郭艷春 張力嵐 陳思遠(yuǎn) 祁建民 方平平 陶愛(ài)芬張列梅 張立武,*

1 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002; 2 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東南黃紅麻實(shí)驗(yàn)觀測(cè)站 / 福建省麻類種質(zhì)資源共享平臺(tái) / 福建省南方經(jīng)濟(jì)作物遺傳育種與多用途開發(fā)國(guó)際科技合作基地, 福建福州 350002; 3 福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心, 福建福州 350002

黃麻是一年生草本植物, 世界上最重要的韌皮部纖維作物。黃麻屬(Corchorus)有100 多個(gè)種, 在生產(chǎn)上有栽培價(jià)值的有圓果種黃麻(C. capsularisL.)和長(zhǎng)果種黃麻(C. olitoriusL.), 兩者皆為二倍體(2n=14)。其纖維具有產(chǎn)量高、纖維質(zhì)地柔軟的特點(diǎn)[1]。我國(guó)是世界上最古老的黃麻原產(chǎn)地之一, 種植黃麻已有近千年的歷史, 古時(shí)黃麻又稱“綠麻”、“絡(luò)麻”, 早在北宋年間就已有黃麻形態(tài)特征的記載[2]。農(nóng)作物種質(zhì)資源是人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展不可替代的財(cái)富, 20 世紀(jì)40—60 年代, 我國(guó)就開始了黃麻種質(zhì)資源的考察與搜集, 經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的艱苦努力, 我國(guó)黃麻種質(zhì)資源已建立起完整的研究體系[3]。隨著黃麻種質(zhì)資源研究的深入, 發(fā)掘一批具有應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)異種質(zhì)資源可為黃麻遺傳育種和生產(chǎn)利用提供必要的種質(zhì)基礎(chǔ)。

核心種質(zhì)(core germplasm)有利于提高種質(zhì)資源的利用效率。不同研究者構(gòu)建了多種作物的核心種質(zhì), 如水稻[4]、小麥[5]、黃麻[6]、芝麻[7]等。隨著核心種質(zhì)的深入研究, 針對(duì)優(yōu)異的育種目標(biāo)性狀, 以核心種質(zhì)為基礎(chǔ), 構(gòu)建具有代表性的應(yīng)用核心種質(zhì)(applied core germplasm)[8]在作物育種進(jìn)程中具有重要意義。黃麻核心種質(zhì)研究雖已有報(bào)道[6], 但黃麻應(yīng)用核心種質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。

在眾多的分子標(biāo)記技術(shù)中, 簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR(simple sequence repeat)具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、重復(fù)性好等特點(diǎn), 是一種比較理想的遺傳標(biāo)記[9-10]。張立武等[11]在黃麻EST 序列的基礎(chǔ)上, 開發(fā)了66對(duì)SSR 引物; 陶愛(ài)芬等[12]利用黃麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)并驗(yàn)證了29 對(duì)SSR 引物, 這些SSR 為黃麻種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的挖掘等提供了有利工具。

為鑒別核心種質(zhì)或應(yīng)用核心種質(zhì)之間的差異,越來(lái)越多的研究者利用分子標(biāo)記來(lái)構(gòu)建DNA 指紋圖譜。目前指紋圖譜的構(gòu)建方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳法[13]、熒光毛細(xì)管電泳法[14]等。隨著SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)DNA 指紋圖譜的快速發(fā)展, 在指紋圖譜的基礎(chǔ)上, 可將結(jié)果轉(zhuǎn)化為字符串、條形碼及二維碼等, 稱為DNA 分子身份證[15-17]。它可以不受環(huán)境因素的影響, 能精確、簡(jiǎn)潔地鑒定不同種質(zhì)資源。目前, 黃麻種質(zhì)資源指紋圖譜的分子身份證構(gòu)建工作研究較少。

本研究從不同來(lái)源的黃麻種質(zhì)資源遴選出應(yīng)用核心種質(zhì), 并通過(guò)SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)構(gòu)建黃麻應(yīng)用核心種質(zhì)的DNA 分子身份證, 以促進(jìn)黃麻種質(zhì)資源的高效利用及快速分子鑒定, 并為黃麻優(yōu)異基因的挖掘奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從300 份黃麻種質(zhì)資源[18]中鑒定評(píng)價(jià)出61 份品種(系), 均由福建農(nóng)林大學(xué)麻類作物遺傳育種與綜合利用實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與應(yīng)用核心種質(zhì)的構(gòu)建

