫酸鉀、石油醚、硫酸、甲醇、鹽酸 分析純，烏魯木齊科華偉業(yè)生物科技有限公司。

便攜式pH計 濟南歐萊博技術(shù)有限公司；H721型可見分光光度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市億能實驗儀器廠；CR-400性便攜式色差儀 日本Konica minolta公司；TA-XT2型質(zhì)構(gòu)儀 北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；JA2003N電子天平 北京海天友誠科技有限公司；KDN-04A凱式定氮儀 上海坤誠科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 在同一羊場選擇1.5周歲左右的3只健康且未去勢新疆山羊（屠宰率最高）為三組重復(fù)試驗依據(jù)并帶回實驗室進行宰殺，盡量減少在屠宰過程的應(yīng)激反應(yīng)[8]。宰后取3只羊背部最長肌上少許肉樣，作為宰后0 h樣品。其余樣品放置4 ℃冰箱進行宰后成熟過程，并分別在宰后前期（宰后12 h）、中期（宰后 24 h）、后期（宰后 48 h）不同時間點的羊肉進行取樣。

1.2.2 pH測定 按照國標(biāo)GB/T 5009.237-2016進行調(diào)整，稱取去筋膜的碎肉樣約4 g于燒杯中，加0.1 mol/L KCl溶液 40 mL，溫下放置30 min，用pH計測定，每組測量3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3 質(zhì)構(gòu)特性（TPA）的測定 參照劉永峰等[9]的方法，取厚度約為1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm長方體肉樣，采用質(zhì)構(gòu)儀進行檢測。參數(shù)設(shè)置：P36R探頭；側(cè)前、中、后的速度均為1.0 mm.s-1；檢測觸發(fā)力5 g；檢測時間間隔5 s，測定內(nèi)聚性、咀嚼性、回復(fù)性等5個質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)。

1.2.4 保水性的測定 參照夏安琪等[10]方法測定滴水流失率，取宰后時間為0、12、24和48 h的肉樣，稱重并分別記下質(zhì)量為W1，鉤住肉樣置于一個吹氣膨脹的保鮮袋中，不與袋子接觸并扎緊袋口，放在4 ℃恒溫箱放置24 h，取出肉樣稱重質(zhì)量為W2，羊肉滴水流失率計算公式：滴水流失率(%)=[(W1-W2)/W1]×100。

蒸煮損失測定方法參照Honikel等[11]的方法，分別取宰后時間為0、12、24和48 h的肉樣稱重并記下質(zhì)量為G1，將肉樣放入蒸煮袋中封口并80 ℃水浴45 min，隨后冷卻并在4 ℃過夜。吸干肉樣表面汁液并再次稱重，質(zhì)量為G2。蒸煮損失率計算公式：蒸煮損失 (%)＝[(G1-G2)/G1]×100。

1.2.5 蛋白溶解度 參考相關(guān)文獻[12]進行測定。在1.0 g碎肉樣中加入0.025 mol/L預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液10 mL，在冰浴下勻漿3次。4 ℃搖動抽提12 h，然后離心 20 min，上清液用 BCA(Bicinchoninic acid)法測定的蛋白濃度即為肌漿蛋白溶解度。隨后稱取1.0 g碎肉樣，加20 mL含1.1 mol/L碘化鉀0.1 mol/L預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液，步驟同上，即為總可溶性蛋白溶解度。肌原纖維蛋白溶解度按式（1）計算。

式中：c-肌原蛋白溶解度，μg /μL；c1-全蛋白溶解度，μg/μL；c2-肌漿蛋白溶解度，μg/μL。

1.2.6 糖原測定 按照國標(biāo)GB/T 9695.31-2008進行調(diào)整，取成熟后不同時間點肉樣，用生理鹽水漂洗并剪成碎末。然后精確稱1000 mg肉樣于試管中，加入3 mL 30% KOH并沸水煮2 h冷卻至室溫，后加入6 mL無水乙醇搖均勻靜置1 min，在3000 r/min、4 ℃下離心15 min。沉淀加入6 mL 1 mol/L硫酸溶解。取1 mL樣品加入5 mL蒽酮試劑，橡膠塞封閉試管，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，最后在分光光度計620 nm處測定OD值。

1.2.7 蛋白質(zhì)提取與酶解 稱取宰后不同成熟時間的樣品，采用 SDT（4%(w/v)SDS，100mmol/L Tris/HCl pH7.6，0.1 mol/L DTT）裂解法提取蛋白質(zhì)，然后采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量。每個樣品取適量蛋白質(zhì)采用 FASP（Filter aided proteome preparation）方法進行胰蛋白酶酶解[13]。

