韋炎冶，姜明國，鄧麗姚，劉 聰，高彩密，夏雨弘，劉洪存，陳林夢，楊立芳,

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院, 廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧530008；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西海洋微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心, 廣西南寧530008）

高脂血癥是現(xiàn)代常見的代謝性紊亂疾病[1]，主要表現(xiàn)為膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量高于正常水平[2-3]。高脂血癥會(huì)加速動(dòng)脈粥樣硬化[4]，造成供血不足、缺氧，肝臟也會(huì)受到損傷，如脂肪肝等[5-6]。高血脂癥與遺傳、飲食以及一些中間原發(fā)疾病等因素具有緊密聯(lián)系[7]，其中飲食因素為大多數(shù)高血脂癥的主要發(fā)病原因[8]。現(xiàn)代降血脂藥物主要為他汀類藥物，其降血脂作用機(jī)制清晰有效，但有一定的副作用，如使患者頭痛、失眠、消化不良等癥狀，部分患者還會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高、肌痛、橫紋肌溶解等反應(yīng)[9-11]。為了克服和減小這些不良反應(yīng)，人們開始從天然藥物、微生物中找尋能夠治療高血脂癥的新型藥物[12-13]。

白耙齒菌（Irpex lacteus），屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），皺孔菌科（Meruliaceae），耙齒菌屬（Irpex）。目前耙齒菌屬有4個(gè)種，包括鮭貝耙齒菌、絨囊耙齒菌、黃耙齒菌以及白耙齒菌，其中白耙齒菌具有較強(qiáng)生物活性[14]。白耙齒菌多糖有抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的作用，以及治療腎小球腎炎的功能[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，白耙齒菌具有抗疲勞、降血糖、提高免疫功能以及治療高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等作用[16-17]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)白耙齒菌次生代謝產(chǎn)物中具有結(jié)構(gòu)新穎、活性良好的新化合物[18-19]。

茶葉屬被子植物門（Angiospermae），雙子葉植物綱（Dicotyledoneae），山茶目（Theales），山茶科（Theaceae），山茶屬（Camellia）植物。茶葉含有許多活性成分，如茶多酚、茶多糖、茶氨酸、咖啡堿等[20]。茶多酚具有抗氧化活性、調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用[21-22]；茶多糖可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，降低餐后血糖[23]；茶氨酸能增強(qiáng)肝臟排毒功能[24-25]；咖啡堿能使中樞神經(jīng)興奮，達(dá)到抗疲勞、提升心臟機(jī)能等作用[26]。如何將具有較好活性的白耙齒菌進(jìn)行馴化，使其能與茶葉共發(fā)酵培養(yǎng)，加工出具有茶和耙齒菌雙重活性功效的新型功能菌茶，既可充分利用兩種物質(zhì)中對(duì)人體健康更有益的次生代謝產(chǎn)物，又可提升茶葉的品質(zhì)和保健、養(yǎng)生功效，對(duì)于傳統(tǒng)茶產(chǎn)品的升級(jí)和拓展具有十分重要的意義。

本試驗(yàn)研究白耙齒菌與茶葉共發(fā)酵培養(yǎng)，并采用高血脂小鼠模型，探索白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C以及 AST、ALT、ALP和抗氧化因子的影響，評(píng)價(jià)白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂癥小鼠肝臟的保護(hù)作用，為食用藥用真菌和茶葉開發(fā)提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí) KM 雄性小鼠 70 只，體重（20±2）g，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（桂） 2014-0002；小鼠基礎(chǔ)飼料 廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；綠茶 廣西橫縣南方茶廠；白耙齒菌 自吉林省長白山采集的樣品中分離得到，并經(jīng)測序鑒定為白耙齒菌；血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽測定試驗(yàn)劑盒 南京建成生物工程研究所；辛伐他?。ㄅ?hào)：170909） 山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司；膽固醇（批號(hào)：C10178156）、豬膽鹽（批號(hào)：C10203440） 上海麥克林生化科技有限公司。