依據(jù)《黃麻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[19],對(duì)種質(zhì)資源的株高、莖粗、鮮皮厚、單株鮮皮重、出苗期、開花期、結(jié)果期、工藝成熟期、種子成熟期、生育日數(shù)、生育類型、葉形、果形、抗病性、耐旱性、耐鹽性、抗倒伏性、種子發(fā)芽率進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià), 收獲后測(cè)定纖維素含量、木質(zhì)素含量、纖維強(qiáng)度、纖維支數(shù)等構(gòu)建出具有優(yōu)異性狀的包含61 份品種(系)的應(yīng)用核心種質(zhì)。

該應(yīng)用核心種質(zhì)分別于2018 年5 月1 日和2019年5 月8 日在福建省三明市尤溪縣福建農(nóng)林大學(xué)洋中科教基地農(nóng)場(chǎng)(東經(jīng)118°28′44′′, 北緯26°17′22′′, 海拔174 m), 按2 行區(qū)種植, 行長(zhǎng)3.5 m, 行株距1.20 m × 0.10 m, 采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 邊行種植2行保護(hù)行, 田間管理同大田。

1.3 DNA 提取

采用改良的CTAB 法提取黃麻基因組DNA[20]。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性, 采用紫外分光核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA 質(zhì)量和濃度, 并將樣品DNA 稀釋至50 ng μL-1, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR 引物

46 對(duì)預(yù)選引物序列信息見附表1, 所用的SSR引物包括編號(hào)CcID[18]、CoSSR[11]和CoEMS[20], 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。毛細(xì)管電泳熒光引物為單色熒光, 上游5′端加FAM (blue)或HEX (green)熒光基團(tuán)標(biāo)記, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

參照徐益等[6]PCR 體系、PCR 擴(kuò)增的方法, 用熒光毛細(xì)管電泳分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。熒光毛細(xì)管電泳采取一重單色毛細(xì)管電泳, 儀器為3730XL 測(cè)序分析儀。

1.5 熒光核心引物篩選及數(shù)據(jù)處理

從供試材料中隨機(jī)選12 份材料, 通過(guò)PAGE 銀染法對(duì)備選的46 對(duì)SSR 核心引物進(jìn)行初篩, 每個(gè)引物進(jìn)行3 次重復(fù), 選取多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物合成熒光引物。用PIC_Calc 0.6 軟件計(jì)算多態(tài)性信息量(PIC)。

1.6 DNA 分子身份證構(gòu)建方法

采用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù), 用獲得的核心引物分析該應(yīng)用核心種質(zhì), 用3730XL 測(cè)序列分析儀讀取數(shù)據(jù), 獲得SSR 擴(kuò)增片段的精確分子量,并進(jìn)行數(shù)字+英文字母編碼。將每對(duì)引物擴(kuò)增所有樣品的不同帶型, 按分子量從大到小用數(shù)字1～9 依次表示, 超出9 的用英文字母A～Z 依次表示, 構(gòu)建字符串形式的DNA 分子身份證。將對(duì)應(yīng)字符串導(dǎo)入在線條碼生成器(http://barcode.cnaidc.com/html/BCG code128b.php), 生成可供掃描的條形碼DNA 分子身份證; 將應(yīng)用核心種質(zhì)的基本信息、形態(tài)特征特性、品質(zhì)數(shù)據(jù)、DNA 分子身份證代碼等文本信息輸入在線二維碼生成器(https://cli.im/), 生成可掃描的二維碼DNA 分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)用核心種質(zhì)的構(gòu)建

通過(guò)包含61 份品種(系)的應(yīng)用核心種質(zhì)農(nóng)藝性狀精準(zhǔn)鑒定, 篩選出纖維產(chǎn)量高(包括高稈、莖粗、鮮皮厚、單株鮮皮重)、纖維品質(zhì)好(包括高纖維素含量、低木質(zhì)素含量、高纖維強(qiáng)度、高纖維支數(shù))、抗逆(包括抗炭疽病、抗鹽、抗旱、高發(fā)芽率、抗種子老化)、生育期適宜、適宜機(jī)械化(抗倒伏)等應(yīng)用核心種質(zhì), 加上6 份骨干親本, 按特性可分為16 個(gè)應(yīng)用型, 即16 組(表1)。剔除不同組內(nèi)同一種質(zhì), 共61份品種(系)。

