肖曉 周雅思 彭楚茵 鄧金清 王來友 朱文博

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）23-2827-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.03

摘 要 目的：研究溶瘤病毒M1（簡(jiǎn)稱“M1病毒”）誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞C-33A凋亡的作用及機(jī)制。方法：采用MTT法檢測(cè)不同滴度（0、0.001、0.01、0.1、1、10 PFU/cell）M1病毒處理后C-33A細(xì)胞的存活率;將C-33A細(xì)胞分為對(duì)照組（0 PFU/cell）和M1病毒低、中、高劑量組（0.001、0.01、0.1 PFU/cell），加入相應(yīng)滴度病毒，培養(yǎng)48 h 后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和感染率，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中C/EBP 同源蛋白（CHOP）、胱天蛋白酶12（caspase-12）、caspase-3、活化的caspase-3（cleaved-caspase-3）的表達(dá)水平。結(jié)果：經(jīng)不同滴度M1病毒處理后，C-33A細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.01），且呈劑量依賴趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，M1病毒各劑量組細(xì)胞的凋亡率和感染率以及中、高劑量組細(xì)胞中CHOP、caspase-12、cleaved- caspase-3（中劑量組除外）蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。結(jié)論：M1病毒可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞C-33A的凋亡，其作用機(jī)制可能與激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 溶瘤病毒M1;宮頸癌;C-33A細(xì)胞;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;細(xì)胞凋亡

Effects and Mechanism of Oncolytic Virus M1 Inducing the Apoptosis of Cervical Cancer C-33A Cells

XIAO Xiao1，ZHOU Yasi2，PENG Chuyin1，DENG Jinqing2，WANG Laiyou1，ZHU Wenbo3（1. Dept. of Pharmacy， Guangdong Provincial People’s Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences， Guangzhou 510080， China; 2. School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Dept. of Pharmacology， Zhongshan School of Medicine， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects and mechanism of oncolytic virus M1 （called M1 virus for short） inducing the apoptosis of cervical cancer C-33A cells. METHODS： MTT assay was used to detect survival rate of C-33A cells that were treated with different titers （0， 0.001， 0.01， 0.1， 1， 10 PFU/cell） of M1 virus. C-33A cells were divided into control group （0 PFU/cell）， low-dose， medium-dose and high-dose groups of M1 virus （0.001， 0.01， 0.1 PFU/cell）. After treated with corresponding titers of M1 virus for 48 h， flow cytometry was used to detect the apoptotic rate and infection rate of cells; Western blot was performed to detect the protein expression of C/EBP homologous proteins （CHOP）， caspase-12， caspase-3 and cleaved-caspase-3. RESULTS： After treated with different titers of M1 virus， the survival rate of C-33A cells decreased significantly （P<0.01）， and showed a dose-dependent trend. Compared with control group， the apoptotic rate and infection rate of cells in M1 virus groups as well as the protein expression of CHOP， caspase-12 and cleaved-caspase-3 （except for medium-dose group） in M1 virus medium-dose and high-dose groups were increased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： M1 virus can induce the apoptosis of cervical cancer C-33A cells， and its mechanism may be related to the activation of endoplasmic reticulum stress pathway.

KEYWORDS? ?Oncolytic virus M1; Cervical cancer; C-33A cells; Endoplasmic reticulum stress; Cell apoptosis

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤，也是威脅人類生命安全的主要疾病?！?020年全球癌癥報(bào)告》顯示：宮頸癌發(fā)病率在女性癌癥中排名第2位，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì);2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例超過60萬例，死亡病例超過34萬[1]。目前，早期宮頸癌的治療效果較好，但晚期宮頸癌患者生存質(zhì)量低、病死率居高不下[2-3]。因此，晚期宮頸癌的治療已經(jīng)成為臨床工作的難點(diǎn)和重點(diǎn)，亟須新的安全有效的臨床方案、策略或者藥物來治療。

溶瘤病毒是一類天然的或經(jīng)過基因修飾的病毒，可特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，然后通過直接裂解細(xì)胞或者激活免疫來殺傷腫瘤細(xì)胞，而不損傷正常細(xì)胞[4-5]。近年來溶瘤病毒療法發(fā)展迅速，20余種病毒正在或者已經(jīng)完成臨床研究，且均表現(xiàn)出良好的安全性[4，6];現(xiàn)已被中國(guó)以及多個(gè)歐美國(guó)家批準(zhǔn)上市，主要用于治療鼻咽癌、晚期黑色素瘤[7]。相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)，單純皰疹病毒、新城疫病毒可殺傷宮頸癌細(xì)胞[8-9]。由此可知，溶瘤病毒為抗宮頸癌藥物研發(fā)提供了新的方向。