1.2.8 LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集 每份樣品采用HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。色譜柱以95%的0.1%甲酸水溶液平衡，樣品經(jīng)過分析柱分離，流速為300 nL/min。后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進行分析。檢測方式為正離子，母離子掃描范圍300～1800 m/z，一級質(zhì)譜分辨率70000在質(zhì)荷比200 m/z處，AGC（Automatic gain control） target為1e6，Maximum IT 為50 ms，動態(tài)排除時間（Dynamic exclusion）為 60.0 s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集 20個碎片圖譜（MS2 scan），MS2 Activation Type為 HCD，Isolation window為 2 m/z，二級質(zhì)譜分辨率 17500在 200 m/z處，Normalized Collision Energy為 30 eV，Underfill為 0.1%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設(shè)置3次重復(fù)，且所得數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 Mascot2.2和 Proteome Discoverer1.4進行查庫鑒定及定量分析，并采用Excel及SPSS19.0分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟時間的山羊肉pH的變化

宰后山羊肉成熟過程中的肌肉pH變化的大小和速度除了影響肌肉色澤、嫩度和多汁性外[14]，同時也影響了宰后山羊肌糖元的酵解速度和強度。屠宰后，動物體內(nèi)有氧呼吸停止，體內(nèi)肌肉代謝變成糖酵解為主的無氧代謝，所以產(chǎn)生乳酸的速率加快，pH也隨之發(fā)生改變[15]。選取放宰后不同成熟時間下的山羊肉的背部最長肌進行品質(zhì)測定，結(jié)果顯示不同宰后成熟時間下0、12、24和48 h的山羊肉差異顯著（圖1，P＜0.05）。山羊宰后48 h內(nèi)的pH變化呈均勻下降，其成熟過程中的pH在6.5～5.57之間，且仍有下降的趨勢。這說明成熟過程中的山羊肉宰后早期pH較高；隨著成熟時間延長，pH逐漸降低，且差異顯著（P＜0.05）。山羊在宰后0 h的pH較高可能是因山羊成長過程中的運動導(dǎo)致肌肉中的乳酸沉積和神經(jīng)興奮所致[16]。而宰后48 h內(nèi)山羊肉的pH偏低則可能與宰后糖酵解有關(guān)[17]。

圖1 不同宰后成熟時間對羊肉的pH變化Fig.1 Changes of mutton pH at post-mortem in different maturation time

2.2 不同成熟時間的山羊肉質(zhì)構(gòu)特性（TPA）的變化

質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)能夠客觀的反映食物品質(zhì)，與感官性狀間更有不可分割的關(guān)系，比感官評價更加客觀、準(zhǔn)確[18]。宰后成熟過程中山羊肉TPA變化結(jié)果如表1所示，硬度、回復(fù)力、咀嚼性在宰后48 h內(nèi)的成熟過程中變化不明顯（P＞0.05）。宰后成熟12 h期間，內(nèi)聚力顯著下降（P＜0.05），并且在 24～48 h 的成熟階段又顯著上升0.53左右（P＜0.05），與宰后初期（0 h）相似。山羊肉背部最長肌的彈性，隨著宰后時間的延長呈現(xiàn)降低的趨勢，且在宰后0～48 h緩慢下降（P＜0.05），從宰后初期的0.78下降到0.49左右。綜上結(jié)果顯示，在宰后24～48 h，山羊肉的TPA有較明顯的變化，在孫天利[19]對牛肉的研究中，該現(xiàn)象出現(xiàn)在儲存的第4 d，這一現(xiàn)象可能是因為肉類的品種不同。在48 h的成熟過程中，內(nèi)聚性與彈性的變化明顯，可能是與宰后成熟過程中的部分蛋白質(zhì)水解，以及微生物的生長繁殖造成的肉質(zhì)改變[20]。

表1 宰后不同成熟時間山羊肉（TPA）的變化Table 1 Changes of TPA of goat meat at different maturation time after slaughter

2.3 不同成熟時間的山羊肉保水性變化

由圖2可知，蒸煮損失率在山羊死后初期0～12 h緩慢上升到34.9%左右（P＜0.05），但在宰后12 h后，均呈顯著下降趨勢（P＜0.05），且約下降了20%。隨著成熟時間的延長，山羊肉的滴水損失在宰后0～24 h顯著增加（P＜0.05），則在24～48 h的成熟階段無顯著差異，比宰后初期約上升了1倍（圖3）。

圖2 不同成熟時間的羊肉蒸煮損失率變化Fig.2 Variation of cooking loss of mutton with different maturation time

圖3 不同宰后成熟時間對羊肉的滴水流失率變化Fig.3 Changes in drip loss of mutton at different maturation time after slaughter