表1 黃麻應(yīng)用核心種質(zhì)Table 1 Applied core collection of jute

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

2.2 應(yīng)用核心種質(zhì)SSR 核心引物的確定

從該應(yīng)用核心種質(zhì)的61 份品種(系)中隨機(jī)挑選12 份作為模板, 采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。針對(duì)備選的46 對(duì)SSR 核心引物進(jìn)行初篩, 得到12 對(duì)多態(tài)性高且條帶清晰的引物, 如表2 所示。利用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)及這12 對(duì)核心引物擴(kuò)增61 份應(yīng)用核心種質(zhì)。共檢測(cè)到140 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn), 等位位點(diǎn)多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.8223～0.9499。

2.3 應(yīng)用核心種質(zhì)DNA 分子身份證編碼及構(gòu)建

12 對(duì)核心引物對(duì)該應(yīng)用核心種質(zhì)進(jìn)行SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳, 3730XL 測(cè)序列分析儀讀取分子量數(shù)據(jù)。圖1 為引物CcID071(FAM)熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)到的 19 種特征帶型, 對(duì)應(yīng)的片段大小分別為104/113、108/129、112/128、113、113/117、113/125、113/126、113/128、113/129、114、114/126、114/129、116/125、117、119/126、122、125、126、129 bp。圖2 為引物CcSSR024(HEX)熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)到的4 種特征帶型, 對(duì)應(yīng)的片段大小分別為196、197、199、200 bp。表3 為各核心引物5′端標(biāo)記的熒光基團(tuán)、擴(kuò)增得到的多態(tài)性條帶總數(shù)、多態(tài)性片段大小及編碼匯總。

利用毛細(xì)管電泳多態(tài)性片段及編碼信息構(gòu)建DNA 分子身份證。對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果按表3 進(jìn)行數(shù)字+英文字母編碼, 將 CcID071、CoSSR083、CoSSR146、CoSSR179、CoSSR049、CcSSR001、CoSSR119、CoSSR133、CoSSR136、CcSSR024、CcSSR015、CoEMS333 這12 對(duì)引物的排列組合用于DNA 分子身份證的構(gòu)建。按上述順序?qū)⒃?2 對(duì)引物對(duì)應(yīng)的編碼組合, 構(gòu)成應(yīng)用核心種質(zhì)DNA 分子身份證, 即字符串DNA 分子身份證。如巴長(zhǎng)4 號(hào)(種質(zhì)編號(hào): 16)的DNA 分子身份證編碼為I2457612J227,對(duì)照表3, 第1 個(gè)字母I 表示引物CcID071 在種質(zhì)16 中的擴(kuò)增片段, 在其多態(tài)性片段梯度中排第18 位,第2 個(gè)數(shù)字2 表示引物CoSSR083 在種質(zhì)16 中擴(kuò)增的片段, 在其多態(tài)性片段梯度中排第2 位, 其余代碼依次類推。將DNA 分子身份證編碼導(dǎo)入在線條碼生成器, 生成條形碼DNA 分子身份證。將應(yīng)用核心種質(zhì)的主要描述符和DNA 分子身份證編碼導(dǎo)入二維碼生成軟件, 生成二維碼DNA 分子身份證?；谧址l形碼、二維碼3 種形式, 成功構(gòu)建出61份應(yīng)用核心種質(zhì)的DNA 分子身份證, 圖3 為構(gòu)建的應(yīng)用核心種質(zhì)條形碼 DNA 分子身份證和二維碼DNA 分子身份證示例。

3 討論

3.1 黃麻應(yīng)用核心種質(zhì)的利用價(jià)值

?

表3 12 對(duì)核心引物毛細(xì)管電泳結(jié)果及帶型編碼Table 3 Amplification results and code typing of 12 pairs of core primers detected with capillary electrophoresis

黃麻是我國(guó)重要的纖維作物, 構(gòu)建應(yīng)用核心種質(zhì)是促進(jìn)優(yōu)異基因的深入發(fā)掘和提高育種利用效率的有效途徑。本研究構(gòu)建了包括16 種優(yōu)異應(yīng)用型在內(nèi)的黃麻應(yīng)用核心種質(zhì), 可以精準(zhǔn)地為黃麻多元化及專用化育種提供研究材料。例如, 高產(chǎn)、高發(fā)芽率、高纖維素含量、低木質(zhì)素含量、高纖維強(qiáng)度、高纖維支數(shù)應(yīng)用核心種質(zhì)可用于黃麻的品種改良,抗倒伏應(yīng)用核心種質(zhì)將為選育理想株型及適宜機(jī)械化的黃麻品種提供關(guān)鍵親本, 抗炭疽病、抗鹽、抗旱應(yīng)用核心種質(zhì)在多抗黃麻品種的選育方面具有重要利用價(jià)值。同時(shí), 這批應(yīng)用核心種質(zhì)的構(gòu)建也將為黃麻高產(chǎn)、纖維優(yōu)質(zhì)、抗逆等優(yōu)異基因的發(fā)掘及功能標(biāo)記開發(fā)等基礎(chǔ)研究提供核心材料, 如盧瑞克等[21]在研究鹽脅迫下的生理響應(yīng)時(shí)需選擇強(qiáng)耐鹽材料和鹽敏感型材料, 徐益等[22]在鑒定與萌發(fā)速率相關(guān)的SSR 標(biāo)記時(shí)需選擇高發(fā)芽率的材料, 陶愛(ài)芬等[23]在篩選與黃麻炭疽病抗性相關(guān)的新型分子標(biāo)記研究中需要高抗炭疽病材料和高感炭疽病材料。