3K15型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) 德國賽默飛公司；Adventurer系列電子天平 美國奧豪斯公司；IKA RVB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA集團(tuán)；BMJ-100型霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHJH-C11068型超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；Olympus CKX41型倒置熒光顯微鏡日本Olympus公司；7100型全自動(dòng)生化試劑儀 日本日立公司；Epoch型全波長酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白耙齒菌發(fā)酵茶水提物的制備 將經(jīng)馴化培養(yǎng)的白耙齒菌菌絲挑至茶葉中，在濕度為80%，溫度為28 ℃的條件下培養(yǎng)，待菌絲在茶葉上長滿后，將菌茶于60 ℃烘干即可得到白耙齒菌發(fā)酵茶（白耙齒菌發(fā)酵茶由本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)家馴化培養(yǎng)而成）。稱取上述白耙齒菌發(fā)酵茶2 g，加入200 mL蒸餾水于100 ℃下提取5 min，過濾得濾液，殘?jiān)偌尤?00 mL蒸餾水100 ℃下提取5 min，過濾得濾液，共提取5次，合并濾液，將濾液濃縮至50 mL，即配成濃度為（含發(fā)酵茶水提物）40 mg/mL的白耙齒菌發(fā)酵茶湯，按照同樣方法配制20、10 mg/mL的白耙齒菌發(fā)酵茶湯以及40 mg/mL的綠茶茶湯。

1.2.2 造模及給藥方法 高血脂小鼠模型建立：雄性KM小鼠70只，體重（20±2）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飼養(yǎng)溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度 60%±5%，光照晝夜各12 h，隨機(jī)分為7組，每組10只，其中一組作為空白組，實(shí)驗(yàn)全程喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，剩余60只小鼠給予高血脂飼料（基礎(chǔ)飼料78.8%、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%豬膽鹽）建模35 d后，禁食不禁水12 h，斷尾尖取血，分離血清，測定各小鼠血脂水平，與空白組血脂水平比較，若P＜0.05或P＜0.01，則造模成功。將60只高血脂癥小鼠按TC水平隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為模型組、綠茶組、辛伐他汀組、白耙齒菌發(fā)酵茶高、中、低劑量組。

給藥方法：白耙齒菌發(fā)酵茶高（400 mg/kg）、中（200 mg/kg）、低劑量（100 mg/kg），辛伐他?。?0 mg/kg），綠茶組（400 mg/kg），上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照10 mL/kg的體積灌胃，即灌胃白耙齒菌發(fā)酵茶高（40 mg/mL）、中（20 mg/mL）、低劑量（10 mg/mL），辛伐他汀（1 mg/mL），綠茶組（40 mg/mL）。每天相同時(shí)間灌胃給藥一次，空白對(duì)照組和模型組灌胃等劑量的蒸餾水，連續(xù)給藥35 d，每周稱一次體重。

1.2.3 指標(biāo)測定 灌胃給藥35 d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不禁水禁食12 h，摘眼球取血后，處死小鼠并進(jìn)行解剖，離心分離血清（3000 r/min，4 ℃），采用酶標(biāo)儀測定血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、ALP水平。剝離肝臟并稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)后，檢測肝臟組織中SOD、MDA、GSH水平。取一部分肝臟組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋[27]并進(jìn)行切片（4 μm）后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，另取一部分肝臟使用 OTC（optimal cutting temperature compound）包埋，冰凍切片，使用油紅O進(jìn)行染色，并于顯微鏡下觀察，各切片選取清晰、典型的視野，觀察肝臟組織病理情況以及肝臟脂肪顆粒情況。肝臟系數(shù)計(jì)算公式為：肝臟系數(shù)=臟器重量/體重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，多組間使用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行比較，兩兩比較使用LSD法，組內(nèi)、組間使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±SD表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠肝臟系數(shù)的影響

