孫雅妮，陳詩，唐寒，葛月賓

(中南民族大學 藥學院， 武漢 430074)

支氣管哮喘是由肥大細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞和結(jié)構(gòu)細胞(氣道上皮細胞、平滑肌細胞)等多種細胞共同介導的一種在臨床上常見的氣道慢性炎癥性異質(zhì)性呼吸道疾病[1]，其病理基礎(chǔ)是機體免疫功能的紊亂，導致出現(xiàn)氣道炎癥、IgE分泌增加、肺部損傷等現(xiàn)象[2]. 支氣管慢性氣道炎癥遷延日久，肺氣漸虛，肺氣虛可致中州脾土虛弱，則脾失健運，氣血生化乏源，故日久可致脾肺俱虛[3].臨床中醫(yī)將哮喘緩解期歸屬為肺氣虛型、脾氣虛型、肺脾氣虛型等幾種類型. 本研究基于中醫(yī)辨證理論，結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)，通過建立三種證型結(jié)合卵蛋白致敏小鼠支氣管哮喘模型，探討分析三種不同中醫(yī)證型對哮喘小鼠免疫功能、氣道炎癥、氣道高反應性的影響，是否存在一定的關(guān)聯(lián)性.

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠(雌性，6～8周)購自華中農(nóng)業(yè)大學實驗中心，實驗動物許可證號[SCXK(鄂)2015-0019]. 每5只小鼠一個實驗籠，在標準動物實驗中心室飼養(yǎng)[12 h光照/黑暗周期，(23±1) ℃，相對濕度(50±5)%]，可自由獲取食物和水，實驗結(jié)束前12 h禁食僅可飲用水. 所有實驗均嚴格按《實驗動物的護理和使用指南》進行[4].

1.2 試劑及實驗材料

雞卵白蛋白(OVA)、脂多糖(LPS)、半刀豆球蛋白A(Con A)、乙酰膽堿(Ach)(美國Sigma)；瑞氏-吉姆薩溶液、AntiCD3+、AntiCD4+、AntiCD8+ (Biosharp)；胎牛血清(浙江天杭)；液態(tài)鋁佐劑(哈藥集團)；小鼠ELISA 試劑盒OVA-IgE、IgE、IL-4、IL-5、IL-13、IgA、IgG、IgM(達科為).

1.3 主要儀器

FACSCalibur流式細胞儀(美國BD)；FlexiVent小鼠肺功能儀(上海賽?？?；多功能酶標儀(美國Thermo Scientific)；BPN-150CW-CO2細胞培養(yǎng)箱(上海一恒).

2 實驗方法

2.1 動物造模

BALB/c小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后 , 將50只小鼠隨機分為5組:對照組、哮喘組、脾氣虛哮喘組、肺氣虛哮喘組、肺脾氣虛哮喘組，每組10只. (1) 哮喘組模型建立:在實驗第1、3、5天以3 mg/mL OVA+ 5% Al(OH)3等體積的液態(tài)鋁溶液腹腔注射致敏，200 μL/只，在第6天以 6 mg/mL OVA+5% Al(OH)3液態(tài)鋁溶液滴鼻激發(fā)引喘，按25 μL/10g計算，1次/d ，共 7 d，以激發(fā)時出現(xiàn)呼吸急促、腹肌抽動及肢體呈團等癥狀為哮喘模型成功.(2)脾氣虛哮喘模型建立：按照《中醫(yī)實驗動物學》方法先復制“脾氣虛證動物模型”[5]，采用“飲食不節(jié)+疲勞過度+苦寒瀉下”三種綜合因素構(gòu)建脾虛證模型，持續(xù)14 d，與對照組相比，以出現(xiàn)體重下降、飲食減少、便軟或溏、游泳耐力下降表明脾氣虛證模型復制成功，在造模第15天結(jié)合OVA抗原致敏激發(fā)，以達到出現(xiàn)哮喘等癥狀. (3)肺氣虛哮喘模型建立：按照《中醫(yī)實驗動物學》復制“肺氣虛證動物模型”[5]，小鼠放置于自制的體積為400 mm×400 mm×800 mm煙薰箱中，每天以5支紅金龍香煙煙熏30 min(焦油量為11 mg/支)，上下午各一次/d，持續(xù)30 d，每天自由飲食喝水，每隔5 d觀察記錄體征變化，與對照組相比，表現(xiàn)出呼吸急促，咳嗽，精神疲勞，反應遲緩，鼻腔分泌物增多，毛發(fā)枯黃，沒有光澤，體重下降，表明肺氣虛證模型復制成功[5]，在造模第12天結(jié)合OVA抗原致敏激發(fā)，以達到出現(xiàn)哮喘等癥狀.(4) 肺脾氣虛哮喘建立：結(jié)合肺氣虛證和脾氣虛證模型，煙熏持續(xù)30 d，在造模第7天采用“飲食不節(jié)+疲勞過度+苦寒瀉下”的方法造成脾虛證，持續(xù)14 d，在造模第10天結(jié)合OVA抗原致敏激發(fā)，至引喘成功.