3.2 熒光核心引物的篩選

篩選一批多態(tài)性高、重復(fù)性好、具有代表性的標(biāo)記在DNA 分子身份證構(gòu)建中至關(guān)重要。SSR 分子標(biāo)記已成為一種最廣泛應(yīng)用的具有高穩(wěn)定性的分子標(biāo)記, 目前SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法主要有聚丙烯酰胺凝膠銀染法和熒光毛細(xì)管電泳法2 種。郝晨陽(yáng)等[24]對(duì)2 種方法比較分析認(rèn)為, 熒光標(biāo)記技術(shù)的檢測(cè)效率顯著高于銀染法, 且PAGE 法存在讀帶不準(zhǔn)確、對(duì)人體有害等缺點(diǎn), 而SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法可以得到目標(biāo)DNA 片段的準(zhǔn)確大小, 檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確、高效。本研究確定的12 對(duì)熒光核心引物多態(tài)性較高, 穩(wěn)定性較好, 均勻分布于7 條染色體上, 且能達(dá)到最少標(biāo)記區(qū)分最多品種的目的。

3.3 DNA 分子身份證的優(yōu)越性

DNA 分子身份證是證實(shí)和區(qū)分不同材料的有效證明, 具有唯一性、可鑒別性等特點(diǎn)。本研究構(gòu)建的包含61 份品種(系)的應(yīng)用核心種質(zhì)的字符串、條形碼和二維碼DNA 分子身份證, 為每份品種(系)獨(dú)有的分子身份證, 其號(hào)碼是唯一的?；谧址?本研究構(gòu)建了能夠迅速被電子系設(shè)備識(shí)別的條形碼DNA 分子身份證, 但是其無(wú)法儲(chǔ)存大量文字等有效信息。而如今二維碼技術(shù)的運(yùn)用有效地容納了數(shù)字、文字、字母、圖片等信息, 且能夠迅速被電腦、手機(jī)等電子設(shè)備全方位識(shí)別, 大大增加了其使用范圍。這些技術(shù)的運(yùn)用使我們構(gòu)建的黃麻應(yīng)用核心種質(zhì)DNA 分子身份證可以在種質(zhì)鑒定和保護(hù)上發(fā)揮重要作用; 也可以用于黃麻種質(zhì)資源庫(kù)的完善與智能化管理, 為構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的黃麻種質(zhì)DNA 分子身份證庫(kù)奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。目前, 陸徐忠等[16]構(gòu)建了水稻品種分子身份證, 高源等[17]構(gòu)建了蘋果部分種質(zhì)資源分子身份證, 楊文娟等[7]構(gòu)建了芝麻應(yīng)用核心種質(zhì)的DNA 分子身份證, 他們都采用了條形碼或二維碼的方式, 來(lái)增加分子身份證的實(shí)用性。本研究對(duì)于黃麻應(yīng)用種質(zhì)的DNA 分子身份證構(gòu)建在國(guó)內(nèi)外尚屬首例, 這將在中國(guó)黃麻種質(zhì)資源保存和利用研究中有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

構(gòu)建了黃麻應(yīng)用核心種質(zhì), 并利用12 對(duì)SSR 熒光核心引物, 通過(guò)毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合數(shù)字化處理的方法, 構(gòu)建了該應(yīng)用核心種質(zhì)中61 份品種(系)的字符串、條形碼、二維碼DNA 分子身份證, 為構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的黃麻DNA 分子身份證庫(kù)奠定了基礎(chǔ)。

附表1 本研究使用46 對(duì)引物序列信息Table S1 Information of 46 pairs of primer used in this study

(續(xù)附表1)