溶瘤病毒M1（以下簡(jiǎn)稱“M1病毒”）屬于披膜病毒科甲病毒屬蓋塔樣病毒，是研究者于1964年從庫蚊屬蚊蟲中分離得到的病毒[10]。甲病毒作為載體已在病毒性疾病的腫瘤疫苗、核酸疫苗、基因治療等方面得到了大量應(yīng)用[11]，這提示M1病毒有成為新型抗腫瘤藥物的潛力。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊的重要“車間”，當(dāng)細(xì)胞受到過度刺激時(shí)，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;當(dāng)劇烈的、長(zhǎng)時(shí)程的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不能得到緩解時(shí)，就會(huì)引起細(xì)胞凋亡[12]。M1病毒是否可通過作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)凋亡，尚不明確。基于此，本研究擬基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，研究M1病毒對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及機(jī)制，以期為治療晚期宮頸癌的新型藥物開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：CytoFLEX型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司），Synergy H1型多功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek公司），MicroCL 21型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、Forma 310 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），TE-2000型倒置相差熒光顯微鏡（日本Nikon公司），ChemiDoc XRS+ System型凝膠成像儀、Mini-PROTEAN Tetra型電泳轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

MTT試劑（批號(hào)T100896）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)FXP023-050）購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司;ECL發(fā)光液（批號(hào)WBKLS0100）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;胎牛血清（批號(hào)B21001）購(gòu)自中山康天晟合生物技術(shù)有限公司;胰酶、青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、VP-SFM培養(yǎng)基（批號(hào)分別為25300062、15070063、11965118、11681020）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)021998625）購(gòu)自廣州威佳科技有限公司;鼠源C/EBP 同源蛋白（CHOP）單克隆抗體（批號(hào)2895S）、兔源胱天蛋白酶12（caspase-12）多克隆抗體（批號(hào)35965）、兔源β-微管蛋白（β-tubulin）單克隆抗體（批號(hào)2128S）、兔源caspase-3多克隆抗體（批號(hào)9662）、兔源活化的caspase-3（cleaved-caspase-3）單克隆抗體（批號(hào)9664）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的馬抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)7076S）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)7074S）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用人宮頸癌細(xì)胞C-33A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，非洲綠猴腎細(xì)胞Vero、倉鼠腎成纖維細(xì)胞BHK-21購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫。

1.4 病毒

本研究所用M1病毒來源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代

將細(xì)胞凍存管從液氮罐中移出，置于37 ℃水浴條件下快速融化，移出凍存液于離心管中;加入DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素），以1 200 r/min離心5 min，棄上清液;以DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再移入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同）。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，以胰酶消化傳代，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 M1病毒的擴(kuò)增培養(yǎng)

采用非洲綠猴腎細(xì)胞Vero來擴(kuò)增M1病毒。將Vero細(xì)胞接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合度達(dá)90%;然后將培養(yǎng)基更換為VP-SFM培養(yǎng)基，加入M1病毒母液（1×107 PFU/mL）20 μL，待80%Vero細(xì)胞裂解后（培養(yǎng)48～60 h后），以? ?1 200 r/min離心5 min，取上清液混勻分裝后，于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 C-33A細(xì)胞存活率的檢測(cè)

采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C-33A細(xì)胞適量，經(jīng)胰酶消化后，將密度調(diào)整為3×104 mL-1，按100 μL/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜;然后加入不同滴度[0（作為對(duì)照組）、0.001、0.01、0.1、1、10 PFU/cell，滴度參考文獻(xiàn)[13]設(shè)置]的M1病毒進(jìn)行干預(yù)，另設(shè)不加細(xì)胞、不加病毒的空白組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入MTT試劑（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h;棄去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，然后采用多功能微孔板檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（OD），并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（OD給藥組-OD空白組）/ OD對(duì)照組×100%]。以GraphPad Prism 8軟件計(jì)算M1病毒的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 C-33A細(xì)胞凋亡率以及病毒感染率的檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C-33A細(xì)胞適量，經(jīng)胰酶消化后，將密度調(diào)整為5×104 mL-1，按2 mL/孔接種于12孔板;培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（0 PFU/cell）和M1病毒低、中、高劑量組（0.001、0.01、0.1 PFU/cell，滴度根據(jù)“2.3”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入VP-SFM培養(yǎng)基，M1病毒各劑量組加入相應(yīng)滴度病毒。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書方法操作，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;同時(shí)通過M1病毒自帶的GFP標(biāo)簽，檢測(cè)其對(duì)C-33A細(xì)胞的感染率。