在實(shí)驗(yàn)過程中，空白對(duì)照組小鼠毛發(fā)順滑，沒有相互撕咬的現(xiàn)象；模型組小鼠毛發(fā)略微稀疏，精神狀態(tài)略差，不愛走動(dòng)；給藥組以及辛伐他汀組與模型組對(duì)比，小鼠精神狀態(tài)有所改善，且實(shí)驗(yàn)過程中各組無小鼠死亡。白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)小鼠體重的影響見表1，與空白對(duì)照相比，模型組小鼠體重明顯增加，并具有極顯著性差異（P＜0.01），說明建模成功；與模型組相比，辛伐他汀組、綠茶組以及白耙齒菌發(fā)酵茶高、中、低劑量組小鼠體重均無顯著性差異（P＞0.05）；綠茶組與模型組相比，肝重和肝臟系數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。高劑量的白耙齒菌發(fā)酵茶能極顯著降低小鼠肝臟重量（P＜0.01）；辛伐他汀組以及白耙齒菌發(fā)酵茶高、中、低劑量均能極顯著降低小鼠的肝臟系數(shù)（P＜0.01）。綜上，白耙齒菌發(fā)酵茶高、中、低劑量雖然不能降低高血脂小鼠體重，但是能夠極顯著降低高血脂小鼠的肝臟系數(shù)（P＜0.01）。

表1 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠肝臟系數(shù)的影響Table 1 Effects of Irpex lacteus fermented tea on liver coefficient of hyperlipidemia mice

2.2 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠血脂水平的影響

白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠TC、TG、HDLC、LDL-C的影響結(jié)果如圖1所示。與模型組相比，辛伐他汀及白耙齒菌發(fā)酵茶高、中、低劑量均能顯著降低高血脂小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平含量，且具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組相比，綠茶組能夠顯著降低TG、LDL-C 水平（P＜0.05或P＜0.01），但降低程度不及白耙齒菌發(fā)酵茶各劑量組。上述結(jié)果顯示白耙齒菌發(fā)酵茶具有降低高血脂小鼠血脂的作用。

圖1 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠血脂四水平的影響Fig.1 Effects of Irpex lacteus fermented tea on four levels of blood lipid in hyperlipidemic mice

2.3 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠AST、ALT、ALP的影響

如圖2所示，與模型組相比，辛伐他汀組及白耙齒菌發(fā)酵茶高、中、低劑量組均能明顯降低高血脂小鼠血清中AST、ALT、ALP水平，且具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）；綠茶組 AST、ALT、ALP 水平與模型組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，白耙齒菌發(fā)酵茶能降低高血脂小鼠的AST、ALT、ALP水平。

圖2 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠AST、ALT、ALP的影響Fig.2 Effects of Irpex lacteus fermented tea on AST、ALT、ALP in hyperlipidemic mice

2.4 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠SOD、MDA、GSH的影響

白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠SOD、MDA、GSH的影響結(jié)果如圖3～圖4所示，與模型組相比，辛伐他汀組能夠降低高血脂小鼠肝臟組織中MDA水平，升高 SOD、GSH水平，且具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）；綠茶組SOD、MDA、GSH水平與模型組相比均無顯著性差異（P＞0.05），白耙齒菌發(fā)酵茶高、中、低劑量均能明顯降低高血脂小鼠肝臟組織中MDA水平，升高SOD含量；白耙齒菌發(fā)酵茶高劑量可明顯升高GSH含量，且具有顯著性差異（P＜0.05），但中劑量和低劑量與模型組相比無顯著性差異（P＞0.05），表明白耙齒菌發(fā)酵茶具有提高抗氧化酶活性，減少肝臟的脂質(zhì)過氧化，減輕氧自由基對(duì)肝細(xì)胞的損害，從而達(dá)到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。

圖3 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠SOD的影響Fig.3 Effects of Irpex lacteus fermented tea on SOD in hyperlipidemic mice

圖4 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠GSH、MDA的影響Fig.4 Effects of Irpex lacteus fermented tea on GSH、MDA in hyperlipidemic mice

