賈曉雄，張國斌，夏鶴春(通信作者)

1 天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)外科 (天津 300350)；2 天津市顱腦損傷搶救中心 (天津 300350)；3 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科 (寧夏銀川 750001)；4 寧夏顱腦疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(寧夏銀川 750001)

膠質(zhì)瘤侵襲性生長對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的破壞大多表現(xiàn)為對(duì)白質(zhì)纖維束的侵襲,對(duì)于涉及皮質(zhì)脊髓束的膠質(zhì)瘤，神經(jīng)功能障礙往往是由于運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)束的破壞、推擠或者變形[1-3]。因此，評(píng)估皮質(zhì)脊髓束不同損傷程度能夠?yàn)橹贫ǜ玫纳窠?jīng)治療策略提供有價(jià)值的信息。

彌散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)已經(jīng)被證實(shí)可以區(qū)分纖維束的損傷程度并且用于量化分析皮質(zhì)脊髓束的侵襲程度。有學(xué)者已經(jīng)證實(shí)各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotropy，F(xiàn)A)在靠近腫瘤側(cè)白質(zhì)區(qū)域是降低的，在瘤周區(qū)域，F(xiàn)A較低，證明FA在瘤周區(qū)域受到病變的影響[4-6]。纖維密度指數(shù)(fiber density index，F(xiàn)Di)是用于顯示纖維束上一個(gè)單位體積的纖維束密度，可以提供有效的信息評(píng)估腫瘤的邊界區(qū)域和瘤周區(qū)域白質(zhì)纖維束的分布[7-9]。纖維束示蹤成像(diffusion tensor tractography，DTT)是無創(chuàng)的，通過在纖維束行進(jìn)區(qū)域設(shè)置3D感興趣區(qū)來可視化顯示白質(zhì)纖維束的技術(shù)，可以顯示出特定的纖維傳導(dǎo)束[4]。此外，腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能夠?qū)е缕べ|(zhì)脊髓束的破壞，而破壞的程度可以反映它的生物學(xué)行為[10]。

DTI能夠評(píng)估纖維束的損傷程度，并且被用于患者神經(jīng)功能檢測評(píng)估。然而，就我們所知目前少有報(bào)道將相對(duì)各向異性分?jǐn)?shù)(relative fractional anisotropy，rFA)和相對(duì)纖維密度指數(shù)(relative fiber density index，rFDi)作為DTI量化參數(shù)指標(biāo)應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤影響下的皮質(zhì)脊髓束損傷程度分類中，并且與大鼠膠質(zhì)瘤病理結(jié)果評(píng)估相結(jié)合。

因此，在本研究中，我們建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型并選取瘤周浸潤區(qū)域感興趣區(qū)，測量瘤周區(qū)域和健側(cè)相對(duì)應(yīng)區(qū)域FA和FDi，并計(jì)算rFA和rFDi。此外，大鼠處死后行病理檢測，評(píng)估瘤周區(qū)域腫瘤細(xì)胞浸潤與DTI參數(shù)分析纖維束損傷程度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1大鼠腦膠質(zhì)瘤模型建立

本研究選用C6細(xì)胞系，SD大鼠14只，均為成年雄性，體質(zhì)量約0.25 kg。C6細(xì)胞系用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，后建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，具體操作步驟及方式詳見前期已發(fā)表文章[11-12]。動(dòng)物研究相關(guān)步驟經(jīng)過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審批并同意。

1.2小動(dòng)物磁共振掃描

磁共振掃描時(shí)間點(diǎn)為建模后第10天，掃描結(jié)束后處死大鼠行病理檢查。本研究采用7.0T磁共振掃描儀(Bruker BioSpec 70/30 USR，德國)，成像線圈選擇小動(dòng)物專用線圈，麻醉使用小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)(MATRX VIP3000，美國)實(shí)時(shí)麻醉，監(jiān)護(hù)采用小動(dòng)物監(jiān)護(hù)/門控系統(tǒng)(SAⅡ Model 1030，美國)記錄大鼠呼吸、心電、體溫；麻醉后迅速將大鼠放入磁共振掃描床使用大鼠專用牙桿及呼吸面罩進(jìn)行持續(xù)氣體吸入；掃描過程中監(jiān)測大鼠呼吸、心電、體溫，掃描期間利用循環(huán)加熱墊維持大鼠溫度。