造模期間，每周定時稱量小鼠體重，最后一次OVA抗原致敏激發(fā)后，取肺組織并稱重，計算其所占每只小鼠體重比值.

2.2 免疫器官指數(shù)

眼球取血后，無菌取脾和胸腺稱重，脾臟和胸腺指數(shù)分別用組織重量(mg)/體重(g)的比值表示.

2.3 脾淋巴細胞增殖功能測定

MTT法測定脾細胞增殖[6],取脾臟置于冷磷酸鹽緩沖液(PBS)中，研磨過40 μm細胞網(wǎng)篩，得到均勻的細胞懸液，210 r/min離心5min ,棄上清，加入紅細胞裂解液，裂解5 min, PBS洗滌，懸浮于培養(yǎng)基中(RPMI1640加入0.05 mM 巰基乙醇，100 UI/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和10%FCS),調(diào)整細胞濃度至5.0×106cell/mL ,臺盼藍染色計數(shù)，顯示細胞活力超過95%. 將細胞懸液以100 μL/孔接種到96孔板中，加入5 μg/mL Con A、4 μg/mL LPS于培養(yǎng)基. 置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入50 μL MTT, 孵育4 h，1000～1400 r/min離心5 min, 棄未結(jié)合的MTT上清液，最后每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),15 min后使用酶標儀570 nm下進行讀數(shù).

2.4 脾臟T淋巴細胞亞群測定

根據(jù)上述方法制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×106cell/mL，同時加入1 μL APC-CD3熒光抗體、1 μL FITC-CD4熒光抗體、1 μL PE-CD8熒光抗體，混勻，冰下黑暗孵育20 min，用冷PBS洗滌3次，將細胞懸浮于400 μL PBS中，2 h內(nèi)上流式細胞儀進行分析[6].

2.5 BALF中白細胞分類計數(shù)

將小鼠眼球取血后，立即收集支氣管肺泡灌洗液， “V”型口剪開氣管，緩慢注入0.8 mL冰冷PBS，反復回抽3次，離心，收集上清液，加入1 mL PBS重懸細胞，用于細胞計數(shù)，并調(diào)整到1.0×105cell/mL，瑞氏-吉姆薩染色，計數(shù)[7].

2.6 肺組織病理形態(tài)觀察

小鼠右肺下葉浸泡于4%中性多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋切片，H&E染色[8].

2.7 氣道阻力測定

對最后一次滴鼻激發(fā)24 h后的各組小鼠氣道阻力進行測定[1]，麻醉 后小鼠仰面固定， “V”形切口剪開氣管，氣管插管，棉線固定氣管，并連接到呼吸機，常規(guī)機械通氣后，測量肺功能. 待小鼠呼吸基線穩(wěn)定后，依次霧化遞增濃度的30 μL乙酰膽堿溶液(0、3.125、12.5、25、50 mg/mL),霧化液體通過氣管插管進入呼吸系統(tǒng)，測定氣道阻力[6].

2.8 血清中IgE和OVA特異性IgE、血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量測定以及BALF中細胞因子含量的測定

定量夾心酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定血清中IgE和OVA-IgE以及每組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13的含量[9].ELISA試劑盒測定每組小鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的含量.