2.5 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠肝組織病理學(xué)觀察

白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果如圖5所示。空白對(duì)照組小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞胞質(zhì)未見溶解和空泡，未見細(xì)胞核萎縮或破裂等現(xiàn)象。模型組小鼠肝組織排列混亂，細(xì)胞間隙含有大量脂肪空泡，邊界模糊，大量細(xì)胞核仁發(fā)生偏移和破裂，胞質(zhì)有溶解現(xiàn)象，含有肝臟脂肪病變。辛伐他汀組小鼠肝臟組織排列較整齊，與模型組相比，邊界較清晰，脂肪空泡量少，細(xì)胞核仁偏移較少，細(xì)胞破裂情況較少。綠茶組小鼠肝臟組織有大量脂肪空泡，大量核仁偏移，核膜出現(xiàn)破裂，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞病變明顯。白耙齒菌發(fā)酵茶高、中、低劑量組小鼠肝臟組織脂肪空泡較模型組明顯減少，核仁偏移明顯改善，邊界較模型組清晰，細(xì)胞核萎縮或破裂等現(xiàn)象明顯減少，表明白耙齒菌發(fā)酵茶具有減輕肝臟病理損傷，保護(hù)肝臟細(xì)胞的作用。

圖5 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠肝組織HE染色圖Fig.5 HE staining of liver tissues of hyperlipidemic mice fed by Irpex lacteus fermented tea

2.6 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠肝組織油紅O染色觀察

白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠肝組織油紅O染色觀察結(jié)果如圖6所示，空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)較好，而模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)大量脂肪滴。與模型組相比，辛伐他汀組小鼠肝組織的脂肪滴較少，細(xì)胞形態(tài)正常；綠茶組小鼠細(xì)胞含有大量脂肪滴，細(xì)胞形態(tài)改變，與模型組相比并無改善作用。白耙齒菌發(fā)酵茶高、中劑量不同程度的減少肝臟組織中的脂肪滴，從而改善肝臟中的脂質(zhì)水平。但白耙齒菌發(fā)酵茶低劑量組減少脂肪滴的作用不明顯。上述結(jié)果表明，高、中劑量白耙齒菌發(fā)酵茶具有改善脂肪肝的功效。

圖6 白耙齒菌發(fā)酵茶對(duì)高血脂小鼠肝組織油紅O染色圖Fig.6 Oil red O staining of liver tissue of hyperlipidemic mice fed by Irpex lacteus fermented tea

3 結(jié)論

本研究將白耙齒菌與茶葉共發(fā)酵培養(yǎng)，制備成了白耙齒菌發(fā)酵茶，并通過高脂飲食誘導(dǎo)小鼠建立高血脂模型，對(duì)白耙齒菌發(fā)酵茶降血脂、保護(hù)肝、改善脂肪肝和抗氧化等進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，白耙齒菌發(fā)酵茶能降低高血脂小鼠血清中TC、TG、LDLC、AST、ALT、ALP水平，升高 HDL-C水平；降低高血脂小鼠肝臟中MDA含量，提高SOD、GSH含量，改善肝組織病理學(xué)情況，減少肝臟脂肪顆粒，表明白耙齒菌茶具有降血脂、保護(hù)肝臟、減輕脂肪肝和抗氧化作用。白耙齒菌與茶葉共發(fā)酵后制成的白耙齒菌發(fā)酵茶，其次生代謝產(chǎn)物比茶葉和白耙齒菌的化學(xué)成分更加豐富，課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了白耙齒菌發(fā)酵茶降血脂、保肝和抗氧化的作用優(yōu)于白耙齒菌和茶葉，但白耙齒菌茶降血脂、保肝和抗氧化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)將有待進(jìn)一步研究。本研究將為功能茶的研究、茶產(chǎn)品的升級(jí)，乃至為改善高血脂癥的藥食同源物的開發(fā)提供新資源和新思路。