屠宰后的保水性是指宰后肌肉在外力作用下仍能保持原有的水分與滲透水分的能力[21]，又稱為肉質(zhì)的持水性，能夠決定羊肉口感和肉食品質(zhì)的優(yōu)劣。研究表明，蒸煮損失率和滴水損失率兩個指標(biāo)共同決定了宰后肉質(zhì)的保水性[22]。滴水損失越高說明肉的持水能力越差，對肉品質(zhì)的影響較大。滴水損失升高可能是因為宰后肌原纖維蛋白和細胞膜鏈接在一起的蛋白發(fā)生降解，為肌肉汁液的流失提供了通道[23]。此外，也可能是由于成熟中乳酸的積累，pH下降到與主要蛋白質(zhì)的等電點相時，此時蛋白質(zhì)的正負電荷相互吸引，則肌原纖維之間的間隔減小，對水分的吸引力減小[14]。

2.4 不同成熟時間對山羊肉蛋白質(zhì)溶解度的影響

蛋白的溶解度是反映蛋白降解程度的重要指標(biāo)之一，如表2可知山羊肉肌原纖維蛋白溶解度在宰后 12 h 內(nèi)均顯著下降（P＜0.05），12 h 后逐漸增加，且在48 h 時山羊肉樣的肌原纖維蛋白溶解度顯著小于最初的溶解度（P＜0.05）。說明山羊肉的肌原纖維蛋白在宰后前12 h 無降解或降解程度較小，12 h 之后降解程度增加，肉質(zhì)嫩度增加，所以宰后12 h是肉質(zhì)變化的關(guān)鍵點。山羊肉宰后48 h內(nèi)的肌漿蛋白溶解度逐漸增大（P＜0.05）。結(jié)果說明隨著宰后成熟時間的變化，山羊肉的肌漿蛋白降解程度較大。有研究表明，動物宰后的成熟快慢，能夠通過影響肌肉的收縮、蛋白質(zhì)降解度，進而改變?nèi)馄焚|(zhì)[24]，宰后肉樣的肌漿蛋白溶解度受溫度和pH影響。

表2 宰后不同成熟時間山羊肉蛋白質(zhì)溶解度的變化Table 2 Changes of proteins solubility of goat meat at different maturation time after slaughter

肌漿與肌原蛋白之間存在著聯(lián)系，肌漿鈣離子激活因子中含硫氫基團的半胱氨酸殘基易氧化，導(dǎo)致部分酶活性喪失，減弱肌原纖維蛋白的水解能力[25]。此外，山羊肉成熟過程中，肌原纖維蛋白降解與肉質(zhì)的嫩度、持水性等也存在密切關(guān)系[26]。研究結(jié)果顯示，山羊肉的肌原纖維蛋白溶解度在宰后12 h是一個轉(zhuǎn)折點，導(dǎo)致該結(jié)果原因可能是在僵直期，μ-鈣蛋白酶（μ-calpain）活性較低，抑制肌原纖維蛋白聚合和降解。解僵后，肌漿網(wǎng)中釋放Ca2+活化μ-鈣蛋白酶，進而促進肌原纖維蛋白聚合和降解[27]。也可能是肌原纖維蛋白中的肌動球蛋白被解離成小分子蛋白，通過增強與水分子相互作用，影響肌原纖維蛋白的溶解度[28]。

2.5 不同成熟時間的山羊肉糖原含量變化

宰后成熟過程中山羊肉背部最長肌糖原含量的變化見圖4。從圖4中可以看出，山羊肉在宰后0、12和24 h羊肉的糖原含量顯著下降（P＜0.05），48 h下降趨勢緩慢。這可能由于宰后成熟過多消耗山羊體內(nèi)的糖原，這可能由于成熟過程中的糖酵解作用，用來的維持pH和生理生化等方面的變化。

圖4 不同宰后成熟時間羊肉糖原含量的變化Fig.4 Changes of glycogen in mutton at different maturation time after slaughter

動物品種、肌纖維類型、動物營養(yǎng)狀況和宰前進食情況都影響著糖原的含量[29]，同時糖原作為糖酵解的底物，也受宰后成熟過程的影響。死后的動物肌肉中氧氣供應(yīng)中斷，機體因無法適應(yīng)外界條件而死亡，但此時的肌肉及各種細胞仍然進行著各種生化反應(yīng)，為了保證這些生化反應(yīng)的繼續(xù)進行，糖原提供生化反應(yīng)所需的能量。然而隨著宰后成熟時間的延長，肌肉中的糖原含量經(jīng)過糖酵解途徑后就會變的越來越少。宰后肌肉成熟過程中，細胞以糖酵解的方式供能，糖酵解產(chǎn)生的乳酸和ATP降解產(chǎn)生的無機磷酸，會導(dǎo)致宰后肌肉中的H+積累、pH下降[24]。糖酵解酶主要由糖原磷酸化酶和糖原脫支酶組成[30]，肌肉中H+的含量在一定程度上影響著這兩種酶的活性，進而影響糖原的分解速率。