2.9 統(tǒng)計學分析

3 實驗結(jié)果

3.1 三種證型對哮喘小鼠體重及肺系數(shù)的影響

從造模第15天開始(圖1)，四組模型小鼠的體重均出現(xiàn)下降，造模結(jié)束后，三種證型哮喘組較單純哮喘組小鼠的體重下降更明顯(P<0.05)，表明三種虛證會導致哮喘小鼠的體重減輕，且肺脾氣虛證哮喘小鼠體重較另外兩組病證小鼠體重下降更明顯，進一步說明三種證型哮喘小鼠模型復制初步成功；同時，與空白組相比(圖2)，四組模型小鼠肺重量系數(shù)顯著上升(P<0.01)，且肺氣虛證哮喘組較單純哮喘組肺重量系數(shù)上升明顯(P<0.05)，說明哮喘的發(fā)作會引起肺部腫脹，且虛證會影響哮喘小鼠肺部腫脹狀態(tài).

圖1 小鼠體重

圖2 肺系數(shù)

3.2 三種證型對哮喘小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟質(zhì)量變化及淋巴細胞增殖功能亦從一定程度上反應了免疫功能的變化[10]，與空白組相比(圖3).哮喘模型組和肺氣虛哮喘組免疫器官指數(shù)均無差異，沒有統(tǒng)計學意義；脾氣虛哮喘組脾指數(shù)下降(P<0.05)，胸腺指數(shù)無差異；肺脾氣虛哮喘組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均下降(P<0.05). 模型組之間相比，肺脾氣虛哮喘組較哮喘組和肺氣虛哮喘組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均下降(P<0.05)；脾氣虛哮喘組較哮喘組的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均下降(P<0.05). 說明脾氣虛證和肺脾氣虛證對哮喘小鼠的免疫器官指數(shù)有所影響.

圖3 免疫器官指數(shù)

3.3 三種證型對哮喘小鼠脾淋巴細胞增殖功能的影響

與空白組相比(圖4)，除哮喘組外，其他三種虛證哮喘模型由ConA誘導的T淋巴細胞增殖功能顯著下降(P<0.01)；與哮喘組相比，肺脾氣虛哮喘組T淋巴細胞增殖反應顯著下降(P<0.01).與空白組相比(圖5)，脾氣虛哮喘組由LPS誘導的B淋巴細胞增殖功能下降(P<0.05)，肺脾氣虛哮喘組B淋巴細胞增殖反應顯著下降(P<0.01). 說明三種證型會影響哮喘小鼠的天然免疫功能，肺脾氣虛型的影響更顯著.

圖4 T淋巴細胞增殖

圖5 B淋巴細胞增殖Fig. 5 Proliferation of B Lymphocytes n=6)

3.4 三種證型對哮喘小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響

T細胞亞群是支氣管哮喘發(fā)病機制中的主要調(diào)節(jié)細胞[10-11]，流式細胞術(shù)分析脾臟組織中免疫細胞亞型的表達(表1,圖6)，與空白對照組相比，除哮喘組外，三種病證模型組中CD3+、CD4+占比減少(P<0.05),CD8+比例和CD4/CD8比值無顯著性差異；與哮喘組相比，脾氣虛哮喘組和肺脾氣虛哮喘組中CD3+、CD4+比例下降(P<0.05),CD8+比例和CD4/CD8比值無顯著性差異；肺脾氣虛哮喘組CD3+占比低于另外兩組證候哮喘模型(P<0.05). 說明三種證型會不同程度影響哮喘小鼠的特異性免疫功能.