T1掃描采用加權(quán)快速自旋回波(RARE)序列，采集11層大鼠頭顱冠狀位圖像，掃描參數(shù)為，TR=1 500 ms，TE=6.5 ms，F(xiàn)OV=20 mm×20 mm，掃描層厚為0.5 mm，矩陣為256×256，反轉(zhuǎn)角90°；T2掃描采用超級(jí)弛豫增強(qiáng)快速采集(Turbo-RARE)序列，采集11層大鼠頭顱冠狀位圖像，掃描參數(shù)為，TR=2 500 ms，TE=33 ms，F(xiàn)OV=20 mm×20 mm，掃描層厚為0.5 mm，矩陣為256×256，反轉(zhuǎn)角90°；BOLD-fMRI掃描參數(shù)，TR=160 ms，TE=33 ms，F(xiàn)OV=8.0 cm×6.4 cm，矩陣為192×128；DTI-MRI掃描參數(shù)，TR=5 000 ms，TE=27 ms，F(xiàn)OV=4.0 cm×4.0 cm，反轉(zhuǎn)角90°，矩陣為128×128，掃描開始前，通過尾靜脈注射造影劑0.1 mmol/Kg Gd-DTPA(德國)，后用300 μl鹽水沖管；掃描結(jié)束后，原始數(shù)據(jù)傳輸至工作站處理，掃描數(shù)據(jù)通過MATLAB工作站進(jìn)行分析；FA，F(xiàn)Di的測定是通過在瘤周區(qū)域及對(duì)側(cè)相對(duì)應(yīng)區(qū)域選取感興趣區(qū)(region of interest，ROI)來完成；為了增加測量的準(zhǔn)確性，每側(cè)的ROI都選取相應(yīng)區(qū)域內(nèi)不同的5個(gè)點(diǎn)[13-14]，后計(jì)算rFA(相對(duì)FA=患側(cè)瘤周FA/健側(cè)對(duì)稱FA)和rFDi(患側(cè)瘤周FDi/健側(cè)對(duì)稱FDi)。

1.3皮質(zhì)脊髓束損傷分級(jí)

（1）奉新縣可以促進(jìn)生態(tài)環(huán)境保護(hù)與資源開發(fā)利用相結(jié)合，重點(diǎn)發(fā)展山林經(jīng)濟(jì)，大力發(fā)展毛竹、苗木、油茶和獼猴桃四大林業(yè)基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)。通過宣傳、政策支持，調(diào)動(dòng)社會(huì)積極性，吸引社會(huì)資金投入到四大產(chǎn)業(yè)，聯(lián)合建設(shè)生產(chǎn)基地；培養(yǎng)或引進(jìn)農(nóng)業(yè)科技人才和國際化經(jīng)營管理人才，大力推廣種植技術(shù)，拓展市場；統(tǒng)一生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，合理規(guī)避綠色壁壘，創(chuàng)新名牌農(nóng)產(chǎn)品，打造農(nóng)業(yè)一體化示范園。同時(shí)依托現(xiàn)有的農(nóng)產(chǎn)品資源，升級(jí)現(xiàn)有的奉新工業(yè)園區(qū)，引進(jìn)資金，大力發(fā)展輕工業(yè)即農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)，打造特色的奉新毛竹工藝品和獼猴桃深加工產(chǎn)品，利用交通、信息渠道擴(kuò)散到周邊區(qū)域，甚至輻射到周邊省市，推動(dòng)特色品牌產(chǎn)品走出去。

通過選取雙種子點(diǎn)方法來示蹤皮質(zhì)脊髓束，利用BOLD-fMRI顯示大鼠運(yùn)動(dòng)激活區(qū)域作為起始種子點(diǎn)，將大腦腳設(shè)置為示蹤的終點(diǎn)，同時(shí)通過兩個(gè)感興趣的部分纖維束視為皮質(zhì)脊髓束[15]。在本研究中，我們將14只大鼠腦膠質(zhì)瘤模型中皮質(zhì)脊髓束的損傷程度分為兩級(jí)：(1)推擠：纖維束示蹤成像提示受累皮質(zhì)脊髓束位置改變，未見明顯破壞、浸潤，偶有纖維束表現(xiàn)為分散、壓迫；(2)破壞：纖維束示蹤成像表現(xiàn)為受累纖維束的部分?jǐn)嗔选⑵茐?，F(xiàn)A圖上表現(xiàn)為相應(yīng)區(qū)域各項(xiàng)異性明顯下降甚至無法測量出纖維束[10]。