2.6 宰后不同成熟時間的差異蛋白質(zhì)鑒定

為了展示不同成熟時間蛋白質(zhì)的顯著性差異，將比較組中蛋白質(zhì)以表達差異倍數(shù)（Fold change）和Pvalue（T-test）兩個因素為標(biāo)準(zhǔn)繪制火山圖，其中顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)以藍色標(biāo)注（FC＜0.833且P＜0.05），顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)以紅色標(biāo)注（FC＞1.2且P＜0.05），無差異的蛋白質(zhì)為灰色，如圖5所示。本研究中鑒定到的差異表達蛋白在不同成熟時間段，其表達能力不同。其中在0～12 h組差異表達蛋白總共有13個，上調(diào)表達蛋白有6個，下調(diào)表達蛋白有7個。0與24 h對比，共有26個差異表達蛋白，其中11個蛋白上調(diào)表達，15個蛋白下調(diào)表達。在0與48 h相比較時，有69個差異表達蛋白，其中上調(diào)30個上調(diào)表達，39個蛋白下調(diào)表達。且隨著成熟時間的延長，參與糖酵解與三羧酸循環(huán)的差異蛋白均呈現(xiàn)上調(diào)表達，且表達量增加，這說明參與肌肉向肉轉(zhuǎn)化過程中的蛋白質(zhì)主要參與能量代謝調(diào)節(jié)。在宰后48 h中，檢查出的差異表達蛋白中蛋氨酸-R-亞砜還原酶B2 （MSRB2）下調(diào)表達，該酶能催化蛋白質(zhì)中甲硫氨酸亞砜的可逆氧化，還原為蛋氨酸。作為一種修復(fù)酶，它可以通過形成活性氧清除系統(tǒng)的一部分來保護蛋白質(zhì)免受氧化應(yīng)激，活性氧清除系統(tǒng)在細胞抗氧化防御中很重要[31]。該酶的過量表達可能為受損蛋白提供更多的修復(fù)過程，減輕活性氧(ROS)產(chǎn)生的氧化損傷，進而調(diào)節(jié)山羊肉的氣味[32-33]。在山羊宰后48 h內(nèi)，隨著成熟時間的延長，許多參與調(diào)節(jié)肉品質(zhì)的蛋白質(zhì)活性有顯著變化，且蛋白質(zhì)的表達量也越來越多，這些蛋白質(zhì)分別影響著山羊肉的嫩度、色澤、氣味、口感等肉品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)。也有研究表明，與山羊肉氣味相關(guān)的蛋白質(zhì)主要參與抗氧化活性[34]、半胱氨酸和蛋氨酸代謝[35-36]和活性氧代謝[37]等過程。

圖5 不同宰后成熟時間的蛋白質(zhì)動態(tài)變化Fig.5 Protein dynamics at different postmortem maturation time

3 結(jié)論

山羊在屠宰之后的48 h成熟過程中，其pH在6.5～5.57之間，宰后早期肌肉的pH較高，隨著成熟時間的延長，pH逐漸降低，結(jié)合糖原含量的降低說明了主要參與糖酵解的反應(yīng)完成宰后成熟的排酸過程。結(jié)合彈性，硬度和回復(fù)力等質(zhì)構(gòu)特性的變化，說明宰后成熟對肉品質(zhì)起到嫩度優(yōu)化的作用。滴水流失率下降的趨勢和蒸煮損失率顯著上升兩個指標(biāo)，反映出宰后山羊的保水性逐漸減弱。關(guān)于蛋白質(zhì)溶解性的結(jié)果表明肌漿纖維溶解度顯著升高，肌原纖維溶解度與宰后初期相差較小，說明蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性逐漸減弱。綜上所述，山羊在剛剛屠宰時的肉品質(zhì)并不是最好的狀態(tài)，通過宰后成熟過程，山羊的嫩度、色澤、口感都發(fā)生在變化。成熟后期，抗氧化相關(guān)蛋白（MSRB2）顯著（P＜0.05）下調(diào)表達，進而降低山羊肉的口感。因此，在山羊宰后24～48 h期間是肉質(zhì)嫩化程度較為優(yōu)越的階段，此時對山羊肉進行加工和儲存，有利于保持肉質(zhì)的口感與品質(zhì)。