表1 脾臟T淋巴細胞亞群中CD3、CD4、CD8、CD4/CD8的占比Tab.1 The proportions of CD3、CD4、CD8、CD4/CD8 in splenic T Lymphocyte subsets n=3)

圖6 脾臟T淋巴細胞亞群中CD3、CD4、CD8、CD4/CD8的占比Fig.6 Proportion of CD3, CD4, CD8, CD4/CD8 in splenic T lymphocyte subsets

3.5 三種證型對哮喘小鼠氣道炎癥的影響

致敏小鼠經(jīng)OVA抗原多次攻擊激發(fā)后，BALF中白細胞總數(shù)增加，以嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及巨噬細胞為主，說明出現(xiàn)明顯的氣道炎癥[12]. 如圖7所示，與空白對照組相比，除脾虛哮喘組外，單純哮喘組和其他兩種病證模型組白細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞數(shù)目顯著增加(P<0.01)；模型組之間相比，肺脾氣虛哮喘模型組較單純哮喘組和脾氣虛哮喘組的白細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)，巨噬細胞、淋巴細胞無顯著性差異(表2). 說明三種虛證會加重炎性細胞對哮喘小鼠氣道上皮組織的浸潤，且肺脾氣虛型對哮喘小鼠氣道炎癥的影響更為嚴重.

表2 三種證型對哮喘小鼠BALF中白細胞分類計數(shù)的影響 Tab. 2 The effects of three types of syndromes on the classification and count of white blood cells in BALF of asthmatic

圖7 BALF中白細胞分類計數(shù) Fig.7 Classification of white blood cell counts in

組織學評估顯示，與空白對照組相比，其他模型組經(jīng)OVA刺激后引起明顯的氣道炎癥征象，并伴有明顯的炎性細胞浸潤和支氣管壁增生.如圖8所示，肺脾氣虛哮喘模型組較其他三組模型組，支氣管周圍區(qū)域炎性細胞的浸潤更加明顯.

圖8 三種證型對哮喘小鼠肺組織病理的影響Fig.8 The influences of three types of syndromes on lung tissue pathology in asthmatic mice(a)空白對照組；(b)哮喘組；(c)脾氣虛哮喘組；(d)肺氣虛哮喘組；(e)肺脾氣虛哮喘組

3.6 三種證型對哮喘小鼠氣道阻力的影響

用Rrs值的變化來反應支氣管哮喘小鼠氣道高反應性[13]. 如圖9所示，乙酰膽堿的濃度為0 mg/mL時，各組小鼠Rrs基礎(chǔ)值相當，與空白組相比，各模型組小鼠Rrs值隨吸入乙酰膽堿的濃度的增加而增加，乙酰膽堿的濃度為25、50 mg/mL時，模型組的Rrs值升高(P<0.05)；模型組間相比，乙酰膽堿濃度為50 mg/mL,肺脾氣虛型哮喘小鼠Rrs值高于單純哮喘組和脾氣虛哮喘組(P<0.05). 結(jié)果表明:肺脾氣虛證在活體水平更大程度地增加了Ach引起的小鼠氣道平滑肌收縮.

圖9 小鼠氣道阻力的測定Fig.9 Determination of airway resistance of n=6)

3.7 三種證型對哮喘小鼠血清中IgE和OVA特異性IgE以及BALF中細胞因子水平的影響

為了建立三種證型是否對哮喘小鼠在氣道炎癥中存在其他可能的作用機制，通過檢測BALF中Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-13以及血清中IgE和OVA特異性IgE水平. 如圖10所示，與空白組相比，各組模型組小鼠血清中總IgE和OVA-IgE以及BALF中細胞因子IL-4、IL-5、IL-13的濃度明顯升高(P<0.01)；模型之間相比，肺脾氣虛型哮喘組較單純哮喘組和肺氣虛型哮喘組血清中總IgE及OVA-IgE水平上升(P<0.05)，表明三種證型對哮喘小鼠氣道炎癥具有不同程度的影響.

圖10 小鼠血清中IgE和OVA-IgE和BALF中IL-5、IL-4、IL-13的含量(ˉ Fig.10 The contents of IL-5, IL-4 and IL-13 in serum of IgE and OVA-IgE and BALF in n=6)

3.8 三種證型對哮喘小鼠血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平的影響

與空白組相比(圖11)，單純哮喘組免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平無顯著性差異，脾氣虛哮喘組和肺脾氣虛哮喘組IgG、IgA水平顯著上升(P<0.01)，肺脾氣虛哮喘組IgM水平也具有顯著性差異(P<0.01)；模型組之間相比，肺脾氣虛哮喘組和脾氣虛哮喘組較哮喘組IgA水平下降.(P<0.05)、IgM水平顯著下降(P<0.01). 表明三種證型會影響哮喘小鼠的體液免疫功能，肺脾氣虛型較其他兩種證型更為明顯.