1.4病理檢測

磁共振掃描結(jié)束后，大鼠處死進(jìn)行病理檢查，所有大鼠均行心臟灌注，后快速離斷頸部去處顱骨，取出腦組織；4%多聚甲醛固定24 h，病理切片選取與DTI腫瘤最大層面腦組織做前后連續(xù)切片；每個(gè)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)HE染色及免疫染色Ki67染色[16]，以明確腫瘤細(xì)胞浸潤程度以及腫瘤與白質(zhì)纖維束的位置關(guān)系。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism Version 5.0軟件，對(duì)腫瘤細(xì)胞實(shí)際浸潤程度與rFA，rFDi的相關(guān)性進(jìn)行分析，組間進(jìn)行Student t test檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1瘤周浸潤區(qū)域FA、FDi較健側(cè)對(duì)稱區(qū)域下降

瘤周區(qū)域及健側(cè)相對(duì)應(yīng)區(qū)域感興趣區(qū)FA和FDi用來表示(圖1)。瘤周區(qū)域平均FA(圖1A)是0.6014，對(duì)側(cè)區(qū)域平均FA是0.6964，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；瘤周區(qū)域平均FDi(圖1B)是1.5761，對(duì)側(cè)區(qū)域平均FDi是5.5299，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示，腦膠質(zhì)瘤瘤周區(qū)域的浸潤性生長導(dǎo)致了患側(cè)各向異性分?jǐn)?shù)及纖維束密度下降。

注：圖1A為大鼠腦膠質(zhì)瘤瘤周區(qū)域FA<健側(cè)對(duì)稱區(qū)域，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖1B為大鼠腦膠質(zhì)瘤瘤周區(qū)域FDi<健側(cè)對(duì)稱區(qū)域，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；瘤周區(qū)域(peritumoral areas，PA)，健側(cè)對(duì)稱區(qū)域(contralateral，Con)，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2rFA、rFDi下降與腫瘤細(xì)胞浸潤相關(guān)

為進(jìn)一步驗(yàn)證纖維束損傷是否與惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)瘤周區(qū)域的浸潤有關(guān)，本研究進(jìn)行了rFA和rFDi與瘤周區(qū)域腫瘤細(xì)胞數(shù)、腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)的相關(guān)性分析，結(jié)果表明，瘤周區(qū)域腫瘤細(xì)胞數(shù)與rFA和rFDi負(fù)相關(guān)(r=-0.8581，r=-0.5077)(圖2A)；瘤周區(qū)域惡性腫瘤細(xì)胞增殖數(shù)與rFA和rFDi負(fù)相關(guān)(r=-0.8411，r=-0.5755)(圖2B)。以上結(jié)果提示，腦膠質(zhì)瘤瘤周區(qū)域的惡性腫瘤細(xì)胞浸潤程度可能導(dǎo)致患側(cè)纖維束的破壞。

注：如圖2A為瘤周區(qū)域惡性腫瘤細(xì)胞數(shù)與rFA及rFDi成負(fù)相關(guān)；如圖2B為瘤周區(qū)域惡性腫瘤細(xì)胞數(shù)增殖指數(shù)與rFA及rFDi成負(fù)相關(guān)。腫瘤細(xì)胞比(tumor cells%)=瘤周區(qū)域腫瘤細(xì)胞/瘤周區(qū)域細(xì)胞總數(shù)，增殖指數(shù)(proliferation index%)=瘤周區(qū)域Ki67染色陽性細(xì)胞/瘤周區(qū)域惡性腫瘤細(xì)胞總數(shù)，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3rFA和rFDi評(píng)估纖維束損傷程度