2.5 C-33A細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C-33A細(xì)胞適量，經(jīng)胰酶消化后，將密度調(diào)整為3×105 mL-1，按3 mL/孔接種于6孔板;培養(yǎng)24 h后，按“2.4”項(xiàng)下方法分組與給藥，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，以獲取蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，煮沸5 min使其變性;取變性后蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%的BSA封閉;加入CHOP、caspase-12、cleaved- caspase-3、caspase-3、β-tubulin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜3次、每次5 min，然后加入相應(yīng)二抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于室溫孵育1 h;經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，置于凝膠成像儀上成像。采用Image Lab 4.0軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-tubulin蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 M1病毒對(duì)C-33A細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較，M1病毒處理組細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.01），且呈劑量依賴趨勢(shì);M1病毒對(duì)C-33A細(xì)胞的IC50為（0.015 6±0.002 4） PFU/cell。結(jié)果見表1。另外，當(dāng)M1病毒滴度大于1 PFU/cell時(shí)，其對(duì)細(xì)胞存活率的影響趨于穩(wěn)定，故選擇0.001、0.01、0.1 PFU/cell的滴度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 M1病毒對(duì)C-33A細(xì)胞凋亡率及病毒感染率的影響

與對(duì)照組比較，M1病毒低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率及感染率均顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表2、圖1、圖2。

3.3 M1病毒對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，M1病毒中、高劑量組細(xì)胞中CHOP、caspase-12、cleaved-caspase-3（中劑量組除外）蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表3、圖3。

4 討論

目前宮頸癌的治療方法主要包括放療、化療、靶向治療、生物治療等。其中，放化療是治療晚期宮頸癌的重要方式，但毒副作用大;靶向治療是藥物進(jìn)入體內(nèi)后與特定的致癌位點(diǎn)相結(jié)合后發(fā)揮抗腫瘤作用;生物治療是通過機(jī)體的防御機(jī)制，應(yīng)用生物大分子或小分子化合物調(diào)節(jié)機(jī)體生物反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。其中，靶向治療和生物治療的安全性高，目前已成為治療腫瘤的有效手段。

本課題組前期研究證實(shí)，M1病毒可殺傷膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞[13，15]。將M1病毒注射在大鼠、小鼠、石蟹猴等多種模型動(dòng)物體內(nèi)后，該病毒可在正常組織中迅速消退，而在腫瘤組織中富集擴(kuò)增;且受試動(dòng)物精神狀態(tài)良好，無明顯的體質(zhì)量減輕或者食欲減退的現(xiàn)象[10，13，16]。此外，本課題組也開發(fā)了M1病毒的脂質(zhì)體制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該制劑可減少中和抗體的生成，從而發(fā)揮更好的治療效果[17]。由此可知，M1病毒具備良好的臨床應(yīng)用潛力?；诖?，本研究擬進(jìn)一步探討M1病毒誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。

本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M1病毒可顯著降低C-33A細(xì)胞的存活率且呈劑量依賴趨勢(shì);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)M1病毒作用后，細(xì)胞凋亡率及感染率均顯著升高。這提示M1病毒感染可能具有促宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用。

大量外源性病毒累積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步激活下游的凋亡通路[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑主要有3條：第一條是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子CHOP介導(dǎo)的;第二條是通過c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路介導(dǎo)的;第三條是通過凋亡相關(guān)的關(guān)鍵分子caspase-12介導(dǎo)的[18]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)M1病毒作用后，C-33A細(xì)胞中CHOP、caspase-12、cleaved- caspase-3（中劑量組除外）蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。這提示M1病毒可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，促進(jìn)C-33A細(xì)胞凋亡。

綜上所述，M1病毒可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞C-33A凋亡，其作用機(jī)制可能與激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路有關(guān)。本課題組將進(jìn)一步在體內(nèi)模型上驗(yàn)證上述結(jié)論，以期為臨床應(yīng)用M1病毒治療晚期宮頸癌提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-06-24 修回日期：2021-10-02）

（編輯：唐曉蓮）