圖11 小鼠血清中IgA、IgG、IgM的含量 Fig.11 The contents of IgA, IgG and IgM in the serum of n=6)

4 討論

胸腺和脾臟是主要的免疫器官[14]. 脾臟內(nèi)含有大量的T淋巴細胞和由骨髓干細胞發(fā)育而來的B細胞[10]. LPS是一種非胸腺依賴性抗原，可直接刺激B淋巴細胞增殖. ConA屬于一種有絲分裂原，可刺激靜止的T淋巴細胞增殖活化，T淋巴細胞活化后，產(chǎn)生相應的免疫應答過程[10]. 在本實驗研究中，模型構(gòu)建成功后，脾氣虛與肺脾氣虛會導致哮喘小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、由ConA刺激的T淋巴細胞增殖、LPS刺激的B淋巴細胞增殖功能明顯下降. 這表明脾氣虛、肺脾氣虛證候影響哮喘小鼠非特異性免疫功能.

T細胞亞群是支氣管哮喘發(fā)病機制中的主要調(diào)節(jié)細胞，根據(jù)T細胞表面CD分子表達的不同，可分為兩大表型，即為CD4+和CD8+細胞，CD4+細胞可在不同種類、劑量抗原的刺激下分化為Th1、Th2細胞，CD3+分子的功能是轉(zhuǎn)導T細胞抗原受體識別抗原所產(chǎn)生的活化信號[15]，T細胞亞群CD3+、CD4+分子表達減少，表明特異性免疫功能下降. 本研究的脾氣虛哮喘組和肺脾氣虛哮喘組CD3+、CD4+占比低于單純哮喘組,表明三種證型會不同程度地影響哮喘小鼠特異性免疫功能. B淋巴細胞介導的體液免疫應答增殖分化出多種免疫球蛋白. 觀察到肺脾氣虛證導致哮喘小鼠體內(nèi)B細胞介導的體液免疫應答IgG、IgA、IgM水平下降明顯，表明肺氣虛累及于脾時致肺脾氣虛哮喘小鼠之體液免疫功能較其他兩組證型哮喘小鼠體液免疫功能下降.

氣道高反應性是哮喘的重要臨床表現(xiàn)，也是判斷哮喘模型是否構(gòu)建成功的重要指標[16]. 實驗結(jié)果顯示，各模型組隨吸入Ach濃度梯度增加而升高；肺脾氣虛證促使哮喘小鼠在Ach刺激下，氣道阻力增加顯著高于其他單因素證型哮喘模型組.

氣道炎癥與Th2細胞的增加有關(guān)，它們分泌IL-4、IL- 5、IL-13，最終增加IgE和嗜酸性粒細胞炎癥的產(chǎn)生. 嗜酸性粒細胞是哮喘氣道慢性炎癥的關(guān)鍵效應細胞. 目前，IL-13是治療過敏性哮喘的重要治療靶點[8]. IL-4、IL-5和IL-13在OVA誘導的各證型哮喘小鼠中的濃度升高；肺脾氣虛證導致哮喘小鼠血清中總IgE、OVA-IgE濃度高于其他單因素證候模型組. 表明三種虛證對哮喘小鼠的氣道炎癥有不同程度的影響.

本研究評價和探討三種證型對OVA誘導的哮喘小鼠模型的影響.通過免疫、炎癥、肺功能等相關(guān)的效應指標變化進行病證結(jié)合關(guān)聯(lián)分析， 加入脾氣虛累積于肺時是否會導致肺脾氣虛各項指標的變化，探討脾肺之間的關(guān)聯(lián)性.結(jié)果表明:脾氣虛累及于肺氣虛致肺脾氣虛哮喘小鼠較單因素證侯哮喘小鼠的非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫功能更紊亂，從而造成哮喘小鼠氣道高反應，增加氣道炎癥和肺損傷更顯著,說明三種證型對哮喘小鼠特異性/非特異性免疫功能及氣道炎癥有影響且具有一定的關(guān)聯(lián)性.