為進(jìn)一步評(píng)估rFA和rFDi對(duì)纖維束損傷程度分級(jí)的意義，研究對(duì)不同受損級(jí)別纖維束損傷程度與rFA和rFDi進(jìn)行了對(duì)比(圖3)，并進(jìn)行了不同纖維束損傷級(jí)別間病理檢測(圖4)。重度纖維束受損組rFA(0.7840)較輕度纖維束受損組rFA(0.9238)明顯下降(圖3A)，而rFDi在重度纖維束受損組(0.2494)較輕度受損組rFDi(0.2891)僅表現(xiàn)為下降趨勢(圖3B)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：圖3A為重度纖維束受損組rFA較輕度纖維束受損組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖3B為重度纖維束受損組rFDi較輕度纖維束受損組降低，表現(xiàn)出降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。皮質(zhì)脊髓束輕度受損(Grade_mild)，皮質(zhì)脊髓束重度受損(Grade_severe)，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖4A、B為惡性腫瘤區(qū)域10倍(A)和40倍(B)HE染色，可見腫瘤細(xì)胞核異形性高，核大且深染，圖4C、D為瘤周區(qū)域10倍(C)和40倍(D)Ki67染色，可見瘤周區(qū)域惡性腫瘤細(xì)胞浸潤性生長。

3 討論

對(duì)于腦膠質(zhì)瘤患者，病變對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的破壞很多時(shí)候表現(xiàn)為對(duì)纖維傳導(dǎo)束的侵襲或者推擠，所以纖維束損傷程度的分級(jí)能夠?yàn)槭中g(shù)切除中有效保護(hù)神經(jīng)功能提供有價(jià)值的信息[10，17]。本研究的目的就是通過量化的rFA和rFDi參數(shù)值來評(píng)估受膠質(zhì)瘤影響的神經(jīng)纖維束損傷程度。

DTI參數(shù)可用于評(píng)估不同級(jí)別膠質(zhì)瘤瘤周水腫程度和惡性腫瘤細(xì)胞浸潤程度[15，18]。本研究結(jié)果顯示，瘤周區(qū)域和對(duì)側(cè)對(duì)稱區(qū)域的FA和FDi不同，表現(xiàn)為瘤周浸潤區(qū)域FA和FDi下降，rFA和rFDi與瘤周區(qū)域腫瘤細(xì)胞和增殖指數(shù)負(fù)相關(guān)；病理染色與DTI參數(shù)結(jié)果顯示，瘤周區(qū)域浸潤的腫瘤細(xì)胞數(shù)目和增殖指數(shù)增加表明白質(zhì)纖維束的損傷程度增加。由此推測，瘤周區(qū)域FA和FDi的下降很可能歸因于腫瘤細(xì)胞的浸潤和增殖。因此，研究結(jié)果證實(shí)腦膠質(zhì)瘤惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤是導(dǎo)致白質(zhì)纖維束損傷的重要原因。

DTI可以顯示顱腦腫瘤患者的纖維束完整性以及受腫瘤影響的纖維束走形[7，19]。本研究證實(shí)瘤周區(qū)域rFA和rFDi在不同纖維束損傷分類中是不同的。在2013年本組的一篇臨床報(bào)道[20]中證實(shí)，受腫瘤影響的白質(zhì)纖維束分類能夠作為判斷腫瘤全切或者部分切除的一個(gè)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤侵襲導(dǎo)致皮質(zhì)脊髓束損傷程度與rFA和rFDi相關(guān)，提示DTI參數(shù)可以描述受腫瘤影響的纖維束不同損傷程度分類。因此，rFA和rFDi可以用來評(píng)估受腫瘤影響的瘤周區(qū)域皮質(zhì)脊髓束的纖維走形，而對(duì)皮質(zhì)脊髓束損傷分類的目的則是為顯示腫瘤與正常腦組織之間的關(guān)系提供有價(jià)值的信息。

本研究中應(yīng)用DTI參數(shù)與病理結(jié)果相結(jié)合來評(píng)估纖維束損傷程度，進(jìn)一步研究擬應(yīng)用其他不同的病理染色方法描述白質(zhì)纖維束，以期更加準(zhǔn)確、直觀的反應(yīng)腫瘤細(xì)胞侵襲對(duì)白質(zhì)纖維束損傷的影響。

綜上所述，在大鼠腦膠質(zhì)瘤模型中，DTI參數(shù)可以量化評(píng)估纖維束損傷程度，并且量化參數(shù)評(píng)估可以為描述惡性腫瘤與受損纖維束之間的關(guān)系提供有價(jià)值的信息。